专利名称：表面展示calb的毕赤酵母工程菌及催化合成短链芳香酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种能在毕赤巴斯德酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的基因表 达载体和展示有高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌，特别是涉及一种用全细胞酶制剂高效地 催化合成短链芳香酯的方法。
背景技术：
短链芳香酯大多具有食用水果香味，如己酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯等。这些短 链酯不仅是香精、香料重要的组分，更作为常用的主要食品添加剂用于食品、饮料、酿造行 业，仅我国的己酸乙酯，每年产量就达2千多吨，产值数亿元。目前生产中所使用的这些酯 类香精主要是在无机催化剂存在下通过化学法合成的，其生产工艺常涉及高温、高压及强 酸、强碱，对环境污染大。酶法催化合成短链芳香酯具有反应条件温和、催化效率高、催化专 一性强等优点。美国FDA认为酶法生产的产品是"natural"(天然的)，因而酶法生产的短 链芳香酯，符合人们对天然高品质的、有利于环境保护和可再生利用产品的日益增长的需 求。 但是，短链芳香酯的脂肪酶催化生产停滞在小规模实验室水平，主要存在脂肪酶 的规模制备困难、回收率低、固定化酶成本较高等生产瓶颈以及催化反应本省反应周期长、 产物产率低等瓶颈，其工业化规模生产不可能。 来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的南极假丝酵母脂肪酶B (CALB)是 一类重要的脂肪酶，在酯化、水解、转酯、以及其它类型反应中都显示了较其它脂肪酶更为 出色的催化性能。基于CALB的优良特性，人们对其进行了商业化的开发，但高成本依然限 制了 CALB广泛应用于实践生产。 利用酵母表面展示技术，外源CALB可借助于锚定在细胞壁的载体蛋白a -凝集素
固定在酵母细胞表面，类似酶的固定化，保持了脂肪酶相对独立的空间构象和原有的生物
活性，省去了酶的分离纯化以及固定化等步骤，更拥有固定化酶回收方便、可重复使用的优
点，具有良好的操作稳定性。近来，日本的研究学者尝试将野生型CALB展示于酿酒细胞表
面，但酶在酿酒酵母细胞表面展示后表现出催化效率偏低，制约了应用(T. Tanino，T. 0hno，
T. Aoki， H. Fukuda， A. Kondo， Appl. Microbiol. Biotechol. 2007， 5 :1319-1325.) 中国发明专利CN1223300公开了一种微生物脂肪酶酶法合成酯的方法，所用的
酶为自产华根霉脂肪酶或商业化的固定化酶Lypozyme IM脂肪酶，催化反应时间长达
10-36h，生产周期长，成本也较高，縮短反应周期，降低酶制备成本是促进短链芳香酯酶法
生产工业化的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供反应l-6h后产率均可达到90%以 上、操作稳定性好、成本低的全细胞酶制剂催化合成短链芳香酯的方法。
本发明的另一 目的在于提供表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株。
利用该方法可生产的短链芳香酯包括乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、
己酸丁酯、己酸己酯、己酸辛酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯和丁酸异戊酯。 —种表面展示CALB的巴斯德毕赤酵母(GS115/pKNS-CALB Pichia
pastorisGS115/pKNS-CALB)于2009年9月30日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号
为CCTCCN0 :M 209217，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学(邮编430072)。应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯的方法，包括如下步
骤 (1)将所述表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株经摇瓶发酵，收获菌体，真空冷 冻干燥24h以上，制成全细胞酶制剂； (2)短链芳香酯的合成采用短链酸和短链醇为原料，以所述全细胞酶制剂为催 化剂，以能够溶解短链酸和短链醇的液态物质为溶剂，进行酯化反应，得到短链芳香酯产 品；底物中所述短链酸含量为0. 2mol/L lmol/L，短链酸和短链醇的摩尔比为1 : 0. 75 1 : 2，酯化反应温度为20-6(TC;反应物中全细胞酶制剂在反应体系中的浓度为10-40g/L， 反应时间l-6h ; 所述的溶剂选自正己烷、正庚烷、异辛烷中的一种或多种；
所述短链酸为C链长度C2-C10的直链酸；
所述C链长度为C2-C10的直链或支链醇。 所述的C链长度为C2-C10的直链或支链醇为乙醇、丁醇、辛醇、己醇或异戊醇。
所述的C链长度C2-C10的直链酸为乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸。
所述的全细胞酶制剂为表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉。
