专利名称：猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品的制作方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种用传代细胞制备猪瘟、
伪狂犬病二联活疫苗的方法及其制品。
背景技术：
猪瘟(CSF)和伪狂犬病(PR)是危害集约化养猪业的两大重要传染病，在我国猪 群中广泛存在，给养猪业造成巨大的经济损失。免疫接种是猪瘟和伪狂犬病防制的重要 措施。但猪用疫苗品种很多，在实际操作中，多针次、多剂量、多种免疫程序难以合理 安排，既繁琐、费时、费力、增加成本，且容易造成漏种，直接影响免疫效果。采用多 联(或多价)疫苗免疫接种，以达到预防多种传染病的目的。同时，这两种疫病采取的免 疫程序比较接近，这为猪瘟与伪狂犬病二联活疫苗的研制提供了可能。
发明内容
为了达到一次免疫可有效预防和控制CSF与PR两种疫病的发生与流行，减轻免 疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹，相应减少了对猪 群的应激，本发明提供一种用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品。 —种用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，包括如下步骤
(1)用传代细胞培养猪瘟病毒弱毒株和伪狂犬病病毒弱毒株；
(2)收获所述步骤(1)得到的细胞培养毒液； (3)把所述步骤(2)得到的两种细胞培养毒液按一定比例混合，并在混合液中加稳 定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到传代细胞猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗。
所述步骤(1)包括如下步骤 (la)制苗用细胞的传代与培养所述传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传 代，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层； (lb)细胞毒种的繁殖将新鲜脾毒制成病毒悬液，接种至所述步骤(la)中得到 的传代细胞单层，继续培养，每隔4 5日收获换液一次，取二收、三收的细胞培养毒液 作为猪瘟活疫苗生产用毒种；将所述伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤(la)中得到的 传代细胞单层，用细胞维持液继续培养，2 3日后收获细胞培养毒液作为伪狂犬病活疫 苗生产用毒种； (lc)制苗毒液的繁殖猪瘟活疫苗制苗毒液的繁殖取所述步骤(la)中得到的传代细胞单层，弃去所
述细胞生长液，接种所述步骤(lb)中得到的含猪瘟病毒的细胞维持液，继续培养； 伪狂犬病活疫苗制苗毒液的繁殖取所述步骤(la)中得到的传代细胞单层，弃 去所述细胞生长液，接种所述步骤(lb)中得到的含伪狂犬病病毒的细胞维持液，继续培 养；
所述步骤(2)收获所述细胞培养毒液为 将含猪瘟病毒的维持液接种到传代细胞单层后培养，接毒后5日作第一次收获 换液，以后每隔4日收获换液一次，收获的毒液置于-15t:下保存； 将含伪狂犬病毒的维持液接种到传代细胞单层后培养，接毒后2 3日收获细胞
培养毒液，收获的毒液置于-i5t:下保存； 优选地，所述步骤(la)、 (lb)和(lc)中的细胞培养所用的温度为36t:-37t:。
优选地，所述步骤(lb)和(lc)中的接种时的接种量为1% 5%体积百分比的生 产用细胞毒种的维持液。优选地，所述步骤(la)中的细胞生长液为含90X 92X体积百分比的MEM 液、8% 10%体积百分比的犊牛血清和抗菌素，所述细胞生长液的pH值为7.0 7.2。
优选地，所述步骤(lb)和(lc)中的细胞维持液为含95X 98X体积百分比的 MEM液、2% 5%体积百分比的犊牛血清和抗菌素，所述细胞维持液的pH值为7.2 7.4。 优选地，所述传代细胞选自猪睾丸传代细胞ST、猪肾传代细胞PK15和猪肾传 代细胞IBRS-2。 本发明还提供一种所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗，所述疫苗是通过上述的制 备方法得到。 本发明的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，制备过程简单且稳定、易操 作、病毒含量高、批间差异小、质量易控、可显著提高疫苗产量和质量、减少过敏反应 等优点。利用本发明的制备方法得到的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗安全性好、免疫效力 高，对猪瘟、伪狂犬病的强毒攻击具有较好的免疫保护作用。现有技术中免疫接种猪 瘟和伪狂犬病活疫苗，采用分开免疫，多针次、多剂量，既繁琐、费时、费力、增加成 本，又难以合理安排免疫程序，而且猪瘟和伪狂犬病均为免疫抑制病，免疫剂量不合理 会引起相互干忧，且容易造成漏种，直接影响预防效果。用本发明的猪瘟、伪狂犬病二 联活疫苗免疫接种，可减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成 的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激，达到"一针防两病"。 下面将详细介绍本发明的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，以及制备出 的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗。
具体实施例方式
—种用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，包括如下步骤
(1)用传代细胞培养猪瘟病毒弱毒株和伪狂犬病病毒弱毒株；
(2)收获所述步骤(1)得到的细胞培养毒液； (3)把所述步骤(2)得到的两种细胞培养毒液按一定比例混合，并在混合液中加稳 定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到传代细胞猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗。
