专利名称：：一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法及发酵产品的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物制备
技术领域：
，涉及一种微生物的制备方法，具体涉及一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法。
背景技术：
：枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物之一。枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞成干状，菌落粗糙，不透明，污白色或微带黄色。此菌用途很广，可用于生产a-淀粉酶、蛋白酶、P-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。目前国内众多发酵(芽孢杆菌微生物制剂类)企业的产品存在发酵生产菌含量较低的问题，一般只有2050X108CFU/g，大大影响了产品的成本及质量。为此，采取措施提高芽孢杆菌产品发酵生产的活菌含量、保持菌体的高活性是十分必要的。目前未见提高芽孢杆菌产品发酵生产的活菌含量、保持菌体的高活性的相关技术报道。
发明内容本发明的目的是针对现有现有微生物发酵技术的不足造成芽孢杆菌微生物制剂类产品菌含量不高的问题，提供一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，以提高产品活菌的含量、保持菌体的高活性。本发明的另一个目的是提供采用所述发酵方法制备得到的高活性的枯草芽孢杆菌产品。本发明的目的通过下述技术方案予以实现提供一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，将枯草芽孢杆菌原始出发菌株经复活和扩大培养后，接种入发酵培养基中，收集发酵培养所得培养液。所述枯草芽孢杆菌原始出发菌种可采用市购的枯草芽孢杆菌原始出发菌种为枯草杆菌属细菌(Bacillussubtilis)产品，也可以是从植物根系和根系土壤，按照现有常规稀释平板分离法选育获得的枯草芽孢杆菌菌株。所述方法包括以下步骤(1)原始出发菌株经复活和扩大培养得到的菌液为发酵菌种；往步骤(1)所得发酵菌种中添加甘油，放置于-18-20°〇温度下保存备用；甘油的添加量优选按照发酵菌种体积量的1215%确定。(2)将上述添加了甘油的发酵菌种接种入发酵培养基，分次添加泡敌和豆油培养后添加硫酸钙溶液，进行发酵培养，当还原糖降至0.600.67g/L、氨态氮降至2021g/L时，终止发酵。步骤(1)所述原始出发菌株的复活和扩大培养包括以下步骤(A)从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于3637t:温度下培养1216小时培养得单细胞菌落；(B)挑出步骤(A)所述单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于3637°C温度下培养1216小时，长出菌体；(C)将步骤(B)所述菌体以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，摇床培养至0D6。。=0.70.9时停止培养;所述摇床培养是在3637。C温度、150170rpm条件下培养1620小时。(D)将步骤(C)所得菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于3637t:温度下培养56小时，长出菌体；(E)从步骤(D)所述菌体中挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，摇床培养至0D6。。=1.01.2，停止培养，所得菌液为发酵菌种。所述摇床培养是在3637。C温度下、150170rpm条件下培养1620小时。所述菌种液体培养基组成为按照重量百分比计，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化钠、0.30.5%的蛋白胨溶于水中；所述种子复壮液体培养基组成为按照重量百分比计，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化钠、0.20.5%的蛋白胨、0.50.6%豆粉、1.01.2%低聚异麦芽糖、0.81.0%的大豆低聚糖，该配方主要是为了有效提高枯草芽孢杆菌的菌种的活性而设计的。在菌种液体培养基中加入1.52%琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在菌种液体培养基中加入1.52%琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在菌种液体培养基中加入1.52%琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在种子复壮液体培养基中加入1.52%琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；上述步骤(2)具体可采用5001000升发酵罐，内盛350700升发酵培养基，将添加了甘油的发酵菌种以1.01.2%接种量接入发酵培养基，分别在培养68h、1012h、1618h、2426h时按照发酵液重量的0.40.5%和0.81%添加泡敌和豆油，在培养1214h时，添加1822%CaS04溶液至CaS04的浓度为68mg/1;所述的发酵培养基的组成是按照重量百分比计，l1.1%糖蜜、0.91.0%玉米淀粉、0.050.06%K2HP04、0.050.06%KH2P04、0.180.2%NaC1、0.80.9X10—6MnCl2、l.51.6%鱼粉和1.41.5%豆粉，调PH值为6.87.2。在上述发酵培养过程中，搅拌转速优选为300320rpm，通风量优选为1:0.81:lvvm，控制D0在80100%;在发酵进入810h时，调整搅拌转速至350400rpm，通风量l:0.50.6vvm，以保证D0值在控制在80100X范围内；在发酵进入1618h时，调整搅拌转速至300330rpm，通风量1:1.01.lvvm，以保证DO值在控制在80100%范围内;当还原糖降至0.600.67g/L、氨态氮降至2021g/L时，终止发酵。收集发酵培养所得培养液得高活性枯草芽孢杆菌产品。本发明具有以下有益效果本发明将枯草芽孢菌株经斜面活化及种子的复壮后，得到活性高的发酵种子，再经独特设计发酵工艺发酵，非常有利于提高活菌含量及菌体的活性。