专利名称：稀有人参皂甙ih-901的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种稀有人参皂甙IH-901的制备方法。
背景技术：
现代药理研究表明，人参发挥抗肿瘤作用的最终活性物质不是天然人 参皂甙如人参皂甙Rth、 Rb2、 Rb3、 Rc、 Rd等，而是其一系列肠道菌群的作 用下所产生的代谢物，即天然人参皂甙只是抗肿瘤天然前体药物，人参皂 戒肠道菌代谢产物才是抗肺瘤活性本质或活性实体。人参皂甙的代谢研究 发现，其中，人参皂甙肠道菌代谢物20-0-P-D-吡喃葡萄糖苷-20(S)-原 人参二醇(简称稀有人参急戒IH-901， Ml或Compound K)是天然二醇组人 参皂戒如Rbi、 Rth等口服后由肠道细菌所分泌的糖苷酶选择性水解C-3位糖 配体所得的最终主要代谢产物，是人参皂甙抗肿瘤作用的最终主要活性形 式之一。而且大量有关天然人参皂甙与IH-901的代谢关系研究不断证实， 一些含量较高、极性较大的二醇组皂甙均能通过肠道菌代谢最终降解为 IH-901被机体吸收。
稀有人参皂甙IH-901属二醇组皂甙，在天然的人参中不存在，是其他 二醇组人参皂戒在人肠道内的降解代谢产物。近年来诸多研究表明人参的 许多生物学活性都是由该化合物引起的，特别是在抗肿瘤、抗衰老，抗炎 症等方面都体现良好的药效。目前其研究的热点集中体现在IH-901化合物 的大规模制备和生物活性深入研究两个方面，我国对该化合物的研究尚处 于起步阶段，未见系统研究报道。由于IH-901为体内代谢产物，故无毒， 研究表明具有广泛的抗肿瘤活性，迄今，稀有人参皂甙IH-901的临床价值 已引起各国高度重视，并成为各大制药公司研究的热点。
IH-901将是一个很有前途的抗肺瘤药物，未来将相继以保健品及国家 新药形式陆续上市，稀有人参皂甙项目在21世纪生物医药及生物健康品具 有前瞻性、稀缺性以及需求巨大性，国际国内市场对其需求有着巨大的潜 力。目前稀有人参皂甙IH-901由于其价格昂贵，市场上含量在99%以上价格达1000万元/公斤，而人参皂戒仅800元/公斤，难以被胂瘤病人使用，因此 稀有人参皂甙IH-901的生产方法备受关注。
由于人参皂甙四环三萜母核结构上3位和20位糖苷键的特异性，决定 了 IH-901只能由温和的生物转化方法获得，而常用的酸或^5威水解方法是行 不通的。目前，生物转化方法通常包括微生物发酵和酶转化两种主要方法。
微生物发酵法制备所用的微生物主要是肠道厌氧菌，而其他微生物的 研究比较少。肠道厌氧菌发酵最初是以人排泄物中的总菌物进行发酵，后 来研究筛选单一肠道菌来转化，如采用肠道乳酸菌转化二醇型皂苷制备CK, 发现运用^//V^^s"er/wz /z /"/yz 〃/Z7 KK-1和A c力oerKK-2共发酵转4匕 Rbl时效果最好，转化率达到41%左右，但肠道菌多为厌氧菌，培养条件苛 刻，培养基成本高。另有研究筛选原始土壤微生物来降解人参皂苷，但酶 解能力低下，目的产物收率不高，须通过优化发酵条件和菌种诱变等方法 来提高转化能力。中科院大连化学物理研究所申请发明专利用黑曲霉酶解 人参皂苷制备稀有低极性人参皂苷的方法，所用黑曲霉菌是将各种来源的 黑曲霉菌转入含有人参皂甙的培养基中，经传代培养、驯化、筛选得到的 能够酵解产生稀有人参皂戒及戒元的菌抹。目前在微生物发酵制备方面并 没有适用大规3莫制备的成熟的方法或工艺。
而参照肠内菌代谢原理，酶转化法制备是利用酶作为催化剂实现化学 转化的过程，是酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应， 酶及酶体系能将许多天然化合物转化为具有较高生物活性的物质，酶法转 化法的优点在于流程短、专一性强、产物易分离纯化。用于制备的酶大部 分是工业酶制剂， 一般采用具有酶解糖苷键的酶，如柚皮苷酶、果胶酶、 纤维素酶、蜗牛酶以及乳糖酶等。国内学者利用P-葡萄糖香酶对三七茎叶 总皂苷进行转化，取得较好的转化效果。也有从具有转化活性的菌林中分 离专一性更强的转化酶，如从食用微生物5/77cTo^cfer/咖sp. Int57和 ^ 77cto&"er/湖sp. SJ32中提取的粗酶，可转化Rb2和Rc成Rd和F"进而 转化成终产物人参皂戒IH-901,从人肠道菌/^ o^ &c"r/i/迈K-60分离纯 化的葡萄糖苷酶，亦能直接转化Rth生成稀有人参皂戒CK。但这些方法也存 在酶的用量大、来源困难、底物成分较高等缺点，所以上述方法也尚无法 应用于工业化生产。酶转化法选择性强、 一般产物也便于提取分离，工艺研究控制方便，该制备法更有利于规模化制备，其研究关键在于获得廉价 而有高效专 一 的工业酶制剂。