在本发明的一个具体制备实施例中，所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方 法包括如下步骤 (l)选择易感细胞作为制苗用细胞牛睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞、猪睾丸(ST) 传代细胞、猪肾(PK15)传代细胞、猪肾(IBRS-2)传代细胞之一。
5
(2)制苗用细胞的传代与培养上述易感细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传 代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；细胞培养温 度是36 37°C ; [OO32] (3)生产用毒种的繁殖 A.猪瘟活疫苗生产用毒种的繁殖用含3 5X牛血清的MEM细胞维持液， 将新鲜脾毒种制成病毒悬液，接种生长良好的上述易感细胞单层，37t:继续培养；每隔 4 5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种，细胞培养温度是 36 37°C。 细胞毒种鉴定猪瘟活疫苗生产用细胞毒种鉴定应完全符合猪瘟兔化弱毒株毒
种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每lml含病毒^ 500,000个家兔感染量。 B.伪狂犬病活疫苗生产用毒种的繁殖用含3 5%牛血清的MEM细胞维持
液，将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述易感细胞单层，37t:继续培养；2 3日
后收获细胞培养毒液作为生产用毒种。 细胞毒种鉴定伪狂犬病活疫苗生产用细胞毒种鉴定应完全符合伪狂犬病病毒 弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每lml含病毒^ 108TCID5。。 [OO37] (4)制苗毒液的繁殖 A.猪瘟活疫苗制苗毒液的繁殖取已形成良好细胞单层的上述易感细胞培养 瓶，弃去细胞生长液，接种含毒的含3 5X牛血清的MEM细胞维持液，37。C继续培 养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液l次，收获的细胞毒液 置-15°C以下保存。细胞培养温度是36 37°C 。 制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、 19页进 行检验，制苗用毒液应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收 次病毒培养液分别用家兔测定，每lml含病毒2 500,000个家兔感染量。
B.伪狂犬病活疫苗制苗毒液的繁殖取已形成良好细胞单层的上述易感细胞培 养瓶，弃去细胞生长液，接种含毒的含3 5X牛血清的MEM细胞维持液，37。C继续培 养；接毒后2 3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-15t:以下保存。细胞培养温度是 36 37°C。 制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、 19页进 行检验，制苗用毒液应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收 次病毒培养液分别用细胞测定效价，每lml含病毒2 108TCID5。。 (5)配苗、分装及冻干将检验合格的猪瘟、伪狂犬病病毒培养液，以l : 2比 例混合，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入适量的抗生素，充分摇匀，定量分 装；分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。 在本实施例中，步骤(2)、 (3)、 (4)中所述的细胞培养温度是36 37t:。步骤 (3)、 (4)中所述的接种量为含1% 5%生产用细胞毒种的维持液。 步骤(2)中所用生长液的的配方是90X 92XMEM液、8% 10%犊牛血 清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0 7.2。 步骤(3)及(4)中所用维持液的的配方是95% 98% MEM液、2% 5%犊牛 血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.2 7.4。
成品检验[物理性状]本品为淡红或淡褐色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后 迅速溶解。[无菌检验]按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15页进行检验，应 无细菌、霉菌生长。[支原体检验]按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录19页进行检验， 无支原体生长。[鉴别检验]疫苗用PBS液做适当稀释(l头份/ml)，与等量的抗猪瘟、伪狂犬病 病毒特异性血清混合，在室温中和l小时，其间振荡l-2次。中和完毕后，接种细胞4 瓶(？L)，每瓶(孔)0.1ml，观察7天，无CPE;并静脉注射家兔2只，每只lml，测温观 察，无体温反应。[外源病毒检验]将疫苗稀释1000倍与等量的抗猪瘟、伪狂犬病病毒特异性血清 混合，在室温中和l小时，其间振荡l-2次。中和完毕后，接种家兔2只，每只lml，在 120小时内不引起热反应及发病死亡。并按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录 20页进行检验，无外源病毒污染。[安全检验]疫苗用PBS液做适当稀释(10头份/ml)，肌肉注射7-10日龄无伪狂 犬病病毒中和抗体的仔猪4头，每头2ml，观察14天，无异常反应。 同时，选用经中和试验方法检测无猪瘟抗体的健康易感断奶猪(注苗前观察5 7日，每日上下午各测体温l次。挑选体温、精神、食欲正常者使用)。每批冻干疫苗样 品或同批各亚批样品等量混合，按瓶签注明的头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含6头 份疫苗，肌肉注射猪4头，每头5ml(含30个使用剂量)。注苗后，每日上、下午各观察 并测体温1次，观察21日。体温、精神、食欲与注苗前相比没有明显变化；或体温升高 超过o.5t:，但不超过rc，稽留不超过2日(4个温次)；或减食不超过l日，疫苗可判 为合格。如有i头猪体温超过常温rc以上，但不超过1.5t:，稽留不超过2个温次，疫