因此经本发明处理的菌种经发酵可达到3X10"CFU/ml，能够显著提高产品活菌的含量、保持菌体的高活性。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。实施例1本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌(Bacillussubtilis)1株，从植物根系和根系土壤按照常规稀释平板分离法选育获得。芽孢杆菌产品的制备包括下述步骤(1)菌种液体培养基的配制5克葡萄糖、5克氯化钠、3克蛋白胨和1升水(pH值为6.5);配制三份;种子复壮液体培养基的配制5克葡萄糖、5克氯化钠、3克蛋白胨、6克豆粉、12克食用级低聚异麦芽糖、10克食用级大豆低聚糖和1升水(pH值为6.5)，配制一份；在一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在另一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在第三份菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基；在上述种子复壮液体培养基中加入2%琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；(2)用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37t:温度下培养16小时；(3)待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37t:温度下培养16小时；(4)将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于37t:温度下，170rpm，摇床培养20小时，每小时测定一次0D6。。直到0D6。。=0.9，停止培养；(5)将步骤(4)中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于37t:温度下培养6小时；(6)从步骤(5)的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于37t:温度下，170rpm，摇床培养20小时后，直到0D6。。=1.2，停止培养，作为发酵菌种；(7)步骤(6)中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的15X的甘油，放置于-2(TC温度下保存。(8)发酵培养在1000升发酵罐内，将发酵菌种以1.2%接种量接入700升发酵培养基，分别在培养8h、12h、18h、26h时添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，发酵液重量的1%添加豆油，在培养至13h时，添加20%CaS04至CaS04的浓度为7mg/l;在发酵培养过程中，搅拌转速设定为320rpm、通风量设定为1:lvvm，控制DO在90%;在发酵进入10h时，调整搅拌转速至400rpm和通风量至1:0.6vvm，以保证D0值在控制在80100%范围内；在发酵进入18h时，调整搅拌转速至330rpm和通风量至1:1.lvvm，以保证D0值在控制在80100%范围内；当还原糖降至0.67g/L和氨态氮降至21g/L(3，5_二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法)时，终止发酵得发酵产品。实施例2本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌(Bacillussubtilis)1株，从植物根系和根系土壤，按照常规稀释平板分离法选育获得的。芽孢杆菌产品的发酵制备方法包括下述步骤(1)菌种液体培养基的配制3克葡萄糖、3克氯化钠、3克蛋白胨和1升水(pH值为6.5);配制三份;种子复壮液体培养基的配制3克葡萄糖、3克氯化钠、5克蛋白胨、5克豆粉、10克食用级低聚异麦芽糖、8克食用级大豆低聚糖和1升水(pH值为6.5)，配制一份；在一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在另一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在第三份菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基；在上述种子复壮液体培养基中加入2%琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；(2)用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36t:温度下培养15小时；(3)待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于36t:温度下培养15小时；(4)将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于36。C温度下，160rpm，摇床培养18小时，每小时测定一次0D6。。直到0D6。。=0.8，停止培养；(5)将步骤(4)中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于36t:温度下培养5小时；(6)从步骤(5)的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于36t:温度下，160rpm，摇床培养18小时后，直到0D6。。=1.O，停止培养，作为发酵菌种；(7)步骤(6)中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的12%的甘油，放置于-18°〇温度下保存。(8)发酵培养在1000升发酵罐内，将发酵菌种以1.0%接种量接入350升发酵培养基，分别在培养6h、10h、16h、24h小时时添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，按照发酵液重量的1%添加豆油，在培养至12h时，添加19%CaS04至CaS04的浓度8mg/l;在发酵培养过程中，搅拌转速设定为300rpm、通风量设定为1:0.9vvm，控制DO在100%;在发酵进入8h时，调整搅拌转速至350rpm和通风量至1:0.5vvm，以保证DO值在控制在80100%范围内；在发酵进入16h时，调整搅拌转速至300rpm和通风量至1:lvvm，以保证D0值在控制在80100%范围内；当还原糖降至0.65g/L和氨态氮降至20g/L(3，5_二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法)时，终止发酵得发酵产品。