本发明提供了指导CALB在毕赤酵母表面展示实现展示的酵母展示表达载体 pKNS-CALB，此展示表达载体是在商用载体pPIC9K(Invitrogen公司真核表达载体)的基础 上利用限制性内切酶EcoR I和Not I将原载体上的信号肽部分基因切除，在此基础上引 入南极假丝酵母脂肪酶B与来源于酿酒酵母的a凝集素的融合基因。凝集素位于融合蛋 白C端，可共价锚定在酵母细胞壁上，位于N端的CALB可借助a凝集素定位于细胞壁实现 在毕赤酵母细胞表面展示。该重组质粒主要包含5' A0X1 (醇氧化酶-1基因的启动子)、 3'A0X1 (醇氧化酶-1基因的转录终止子)、CALB (南极假丝酵母脂肪酶B) 、NS ( a凝集素基 因)、HIS4(组氨酸脱氢酶基因)，以及Amp+(氨苄青霉素抗性)、Kna+(卡那霉素抗性)等元 件。 菌体干粉制备过程如下首先，针对南极假丝酵母脂肪B基因和来源于a凝集素 设计拼接引物，以南极假丝酵母基因组和酿酒酵母基因组为模板或含脂肪酶基因、a凝集 素的质粒为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，融合基因PCR产物与商用载体pPIC9K经 同样的限制性内切酶处理，经T4连接酶体外连接后，转化大肠杆菌感受态，涂布抗性平板， 挑选鉴定阳性单克隆。阳性单克隆摇瓶培养提取重组质粒pKNS-CALB。重组质粒pKNS-CALB 线性化后转化毕赤酵母宿主菌，转化物涂布抗性平板，28 32t:培养2 3d后，筛选获得 重组转化子。重组转化子经BMGY扩大培养24 48h后，采用6000g 10000g离心力室 温离心收集菌体，再用同体积的B匪Y诱导培养，每隔24h添加甲醇至终浓度为1 2%。 7000g 10000g离心力、4t:离心10 15分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h以上收获菌体干粉。 相对于现有技术本发明具有如下优点和有益效果 本发明采用以展示有高活力CALB的毕赤酵母全细胞酶制剂作为催化剂，具有固 定化酶的优点，反应时间短、产率高、操作稳定性好。反应后离心收集菌体即可重复利用，大 大降低生产成本。酵母具有良好的生物安全性，其取代化学载体固定脂肪酶生产短链芳香 酯，符合天然产物的要求。毕赤酵母全细胞酶制剂冻干粉在非水相的反应体系中，以有机溶 剂为溶剂，能有效的催化短链酸和短链醇酯化生成短链芳香酯，反应卜6h后，酸的摩尔转 化率可达到或超过90%，经过IO批次的连续使用，全细胞酶制剂催化的相对转化率保持在 85%以上，具有良好的操作稳定性。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，这些实施例并不构成
对本发明保护范围的限制。
实施例1 表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母全细胞酶制剂的生产。
首先，根据南极假丝酵母脂肪酶(calb)基因LF058的核苷酸序列设计引物(上游 引物为5' TGTAGAATTCCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTG 3'，引入了 EcoR I酶切位点，下游引物5' GAGGCCGTAGCAGTGGGGATGCGCATAGAGCTCAGGTCCTCCACGAG 3'，引入Mlu I酶切位点)。以南 极假丝酵母基因组DNA为模板进行PCR扩增全长calb， PCR程序如下95。C预变性5min，以 94°C lmin、60。C lmin、72。C lmin进行30个循环，72。C延伸10min。 其次，根据a凝集素的核苷酸序列设计引物，上游引物为5'CTCCGGCATCGTCACCCC TACGCGTATCTCGAGTCCAGGAGGTGCTC 3'，引入CALB基因下游末尾19bp和Mlul酶切位点，下 游引物为5'ATTAGCGGCCGCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAG 3'，引入Not I酶切位点。以含有 a凝集素的重组质粒为模板进行a凝集素的PCR扩增。PCR程序如下94。C预变性5min， 以94。C lmin、58。C lmin、72。C lmin进行30个循环，72。C延伸10min。 上述两种PCR产物分别取1 ii L作为模板加入新的PCR体系扩增CALB-NS融合基因 片段(上游引物采用扩增CALB的上游引物5'TGTAGAATTCCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTG 3'，下 游引物采用扩增a凝集素的下游引物5'ATTAGCGGCCGCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAAG 3')。 PCR程序如下:94。C预变性5min，95。C lmin、55。C 1. 5min、72。C 2min进行30个循环，72。C延 伸10min。融合基因产物纯化后经Eco RI和Not I酶切，同时把20 y L质粒pPIC9K经Eco RI和Not I酶切，纯化后用T4DNA连接酶连接，转化E. coli Top10，筛选阳性转化子。
验证的重组质粒pKNS-CALB经Sac I线性化后用电转移的方转化P. pastoris GS115。涂转化物涂布于G418梯度平板，3(TC培养2d。挑取部分抗高浓度G418的转化子接 种于5ml YPD培养液，3(TC，250r/min培养过夜，碱滴定法检测脂肪酶活力，得到表面展示 CALB的毕赤酵母工程菌菌株(Pichia pastoris GS115/pKNS-CALB)，该菌株于2009年9月 30日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:M 209217，保藏地址为湖北省 武汉市武汉大学(邮编430072)。毕赤酵母工程菌菌株先经YPD种子液培养，经BMGY扩大 培养24h后；6000g室温离心收集菌体。再用同体积的B匪Y诱导培养，每隔24h添加甲醇 至终浓度为1%。 3(TC、250rpm摇床培养4d。 7000rpm、4t:离心10分钟，弃上清，用去离子水洗涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h，得菌体冻干粉。
