Tpmt基因snp检测的特异性序列、液相芯片及方法

专利名称：：Tpmt基因snp检测的特异性序列、液相芯片及方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及TPMT基因SNP检测的特异性序列、液相芯片及方法。
背景技术：
：硫嘌呤类药物在临床上常用于白血病、实体肿瘤的抗癌治疗和器官移植后的免疫抑制治疗，已有将近40年的历史，包括6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)、硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)和6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)。如6-MP是急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)维持疗法的主要药物之一，而AZA则是近年来治疗类风湿性关节炎和Crohn病最常用的药物之一。然而，这类药物可产生严重的甚至可危及生命的血液毒性，导致治疗被迫中断，造成治疗失败，因此其合理使用在临床上备受关注。TPMT在硫嘌呤类药物的体内代谢中起着重要作用，其遗传差异是影响硫嘌呤类药物代谢及药理效应的主要因素。TPMT的作用是将硫嘌呤类药物的活性代谢物6-TGN转变成无活性的6-丽P。如果患者遗传有TPMT缺陷，则在使用常规剂量的硫嘌呤类药物时，导致无活性的6-甲巯基嘌呤减少，而有活性的6-TGN增多并积累，很可能发生致命的毒性反应，如严重的骨髓抑制和肝损害等。与此相反，TPMT活性愈高，形成6-TGN的6-MP就愈少，一些服用标准剂量6-MP但6-TGN浓度很低的儿童面临疾病复发的危险性通常较高。对不同人种的研究发现，导致TPMT编码酶蛋白活性降低的突变等位基因主要有4种TPMT*2(G238C)、TPMT水3A(G460A/A719G)、TPMT*3B(G460A)和TPMT*3C(A719G)，这四类等位基因可以解释约95%的TPMT酶活性降低。其中，中国人群的TPMT*3C等位基因频率约为2.3%。早在2003年，美国FDA就建议在6-巯基嘌呤药物使用前进行TPMT检观ij。对TPMT基因型的检测结果将有助于预测硫嘌呤类药物的毒性，同时可据此调整给药方案，做到用药的个体化，避免因剂量不足造成的维持治疗期间复发，更能避免因剂量过大而产生的严重的不良反应。对于缺乏TPMT酶活性的患者，则可考虑其他的治疗方案。目前国内外己有检测TPMT基因多态性的产品上市，如Prometheuslaboratories,Lab21，Specialtylaboratories,QuestDiagnosis、主动健康-基因检测公司和华大基因研发中心等。目前的产品主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。而其它以PCR为基础的检测SNPs的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR一单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应一限制性片段长度多态(PCR—RFLP)分析技术和基于T叫Man技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力。基于芯片的原理，美国Lurainex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用xTAG液相芯片技术可以同时检测多种SNPs，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容本发明的目的之一是提供TPMT基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测TPMT基因的正常基因型以及三种常见等位基因型G238C，G460A和A719GSNP位点。一种TPMT基因SNP检测液相芯片，包括有(1).针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物对，每种ASPE引物由5'端的tag序列和3'端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自SEQIDNO,7及SEQIDNO.8、SEQIDNO.9及SEQTDNO.10、和/或SEQIDNO.ll及SEQIDNO.12;所述tag序列选自SEQIDNO.1SEQIDNO.6中的序列；(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQIDNO.13SEQIDNO.18中的序列;(3).用于扩增具有G238C，G460A和/或A719GSNP位点的TPMT基因目标序列的引物。优选地，所述扩增用的引物为选自针对G238CSNP位点的SEQIDNO.19和SEQIDNO.20针对G460ASNP位点的SEQIDNO.21和SEQIDNO.22，针对A719GSNP位点的SEQIDNO.23和SEQIDNO.24。本发明的另一目的是提供TPMT基因SNP检测的特异性引物序列，该引物序列特异性强，能准确区分各种基因型，并且多位点同步检测不存在交叉反应率。所述用于TPMT基因SNP检测的特异性引物序列，包括针对G238C野生型和突变型的SNP位点SEQIDNO.7和SEQIDNO.8;针对G460A野生型和突变型的SNP位点的SEQIDNO.9和SEQIDNO.10;和/或针对A719G野生型和突变型的SNP位点的SEQIDNO.ll和SEQIDNO.12。本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对TPMT基因SNP进行检测的方法。一种使用上述液相芯片对TPMT基因SNP检测的方法，主要包括以下步骤(一)PC財广增待测样品DNA;(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。所制备的TPMT基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。3.本发明的检测方法步骤简单，一步多重PCR即可完成三个具有SNP位点的冃标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的^t陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。具体实施例方式实施例lTPMT基因SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE引物针对TPMT的三种常见SNP位点G238C，G460A和A719G，分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由"Tag+特异性引物序列"组成。