随着天然人参皂戒类化合物肠道代谢研究的深入，研究表明肠道菌代 谢降解人参皂武其作用的并不是菌体本身，而是肠道菌分泌的生物酶，代 谢的实质是酶对天然人参皂甙的结构进行了生物修饰或改造，而生成直接
体现生物活性的代谢产物。参照肠道菌代谢机理，目前IH-901制备方法主 要有微生物发酵法和酶法转化法两种方法。微生物发酵法由于发酵的培养 条件苛刻，培养成本高，而且发酵也需要寻找到具高效的菌体，尚无法满 足工业化生产需要。生物的方法酶解转化制备，由于酶解反应温和，条件 易于控制，加之酶的选择性、专属性，只作用于特殊结构的固定位置，对 其它的结构和空间构型没有影响，而且人参皂戒20位的糖苷4建在酸性介质 中的稳定性低于3位糖苷键，并且空间阻碍作用使得酶水解20位的糖苷键活 力很低，因此，酶转化法成为目前采用的主要制备方法。实现恥溪化生产 的体外酶法转化制备关键是筛选到来源广泛、成本低、高效专一性的生物 酶，以及利用廉价的酶转化原材料，建立可适用于工业化工艺。目前据研 究才艮道，国内外有酶法转化中国人参、高丽参、西洋参或三七等为稀有人 参皂甙IH-901的工艺研究和文献报道，但是这些方法大多存在酶的来源困 难、原料成本高等缺点，尚无法应用于规^莫化制备或工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种以单一皂甙为底物，酶的来源丰富、原料成 本低的稀有人参皂戒IH-901的制备方法。
本发明的技术方案是这样的稀有人参皂甙IH-901的制备方法，通过 如下方案实现将l单位质量单体人参皂甙Rbl、 0. 5-l单位质量国产的蜗 牛酶和1单位体积pH=3-5的緩沖溶液混合均匀，于30-45。C下保温8-14小 时之后，^使可将单体人参皂戒Rbl完全转化为产物稀有人参皂武IH-901。
上述緩沖溶液为磷酸柠檬S吏緩沖溶液或醋酸水溶液。
采用上述方案后，本发明的稀有人参皂甙IH-901的制备方法，以单体 人参皂甙Rbl为反应底物，反应的酶为廉价的国产蜗牛酶，反应后的体系 中除緩沖体系的成分外，反应底物单体人参皂戒Rbl被完全转化为产物稀有人参皂甙IH-901,后续的产物提取非常简单。与现有技术相比，本发明 的制备方法，由于采用单一底物和廉^f介的国产蜗牛酶，具有酶的来源丰富、 原料成本低，以及反应结束后体系中成分简单有利于产物提取等优点。
具体实施例方式
实施例一
本发明的稀有人参皂甙IH-901的制备方法，通过如下方案实现
① 精确吸取100微升单体人参皂甙Rbl (含1毫克单体人参皂甙Rbl ) 于无菌的反应管内，加入1毫克国产的蜗牛酶和1毫升pH=3的磷酸柠檬酸 緩沖溶液；
② 将单体人参皂戒Rbl、蜗牛酶和磷酸柠檬酸緩冲溶液混合均匀，于 30。C恒温水浴14小时，反应底物单体人参皂甙Rbl被完全转化为产物稀有 人参皂甙IH-901,反应结束后的体系中除緩沖体系的成分外，只剩下产物 稀有人参皂甙IH-901。
实施例二
本发明的稀有人参皂甙IH-901的制备方法，通过如下方案实现
① 精确吸取1000微升单体人参皂甙Rbl(含10毫克单体人参皂甙Rbl ) 于无菌的反应管内，加入5毫克国产的蜗牛酶和10毫升pH=4的醋酸水溶 液^
② 将单体人参急戒Rbl、蜗牛酶和醋酸水溶液混合均匀，于37。C恒温 水浴11小时，反应底物单体人参皂戒Rbl ;故完全转化为产物稀有人参皂甙 IH-901,反应结束后的体系中除緩冲体系的成分外，只剩下产物稀有人参 皂戒IH-901。
实施例三
本发明的稀有人参皂甙IH-901的制备方法，通过如下方案实现
①精确吸取100微升单体人参皂甙Rbl (含1毫克单体人参皂甙Rbl)
于无菌的反应管内，加入0. 6毫克国产的蜗牛酶和1毫升pH=5的磷酸^f宁檬
酸緩冲溶液；
6②将单体人参急戒Rbl、蜗牛酶和磷酸柠檬酸緩冲溶液混合均匀，于 45。C恒温水浴8小时，反应底物单体人参皂甙Rbl纟皮完全转化为产物稀有 人参皂甙IH-901,反应结束后的体系中除緩冲体系的成分外，只剩下产物 稀有人参皂戒IH-901。