实施例2 以乙酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备乙酸乙酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和冰醋酸加入正庚烷中。加入 后，无水乙醇的浓度为O. 5mol/L，冰醋酸的浓度为0.4mol/L。取10mL底物(其中冰醋酸 288. 6ii L，无水乙醇291. 2ii L，正庚烷9420. 2ii L，酸醇摩尔比为1 : 1. 25)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度4(TC，然后于 200rpm下振荡反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，乙酸的转化率能达到92. 1 % ，反应 时间仅为产率接近的报道的1/26。
实施例3 以丁酸和异戊醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备丁酸异戊酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将异戊醇和丁酸加入正庚烷中。加入后，异戊 醇的浓度为0. 88mol/L， 丁酸的浓度为0. 8mol/L。取10mL底物(其中丁酸734. 3 y L，异戊 醇957. 7iiL，正庚烷8308iiL，酸醇摩尔比为l : 1. 1)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含 量为20g/L的实施例l制备的菌体冻干粉，反应温度5(TC，然后于200rpm下振荡反应，0. 5h 后加入0.6g分子筛，反应3h，丁酸的转化率能达到97X，同杨本宏报道的(杨本宏.非水 相脂肪酶催化合成丁酸异戊酯.中国食品添加剂，2005， 5 :74-79)的根霉PW358经固态发 酵生产的脂肪酶催化丁酸异戊酯的合成相比，反应时间縮短了 2h。
实施例4 以己酸与乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸乙酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，无 水乙醇的浓度为1. lmol/L，正己酸的浓度为lmol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L， 无水乙醇512. 4iiL，正庚烷8487. 6iiL，酸醇摩尔比为1 : 1. 1)混合物于50mL具塞三角 瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55t:，然后于200rpm下 振荡反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应1. 5h，己酸的转化率能达到97. 97% 。产率接近 目前文献报道的最高产率(98% )，反应时间縮短为报道的全细胞催化反应时间的1/8(报 道的最高水平为12h，产率98%， Shuang-yan Han， et al. Highly efficient synthesis of ethylhexanoate catalyzed by CALB_displaying Saccharomyces cerevisiae whole—cells in non—叫ueousphaseJournal of Molecular Catalysis B :Enzymatic， 2009,59 :168-172)。在上述条件下反应后，离心回收菌体，经溶剂正庚烷洗涤，去除产物和 残余的微量底物，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应，经过10批次的连续 使用，毕赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的转化率保持在90%以上。
实施例5 以己酸与丁醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸丁酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将正丁醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正丁 醇的浓度为0. 88mol/L，正己酸的浓度为0. 8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L，正 丁醇805. 3iiL，正庚烷8194. 7iiL，酸醇摩尔比为1 : 1. 1)混合物于50mL具塞三角瓶中， 加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55°C ，然后于200rpm下振荡反 应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，己酸的转化率能达到97. 07% 。