实施例3本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌(Bacillussubtilis)1株，从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买的枯草芽孢杆菌，编号GIM1.131。芽孢杆菌产品的发酵制备方法包括下述步骤(1)菌种液体培养基的配制4克葡萄糖、3.5克氯化钠、4克蛋白胨和1升水(pH值为7);配制三份；种子复壮液体培养基的配制4克葡萄糖、4克氯化钠、2克蛋白胨、5.5克豆粉、11克食用级低聚异麦芽糖、8.5克食用级大豆低聚糖和1升水(pH值为7)，配制一份；在一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在另一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在第三份菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基；在上述种子复壮液体培养基中加入2%琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；(2)用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36.5t:温度下培养12小时；(3)待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于36.5t:温度下培养12小时；(4)将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于36.5t:温度下，150rpm，摇床培养16小时左右，每小时测定一次0D6。。直到0D6。。=0.7，停止培养；(5)将步骤(4)中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于36.5。C温度下培养5.5小时；(6)从步骤(5)的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于36.5t:温度下，150rpm，摇床培养16小时后，直到0D6。。=1.1，停止培养，作为发酵菌种；(7)步骤(6)中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的13%的甘油，放置于-19°〇温度下保存。(8)发酵培养在1000升发酵罐内，将发酵菌种以1.1%接种量接入500升发酵培养基，分别在培养7h、llh、16h、24h小时时添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，按照发酵液重量的1%添加豆油，在培养至13h时，添加20%CaS04至CaS04的浓度6mg/l;在发酵培养过程中，搅拌转速设定为310rpm、通风量设定为1:0.8vvm，控制DO8在80X;在发酵进入8h时，调整转速至380rpm和通风量至l:0.55vvm，以保证DO值在控制在80100%范围内；在发酵进入16.5h时，调整转速至320rpm和通风量至1:1.05vvm，以保证DO值在控制在80100%范围内；当还原糖降至0.60g/L和氨态氮降至20.5g/L(3，5_二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法)时，终止发酵得发酵产品。实施例4本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌(Bacillussubtilis)1株，从植物根系和根系土壤，按照常规稀释平板分离法选育获得的。芽孢杆菌产品的发酵制备方法包括下述步骤(1)菌种液体培养基的配制5克葡萄糖、5克氯化钠、4克蛋白胨和1升水(pH值为7);配制三份；种子复壮液体培养基的配制4克葡萄糖、4克氯化钠、3克蛋白胨、6克豆粉、12克食用级低聚异麦芽糖、9克食用级大豆低聚糖和1升水(pH值为7)，配制一份；在一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在另一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在第三份菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基；在上述种子复壮液体培养基中加入2%琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；(2)用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37t:温度下培养15小时；(3)待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37t:温度下培养15小时；(4)将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于37t:温度下，160rpm，摇床培养18小时左右，每小时测定一次0D6。。直到0D6。。=0.9，停止培养；(5)将步骤(4)中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于37t:温度下培养5小时；(6)从步骤(5)的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于37t:温度下，160rpm，摇床培养18小时后，直到0D6。。=1.2，停止培养，作为发酵菌种；(7)步骤(6)中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的15X的甘油，放置于-2(TC温度下保存。(8)发酵培养在1000升发酵罐内，将发酵菌种以1.2%接种量接入600升发酵培养基，分别在培养8h、10h、17h、25h小时时添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，按照发酵液重量的1%添加豆油，在培养至13h时，添加21%CaS04至CaS04的浓度6.5mg/l;在发酵培养过程中，搅拌转速设定为320rpm、通风量设定为1:0.9vvm，控制DO在85%;在发酵进入9h时，调整转速至360rpm和通风量至1:0.6vvm，以保证DO值在控制在80100%范围内；在发酵进入17h时，调整转速至320rpm和通风量至1:lvvm，以保证DO值在控制在80100%范围内；当还原糖降至0.67g/L和氨态氮降至20g/L(3，5_二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法)时，终止发酵得发酵产品。