提取与鉴定过程
① 终止反应，加入反应物1/2体积的正丁醇萃取两次，合并正丁醇层；
② 用毛细管吸取少量，点样于珪胶板上(使用前在110。C下活化90分 钟)，冷风吹干；
③ 置于盛有展开剂的烧杯内，以IH-901标准品和Rbl标准品为对照， 以氯仿曱醇7jc=65: 35: 10为展开剂展开；
④ 待展开剂的前沿离硅胶板顶部l厘米左右，取出，挥干溶剂，均匀 喷10%石克酸一 乙醇溶液的显色剂；
在105。C加热IO分钟显色鉴定。 相关试剂的配制方法
1、 展开剂
氯仿曱醇水=65: 35: 10 (下层) 正丁醇乙酸乙酯水=4: 1: 5 (上层) 氯仿乙酸乙酯甲醇水=15: 40: 20: IO(下层) 上层、下层是指溶液配制混合均匀静置后分层，展开剂使用的是上层 或下层，其余的弃去。
2、 石克酸一乙醇显色剂 石克酸乙醇=1: 10。
3、 Rbl标准品溶液
20毫克Rbl，加入10微升DMS0(二曱基亚砜)，加乙醇至2毫升，_20 "C冷冻保存。
4、 IH-901标准品溶液
20毫克IH-901,加入10微升DMSO (二曱基亚砜)，加乙醇至2毫升， 于-2(TC的温度下冷冻保存。
5、 磷酸柠檬酸緩冲液pH0. 2mol/L0. lmol/L0. 2mol/L0. lmol/L
Na2HP04柠檬酸Na2HP04柠檬酸
(毫升)(毫升)(毫升)(毫升)
2. 20. 4010. 605. 210. 729. 28
2. 41. 2418. 765. 411. 158. 85
2. 62. 1817. 825. 611. 608.40
2. 83. 1716. 835. 812. 097. 91
3. 04. 1115. 896. 012. 637. 37
3. 24. 9415. 066.213. 226. 78
3. 45. 7014. 306. 413. 856. 15
3. 66. 4413. 566.614. 555.45
3. 87. 1012. 906. 815. 454. 55
4. 07. 7112. 297. 016. 473. 53
4. 28. 2811. 727. 217. 392. 61
4. 48. 8211. 187.418. 171. 83
4. 69. 3510. 657.618. 731. 27
4. 89. 8610. 147.819. 150. 85
5. 010. 309. 708. 019. 450. 55
Na2HP04分子量=14.98, 0.2 mol/L溶液为28. 40克/升。 Na2,-2H20分子量=178. 05， 0. 2 mol/L溶液含35. 01克/升。 C4H207 H20分子量=210.14， 0.1 mol/L溶液为21. 01克/升。
权利要求
1、稀有人参皂甙IH-901的制备方法，其特征在于通过如下方案实现将1单位质量单体人参皂甙Rb1、0.5-1单位质量国产的蜗牛酶和1单位体积pH＝3-5的缓冲溶液混合均匀，于30-45℃下保温8-14小时之后，便可将单体人参皂甙Rb1完全转化为产物稀有人参皂甙IH-901。
2、 根据权利要求1所述的稀有人参皂戒IH-901的制备方法，其特征 在于上述緩冲溶液为磷酸柠檬酸緩冲溶液或醋酸水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种稀有人参皂甙IH-901的制备方法，通过如下方案实现将1单位质量单体人参皂甙Rb1、0.5-1单位质量国产的蜗牛酶和1单位体积pH＝3-5的缓冲溶液混合均匀，于30-45℃下保温8-14小时之后，便可将单体人参皂甙Rb1完全转化为产物稀有人参皂甙IH-901。本发明以单体人参皂甙Rb1为反应底物，反应的酶为廉价的国产蜗牛酶，反应后的体系中除缓冲体系的成分外，反应底物单体人参皂甙Rb1被完全转化为产物稀有人参皂甙IH-901，后续的产物提取非常简单。与现有技术相比，本发明的制备方法，由于采用单一底物和廉价的国产蜗牛酶，具有酶的来源丰富、原料成本低，以及反应结束后体系中成分简单有利于产物提取等优点。
文档编号C12P33/20GK101671714SQ20091019315
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者毅 林 申请人:华侨大学