实施例6 以丙酸与乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备丙酸乙酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和丙酸加入正庚烷中。加入后，无 水乙醇的浓度为0. 75mol/L，丙酸的浓度为0. 6mol/L。取10mL底物(其中丙酸448. 1 y L， 无水乙醇436. 7iiL，正庚烷9115. 2iiL，酸醇摩尔比为1 : 1. 25)混合物于50mL具塞三角 瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度50°C ，然后于200rpm下振 荡反应，0.5h后加入0.6g分子筛，反应3h，丙酸的转化率能达到96. 19%。比报道的(葛 清秀等.碱性脂肪酶催化合成丙酸乙酯的研究.泉州师范学院学报，2004，22(6) :987-101) 利用扩展青霉碱性脂肪酶催化丙酸乙酯合成时，丙酸为0. 2mol/L，酸醇=1 : 1. 25的条 件下，48h丙酸转化率为75. 7%的反应时间縮短为1/8，产率提高到96%以上。
实施例7 以冰醋酸和异戊醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备乙酸异戊酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将异戊醇和冰醋酸加入正庚烷中。加入后，异 戊醇的浓度为0. 5mol/L，冰醋酸的浓度为0. 4mol/L。取10mL底物(其中冰醋酸288. 6 y L， 异戊醇544. 1 ii L，正庚烷9167. 3 y L，酸醇摩尔比为1 : 1. 25)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度40°C ，然后于200rpm下振荡 反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，冰醋酸的转化率能达到96. 30% 。产率接近现有技 术(杨本宏.非水溶剂中Rhizopus arrhizus脂肪酶催化合成三种酯的最佳条件.中国生 物化学与分子生物学报，2003，19(5) :572-575)报道的97%的同时，底物浓度提高1倍，而
反应时间縮短了三分之二。
实施例8 以丁酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备丁酸乙酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和正丁酸加入正庚烷中。加入后， 无水乙醇的浓度为0.88mol/L，正丁酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中正丁酸 734. 3iiL，无水乙醇512. 4iiL，正庚烷8753. 3iiL，酸醇摩尔比为1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55t:，然后于 200rpm下振荡反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，正丁酸的转化率能达到97. 44% 。
实施例9 以己酸和己醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸己酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将正己醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正 己醇的浓度为O. 88mol/L，正己酸的浓度为0. 8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L， 正己醇1102.9iiL，正庚烷7897. liiL，酸醇摩尔比为1 : 1. 1)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55t:，然后于200rpm下振荡 反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，正己酸的转化率能达到98. 01 % 。
实施例10 以正己酸和正辛醇己醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备己酸辛酯。 试剂都预先用3A分子筛充分除水。将正辛醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，正 辛醇的浓度为O. 88mol/L，正己酸的浓度为0. 8mol/L。取10mL底物(其中正己酸1000 y L，正辛醇1383. 3 ii L，正庚烷7616. 7 y L，酸醇摩尔比为1 : 1.1)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55t:，然后于200rpm下振荡 反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，正己酸的转化率能达到97. 85% 。
实施例11 以庚酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备庚酸乙酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和正庚酸加入正庚烷中。加入后， 无水乙醇的浓度为0.88mol/L，正庚酸的浓度为0.8mol/L。取10mL底物(其中正庚酸 1142. 9ii L，无水乙醇512. 4ii L，正庚烷8344. 7ii L，酸醇摩尔比为1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55t:，然后于 200rpm下振荡反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，正庚酸的转化率能达到96. 25% 。
