专利名称：：用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法
技术领域：
：本发明涉及菠萝蛋白酶制备方法，具体地，涉及用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法。
背景技术：
：高分子化合物聚丙烯酸(PolycrylicAcid，縮写PAA)是以丙烯酸为单位聚合而成，其结构式为聚丙烯酸为无色或淡黄色液体，易溶于水，能与金属离子、钙、镁等形成稳定的化合物，对水中碳酸钙和氧化钙有优良的分解作用，对人畜无毒，工业上常用作分散剂。其价格便宜(岳6200元/吨)易得，质量指标符合GB/T1053-2000。菠萝蛋白酶(Bromelain)，简称菠萝酶，也称为凤梨酶或凤梨酵素，酶学编号EC3.4.22.32，是从凤梨科(Ananascomosus)植物中提取制备而得一种纯天然植物蛋白质。菠萝蛋白酶是一类巯基蛋白酶，其活性中心为巯基(-SH)，具很强的水解活性，能进行蛋白质水解等各种生化反应，还具有很强的分解纤维蛋白和血凝块的作用，可提高人体免疫力，因而，被广泛的用于食品、生物、医药和化工等行业。目前，菠萝蛋白酶的提取方法，主要有化学提取法和物理提取方法，如专利CN1908165A提供了一种菠萝蛋白酶物理提取新方法，其提取菠萝蛋白酶的工艺步骤为原料_清洗_粉碎_预处理_榨汁_离心_冷冻_过滤_超滤_干燥_成品，整个工艺能耗巨大，生产工艺复杂繁琐，成本高，不利于规模化生产，其菠萝蛋白酶产品得率较低。专利CN100368537C提供了一种菠萝蛋白酶冷冻干燥粉的制备方法，菠萝原料经清洗榨汁后，滤液用氧化锌吸附，超滤浓縮液，冷冻干燥等步骤制得菠萝蛋白酶冷冻干燥粉，其酶活性单位达到600万单位/g，可作为医药原料使用，该工艺较为简单，易于操作，但其产物酶活性太低，工艺中使用的材料昂贵，不经济。专利CN101307309A提供了一种利用金属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶的方法，活化的尼龙膜经改性后，螯合金属锌离子，吸附菠萝蛋白酶，而后洗脱即可。该法需对尼龙膜处理工艺复杂，整个工艺耗时长，终产品纯化倍数低。
发明内容本发明的目的是克服现有技术之不足，提供一种用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，该法原料低廉易得，操作简便，菠萝蛋白酶得率高，纯化倍数高，酶活性好。本发明的技术方案如下用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤(1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝果皮或茎叶，洗净；加入含46mmol/L焦亚硫酸钠和15mmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比为5:1.52.5，匀浆；过滤得滤液；35004000r/min，离心滤液，收集上清液，即得菠萝蛋白酶提取液；(2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入0.50.8%的聚丙烯酸(PAA)后，置于48t:冷凝聚1214小时；35004000r/min，离心，收集沉淀，即为聚丙烯酸-菠萝蛋白酶；(3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白酶中，加入可以溶解沉淀量的5060mmol/L醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙烯酸-钙沉淀；35004000r/min，离心，上清液即为菠萝蛋白酶液，沉淀为聚丙烯酸-钙；(4)固态酶制剂制备向步骤(3)所得菠萝蛋白酶液中加入1/15mol/L，p朋.8的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液，4『C透析812小时；取出透析后的菠萝蛋白酶液，冷冻干燥，即得菠萝蛋白酶固体酶制剂。较佳地，步骤(1)所述菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比5:2。步骤(1)所述过滤为用用200目尼龙过滤。步骤(1)所用的菠萝果皮或茎叶，洗净后，切碎成2-3cm的小块。向步骤(3)所述聚丙烯酸_钙沉淀中加入沉淀体积2%的硫酸，即生成硫酸钙和聚丙烯酸；35004000r/min，离心，沉淀为硫酸钙，上清液为聚丙烯酸(PAA)，回收聚丙烯酸，重复利用。步骤(4)所述透析过程中，更换缓冲液一次。本发明所提供的用高分子凝聚物制备菠萝蛋白酶的方法，其原理如下PAA+E—PAA-EPAA_E+Ca2+—PAA-Ca+EPAA-Ca+S042+—CaS04+PAA其中，PAA是聚丙烯酸的縮写，E代表菠萝蛋白酶，PAA-E代表聚丙烯酸_菠萝蛋白酶，PAA-Ca代表聚丙烯酸_牵丐。本发明的优点在于(l)由于聚丙烯酸无毒性，用聚丙烯酸制备的菠萝蛋白酶无污染，其纯度高，活性好，可直接作为医疗原料应用；(2)聚丙烯酸原料来源方便，可用于工业化大规模生产；(3)本发明方法操作简单，快速、高效，分离量大。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤(1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝果皮500克，洗净，切碎成23cm小块；加入含4mmol/L焦亚硫酸钠和5mmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，切碎后的菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比为5:1.5，匀浆；用200目尼龙布过滤并挤出滤液；3500r/min，离心10分钟，收集上清液，即得菠萝蛋白酶提取液，共计155ml;(2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入O.5%的聚丙烯酸(PAA)后，搅拌均匀，置于4t:冷凝聚12小时；3500r/min，离心10分钟，收集沉淀，即为聚丙烯酸-菠萝蛋白酶；(3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白酶中，加入可以溶解沉淀量的50mmol/L醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙烯酸-钙沉淀；3500r/min，离心10分钟，上清液即为菠萝蛋白酶液，共计145ml，沉淀为聚丙烯酸_钙；向所述聚丙烯酸_钙沉淀中加入沉淀体积2%的硫酸，即生成硫酸钙和聚丙烯酸；3500r/min，离心10分钟，沉淀为硫酸钙，上清液为聚丙烯酸(PAA)，回收聚丙烯酸，重复利用。