苗也可判为合格。如有l头猪的反应超过上述标准；或出现可疑的其它体温反应和其它 异常现象时，可用4头猪重检1次。重检的猪仍出现同样反应，疫苗应判为不合格。也 可在猪高温期采血复归猪2头，每头肌肉注射可疑猪原血5ml，测温观察16日。如均无 反应，疫苗可判合格。如第l次检验结果已经确证疫苗不安全，则不应进行重检。
[效力检验] l猪瘟部分按瓶签注明头份用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释7500倍，耳静脉 注射体重为1.5 3kg家兔2只，每只lml。家兔接种后，上下午各测体温1次，48小 时后，每隔6小时测体温1次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。
①家兔接种疫苗后，体温反应标准如下 定型热反应(++)潜伏期48 96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次 超过常温rC以上，并稽留18 36小时。如稽留42小时以上，必须攻毒，攻毒后无反 应可判为定型热。 轻热反应(+)潜伏期48 96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过 常温0.5。C以上，并稽留12 36小时。 可疑反应(±)潜伏期48 96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。 体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，
均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔热反应可判为定型热或轻热反应。 无反应(-)体温正常。 ②结果判定 注苗后，当2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另l只 兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。 注苗后，当1只家兔呈定型热反应(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应 (±);或2只兔均呈轻热反应(+)时，可在注苗后7 10日攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干 毒)。攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为50 100倍乳剂。每兔耳静脉注射lml。
攻毒后的体温反应标准如下 热反应(+)潜伏期24 72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温rC以上，稽 留12 36小时。 可疑反应(士)潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到 12小时或超过36小时而不下降。
无反应(-)体温正常。 攻毒后，当2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)，另1 只兔呈轻热反应(+)，而2只注苗兔均无反应(-)，疫苗判合格。 注苗后，如有1只兔呈定型热(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(±)或 无热反应(-)，可对可疑反应兔或无反应兔采用剖杀或采心血分离病毒的方法，判明是否 隐性感染；或注苗后，2只兔均呈轻热反应，亦可对其中l只兔分离病毒。方法是接 种疫苗后96 120小时之间，将兔剖杀，采取脾脏，用生理盐水制成50倍稀释乳剂(脾 乳剂应无菌)，或采取心血(全血)，接种2只家兔，每只兔耳静脉注射lml。凡有l只 兔潜伏期24 72小时出现定型热反应(++)，疫苗可判为合格。 注苗后，出现其它反应情况无法判定时，可重检。用家兔做效检，不应超过3 次。 2伪狂犬病部分用PBS液将每头份疫苗稀释为103、 104、 105倍，每个稀释度各 接种CEF细胞4瓶(孔)，每瓶(孔)0.1ml，观察CPE，计算TCID5。。每头份病毒含量应 2 5X105TCID50。[剩余水分测定]按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录31页进行检验， 应符合兽用生物制品通则的规定。[真空度测定]按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录31页进行检验，
应符合规定。[作用与用途]用于预防猪瘟、伪狂犬病。猪瘟、伪狂犬病免疫期均为l年。 [OO 6][用法与用量] 1用法按瓶签注明的头份，用PBS液稀释为1头份lml，肌肉注射。
2用量乳猪第一次注射l/2头份，仔猪及架子猪注射l头份，成年猪注射2头份。
本发明的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，制备过程简单且稳定、易操 作、病毒含量高、批间差异小、质量易控、可显著提高疫苗产量和质量、减少过敏反应等优点。利用本发明的制备方法得到的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗安全性好、免疫效力 高，对猪瘟、伪狂犬病的强毒攻击具有较好的免疫保护作用。现有技术中免疫接种猪 瘟和伪狂犬病活疫苗，采用分开免疫，多针次、多剂量，既繁琐、费时、费力、增加成 本，又难以合理安排免疫程序，而且猪瘟和伪狂犬病均为免疫抑制病，免疫剂量不合理 会引起相互干忧，且容易造成漏种，直接影响预防效果。用本发明的猪瘟、伪狂犬病二 联活疫苗免疫接种，可减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成 的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激，达到"一针防两病"。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。