实施例12 以正辛酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备辛酸乙酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和正辛酸加入正庚烷中。加入后， 无水乙醇的浓度为0.66mol/L，正辛酸的浓度为0.6mol/L。取10mL底物(其中正辛酸 950. 8 ii L，无水乙醇384. 3 y L，正庚烷8664. 9 y L，酸醇摩尔比为1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量为20g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55t:，然后干 200rpm下振荡反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，正辛酸的转化率能达到94. 21 % 。
实施例13 以正癸酸和乙醇为底物，全细胞酶制剂催化非水相酯化反应制备癸酸乙酯。
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和正癸酸加入正庚烷中。加入后， 无水乙醇的浓度为0.66mol/L，正癸酸的浓度为0.6mol/L。取10mL底物(其中正癸酸 1161. 3ii L，无水乙醇384. 3ii L，正庚烷8454. 4ii L，酸醇摩尔比为1 : 1. 1)混合物于50mL 具塞三角瓶中，加入含量为30g/L的实施例1制备的菌体冻干粉，反应温度55t:，然后于 200rpm下振荡反应，0. 5h后加入0. 6g分子筛，反应3h，正癸酸的转化率能达到90. 35% 。如上所述即可较好实施本发明。序列表〈110〉华南理工大学〈120〉表面展示CALB的毕赤酵母工程菌及催化合成短链芳香酯的方法〈130>5〈160>4〈170>PatentIn version 3.〈210>1〈211>32〈212〉核苷酸〈213〉人工序列〈400>1tgtagaattc ctgccttccg gttcggaccc tg 32〈210>1〈211>47
〈212〉核苷酸〈213〉人工序列〈400>2gaggccgtag cagtggggatgcgcatagagctcaggtcctccacgag 47〈210>3〈211>47〈212>核苷酸〈213〉人工序列〈400>3ctccggcatc gtcacccctacgcgtatctcgagtccagg3ggtgctc 47〈210>4〈211>36〈212〉核苷酸〈213〉人工序列〈400>4attegcggcc gctteg朋tegcaggtacga3权利要求
一种表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株，其特征在于包藏号为CCTCC M 209217。
2. 应用权利要求1所述的表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯的方 法，其特征在于包括如下步骤(1) 将所述表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株经摇瓶发酵，收获菌体，真空冷冻干 燥24h以上，制成全细胞酶制剂；(2) 短链芳香酯的合成采用短链酸和短链醇为原料，以所述全细胞酶制剂为催化剂， 以能够溶解短链酸和短链醇的液态物质为溶剂，进行酯化反应，得到短链芳香酯产品；底物 中所述短链酸含量为0. 2mol/L lmol/L，短链酸和短链醇的摩尔比为1 : 0. 75 1 : 2， 酯化反应温度为20-6(TC;反应物中全细胞酶制剂在反应体系中的浓度为10-40g/L，反应时 间l-6h ;所述的溶剂选自正己烷、正庚烷、异辛烷中的一种或多种； 所述短链酸为C链长度C2 C10的直链酸； 所述C链长度为C2-C10的直链或支链醇。
3. 根据权利要求2所述的应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯 的方法，其特征在于所述的C链长度为C2-C10的直链或支链醇为乙醇、丁醇、辛醇、己醇或 异戊醇。
4. 根据权利要求2所述的应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香酯 的方法，其特征在于所述的C链长度C2-C10的直链酸为乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛 酸、癸酸。
5. 根据权利要求2所述的应用表面展示CALB的毕赤酵母工程菌催化合成短链芳香 酯的方法，其特征在于所述的全细胞酶制剂为表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌体冻干 粉。
全文摘要
本发明公开了表面展示CALB的毕赤酵母工程菌及催化合成短链芳香酯的方法。该方法将表面展示CALB的毕赤酵母工程菌菌株摇瓶发酵，收获菌体，真空冷冻干燥24h以上，制成全细胞酶制剂；采用短链酸和短链醇为原料，以全细胞酶制剂为催化剂，以能够溶解短链酸和短链醇的液态物质为溶剂，进行酯化反应，得到短链芳香酯产品；酯化反应温度为20-60℃；反应物中全细胞酶制剂在反应体系中的浓度为10-40g/L，反应时间1-6h。该方法较以往报道反应时间大大缩短、产率高达98％、连续操作稳定性好，且反应后全细胞催化剂经离心回收即可重复利用，大大降低生产成本。
文档编号C12P7/62GK101792721SQ200910192910
公开日2010年8月4日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者林影, 郑穗平, 金子, 韩双艳, 黄登峰 申请人:华南理工大学