(4)固态酶制剂制备向步骤(3)所得菠萝蛋白酶液中加入1/15mol/L，p朋.8的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液，4t:透析8小时；取出透析后的菠萝蛋白酶液，冷冻干燥，即得菠萝蛋白酶固体酶制剂，共计2.5g。为了进一步说明本发明的所提供方法的效果，用常规方法检测各产物酶活性和蛋白质含量并计算相关参数，其结果如表1所示表1菠萝果皮所含菠萝蛋白酶分离纯化后酶活性和蛋白含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤(1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝茎叶500克，洗净，切碎；加入含6mmol/L焦亚硫酸钠和lmmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，切碎后的菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比为52，匀浆；用200目尼龙布过滤并挤出滤液；4000r/min，离心10分钟，收集上清液，即得菠萝蛋白酶提取液，共计155ml;(2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入O.8%的聚丙烯酸(PAA)后，搅拌均匀，置于48t:冷凝聚1214小时；4000r/min，离心10分钟，收集沉淀，即为聚丙烯酸-菠萝蛋白酶；(3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白酶中，加入可以溶解沉淀量的60mmol/L醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙烯酸-钙沉淀；4000r/min，离心10分钟，上清液即为菠萝蛋白酶液，共计145ml，沉淀为聚丙烯酸-牵丐；(4)固态酶制剂制备向步骤(3)所得菠萝蛋白酶液中加入1/15mol/L，p朋.8的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液，8t:透析12小时；期间更换一次缓冲液，取出透析后的菠萝蛋白酶液，冷冻干燥，即得菠萝蛋白酶固体酶制剂，共计2.0g。用常规方法检测各产物酶活性和蛋白质含量及计算相关参数，结果见2。表2菠萝茎叶所含菠萝蛋白酶分离纯化后酶活性和蛋白含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读本
发明内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价变化同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝果皮或茎叶，洗净；加入含4～6mmol/L焦亚硫酸钠和1～5mmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比为5∶1.5～2.5，匀浆；过滤得滤液；3500～4000r/min，离心滤液，收集上清液，即得菠萝蛋白酶提取液；(2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入0.5～0.8％的聚丙烯酸后，置于4～8℃冷凝聚12～14小时；3500～4000r/min，离心，收集沉淀，即为聚丙烯酸-菠萝蛋白酶；(3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白酶中，加入可以溶解沉淀量的50～60mmol/L醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙烯酸-钙沉淀；3500～4000r/min，离心，上清液即为菠萝蛋白酶液，沉淀为聚丙烯酸-钙；(4)固态酶制剂制备向步骤(3)所得菠萝蛋白酶液中加入1/15mol/L，pH6.8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4～8℃透析8～12小时；取出透析后的菠萝蛋白酶液，冷冻干燥，即得菠萝蛋白酶固体酶制剂。2.如权利要求1所述的用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(1)所述菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比5:2。3.如权利要求1所述的用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(1)所述过滤为用用200目尼龙过滤。4.如权利要求1所述的用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(1)所用的菠萝果皮或茎叶，洗净后，切碎成2-3cm的小块。5.如权利要求1所述的用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，向步骤(3)所述聚丙烯酸-钙沉淀中加入沉淀体积2%的硫酸，即生成硫酸钙和聚丙烯酸；35004000r/min，离心10分钟，沉淀为硫酸f丐，上清液为聚丙烯酸，回收聚丙烯酸，重复利用。6.如权利要求1所述的用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(4)所述透析过程中，更换缓冲液一次。全文摘要本发明提供了一种用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤(1)菠萝蛋白酶的提取；(2)冷凝聚；(3)游离出菠萝蛋白酶；(4)固态酶制剂制备等步骤。本发明的优点在于(1)由于聚丙烯酸无毒性，用聚丙烯酸制备的菠萝蛋白酶无污染，其纯度高，活性好，可直接作为医疗原料应用；(2)聚丙烯酸原料来源方便，可用于工业化大规模生产；(3)本发明方法操作简单，快速、高效，分离量大。文档编号C12N9/50GK101696404SQ200910193079公开日2010年4月21日申请日期2009年10月15日优先权日2009年10月15日发明者宋秋兰申请人:宋秋兰;