权利要求
一种用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)用传代细胞培养猪瘟病毒弱毒株和伪狂犬病病毒弱毒株；(2)收获所述步骤(1)得到的细胞培养毒液；(3)把所述步骤(2)得到的两种细胞培养毒液按1∶2比例混合，并在混合液中加稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到传代细胞猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗。
2. 根据权利要求1所述的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，其特征 在于，所述步骤(1)包括如下步骤(la)制苗用细胞的传代与培养所述传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代， 用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；(lb)细胞毒种的繁殖将新鲜脾毒制成病毒悬液，接种至所述步骤(la)中得到的传 代细胞单层，继续培养，每隔4 5日收获换液一次，取二收、三收的细胞培养毒液作为 猪瘟活疫苗生产用毒种；将所述伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤(la)中得到的传代 细胞单层，用细胞维持液继续培养，2 3日后收获细胞培养毒液作为伪狂犬病活疫苗生 产用毒种；(lc)制苗毒液的繁殖猪瘟活疫苗制苗毒液的繁殖取所述步骤(la)中得到的传代细胞单层，弃去所述细 胞生长液，接种所述步骤(lb)中得到的含猪瘟病毒的细胞维持液，继续培养；伪狂犬病活疫苗制苗毒液的繁殖取所述步骤(la)中得到的传代细胞单层，弃去所 述细胞生长液，接种所述步骤(lb)中得到的含伪狂犬病病毒的细胞维持液，继续培养；
3. 如权利要求2所述的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(2)收获所述细胞培养毒液为将含猪瘟病毒的维持液接种到传代细胞单层后培养，接毒后5日作第一次收获换 液，以后每隔4日收获换液一次，收获的毒液置于-i5t:以下保存；将含伪狂犬病病毒的维持液接种到传代细胞单层后培养，接毒后2 3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置于-15°C以下保存；
4. 根据权利要求2所述的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，其特征 在于，所述步骤(la)、 (lb)和(lc)中的细胞培养所用的温度为36t:-37t:。
5. 根据权利要求2所述的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，其特征 在于，所述步骤(lb)和(lc)中的接种时的接种量为1% 5%体积百分比的生产用细胞毒 种的维持液。
6. 根据权利要求2所述的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，其特征 在于，所述步骤(la)中的细胞生长液为含90X 92X体积百分比的MEM液、8% 10% 体积百分比的犊牛血清和抗菌素，所述细胞生长液的pH值为7.0 7.2。
7. 根据权利要求2所述的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在 于，所述步骤(lb)和(lc)中的细胞维持液为含95X 98X体积百分比的MEM液、2% 5%体积百分比的犊牛血清和抗菌素，所述细胞维持液的pH值为7.2 7.4。
8. 根据权利要求1-7之一所述的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法， 其特征在于，所述传代细胞选自猪睾丸传代细胞ST、猪肾传代细胞PK15和猪肾传代细胞IBRS-2。
9. 一种猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗，其特征在于，所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗 通过权利要求1所述的方法得到。
全文摘要
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法及其制品。本发明的用传代细胞制备猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的方法，包括如下步骤(1)用传代细胞培养猪瘟病毒弱毒株和伪狂犬病病毒弱毒株；(2)收获所述步骤(1)得到的细胞培养毒液；(3)把所述步骤(2)得到的两种细胞培养毒液按1∶2比例混合经冷冻真空干燥得到传代细胞猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗。本发明还提供上述制备方法制备的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗。用本发明的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗免疫接种，可减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激，可预防猪瘟与伪狂犬病的发生。
文档编号C12N7/00GK101690808SQ20091019306
公开日2010年4月7日 申请日期2009年10月14日 优先权日2009年10月14日
发明者丘成文, 任向阳, 吴文福, 岑小清, 张国丽, 张毓金, 杨傲冰, 林旭野, 游启有, 赖月辉 申请人:广东永顺生物制药有限公司