实施例5产品品质测定从植物根系和根系土壤，按照常规稀释平板分离法选育获得的枯草杆菌属细菌(Bacillussubtilis)菌种和现有从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买的枯草芽孢杆菌1株，分别采用本发明实施例14所述方法和常规方法进行发酵处理(斜面活化、摇床培养、发酵罐培养等步骤处理)，发酵后的产品采用稀释平板计数方法测定产品活菌含量，测定结果见表l所示。表1枯草芽胞杆菌发酵的效果对比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表1可知，经本发明发酵方法处理的产品，活菌含量大幅度提高，其活菌含量可以达到3X10"8X10"CFU/ml。综上所述，利用本发明技术能大幅度提高单位体积的发酵菌含量，这将极有利于降低发酵企业的成本，也能提高单位体积发酵罐的利用率。权利要求一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于包括以下步骤(1)原始出发菌株经复活和扩大培养得到的菌液为发酵菌种；(2)将步骤(1)所述发酵菌种接种入发酵培养基，分次添加泡敌和豆油培养后添加硫酸钙溶液，进行发酵培养，当还原糖降至0.60～0.67g/L、氨态氮降至20～21g/L时，终止发酵。2.根据权利要求l所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于步骤(1)所述原始出发菌株的复活和扩大培养包括以下步骤(A)从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离培养得单细胞菌落；(B)挑出步骤(A)所述单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，培养出菌体；(C)将步骤(B)所述菌体以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，摇床培养至006。。=0.70.9时停止培养；(D)将步骤(C)所得菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，培养得菌体；(E)从步骤(D)所述菌体中挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，摇床培养至0D6。。=1.01.2，停止培养，所得菌液为发酵菌种。3.根据权利要求2所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于所述菌种液体培养基组成为按照重量百分比计，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化钠、0.30.5%的蛋白胨；所述种子复壮液体培养基组成为按照重量百分比计，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化钠、0.20.5%的蛋白胨、0.50.6%豆粉、1.01.2%低聚异麦芽糖、0.81.0%的大豆低聚糖；所述种子固体斜面培养基、种子固体平板培养基分别是在菌种液体培养基中加入1.52%琼酯于无菌试管或无菌平板中制备得到；所述种子复壮固体斜面培养基是在种子复壮液体培养基中加入1.52%琼脂于无菌试管中制备得到。4.根据权利要求2所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于步骤(C)所述摇床培养是在3637t:温度、150170rpm条件下培养1620小时；步骤(E)所述摇床培养是在3637。C温度、150170rpm条件下培养1620小时。5.根据权利要求l所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于步骤(2)所述发酵菌种接入发酵培养基的接种量为1.01.2%。6.根据权利要求l所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于步骤(2)所述泡敌和豆油分四次添加，分别在培养68h、1012h、1618h、2426h时按照发酵液重量的0.40.5%添加泡敌、按照发酵液重量的0.81%添加豆油。7.根据权利要求l所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于步骤(2)所述硫酸钙溶液的添加是在培养1214h时，添加浓度为1822%的硫酸钙溶液至其浓度为68mg/1。8.根据权利要求l所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于步骤(2)所述发酵培养，初始搅拌转速为300320rpm，通风量为1:0.81:lvvm，控制DO在80100%;在发酵进入810h时，搅拌转速为350400rpm，通风量l:0.50.6vvm，控制D0值在控制在80100%范围内；在发酵进入1618h时，搅拌转速为300330rpm，通风量l:1.01.lvvm，控制D0值在控制在80100%范围内。9.根据权利要求l所述高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法，其特征在于步骤(2)所述发酵培养基的组成是按照重量百分比计，11.1%糖蜜、0.91.0%玉米淀粉、0.05`0.06%K2HP04、0.050.06%KH2P04、0.180.2%NaC1、0.80.9X10_6MnCl2、1.5`1.6%鱼粉和1.41.5%豆粉，调PH值为6.87.2。10.—种权利要求1所述发酵方法制备得到的高活性枯草芽孢杆菌发酵产品。全文摘要本发明公开了一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法及发酵产品。本发明将枯草芽孢菌株经斜面活化及种子的复壮后，得到活性高的发酵种子，再经独特设计发酵工艺发酵，有效提高活菌含量及菌体的活性。经本发明处理的菌种经发酵可达到3×1011CFU/ml，能够显著提高产品活菌的含量、保持菌体的高活性。文档编号C12N1/20GK101696394SQ20091019308公开日2010年4月21日申请日期2009年10月15日优先权日2009年10月15日发明者夏枫耿,张玲华,明飞平申请人:华南农业大学;