ASPE引物序列如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>二、anti-tag序列包被的微球根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的六种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列SEQNO<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>选择的6种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5_10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5—10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH20配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n>3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)千扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5—10个T，在中国，T的合成技术比较成熟，成本相对较低。微球包被按常规步骤，具体过程如下分别取5Xl(f个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100翻l/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Diraethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02M的Tween-20洗涤一次，再用O.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10raraol/LTris(pH8.0)，l咖ol/LEDTA中，2-8'C避光保存。三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物目标检测的4种常见SNP位点TPMT的TPMT求2(G238C)、TPMT*3A(G460A/A719G)、TPMT^3B(G460A)和TPMT*3C(A719G)，涉及到3个单核苷酸多态性位点G238C，G460A和A719G。其中G238C位于Exon5,G460A位于Exon7，AH9G位于Exon10。利用Primer5.0设计三对引物(见表3)，分别扩增出三条具有SNP位点的目标序列。表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物SEQNO.基因外显子类型扩增引物19TPMTExon5G238C-Forward5'CTTTGAAACCCTATGAACCTG3，20G238C-Reverse5'CTTTTGTGGGGATATGGATAC3，21Exon7G460A--Forward5'GATTGTTGAAGTACCAGCATG3，1122G460A-Reverse5'TACTTACCATTTGCGATCACC3，23ExonlOA719G-Forwaxd5'CCCTGATGTCATTCTTCATAG3，24A719G-Reverse5'CCTCAAAAACATGTCAGTGTG3，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的lC存液。实施例2运用实施例1所述TPMT基因SNP检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):试剂来源终浓度每250ml的用量MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)SigmaM-29330.05M2.44g5MNaOHFisherSS256-500---5滴2XTm杂交缓冲液试剂来源终浓度每250ral的用量藩ris-HCl，p朋.0SigmaT30380.2M50ml5MNaClSigmaS51500.4M20mlTritonX-100SigmaT87870.16%0.4ml过滤后贮存于4'C。ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。一、样本的DNA提取参照AxyPr印全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA.二、待测样品的PCR扩增利用Primer5.0设计三对引物，多重PCR—步扩增出TPMT的外显子5、外显子7和外显子10共三条具有SNP位点的目标序列，产物大小分别为310bp、17化p、208bp。引物序列(SEQNO.19-24)见上述表4所示。首先配制多重PCR引物工作液分别各取SEQNO.19-24的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下IOX缓冲液(含Mg205uldNTP(各2.5,1/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL)6ul模板DNA(10ng/ul)1ulddH2033.5ul共50ulPCR扩增程序为:95'C3min;94°C20s，56°C30s，72。C30s，30个循环；72°ClOmin;4'C保存备用。三、PCR产物的酶切处理参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下1.取7.5ulPCR反应后的产物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37'C孵育15min。8(TC孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。首先配制混合的ASPE引物工作液分别各取G238Ci、G238Ci、G460Ai、G460A-m、A719Gi和A719G-m相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10隱ol/LTrisBuffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下IOX缓冲液2ulMgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)1ulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)1ul酶切处理的PCR扩增产物5ulddH2010.ul共20ulPCR程序为96'C2min;94°C30s，58°Clmin，72°C2min，30个循环；4'C保存备用。五、杂交反应1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的六种微球(微球浓度均为2.5X105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag),这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5'端的tag序列特异妙A5口口；2.分别取lul每种编号的微球于l.5ml的微量离心管中；3.微球于》10000g离心1-2min;4.弃去上清，微球重悬于100ul的2XTm杂交缓冲液中，涡旋混匀；5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH20;6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH20补足至50ul;7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95°C60s,37°C15min孵育杂交；8.杂交后的微球于^3000g离心2—5min;9.去上清，将微球重悬于75ul的lXTm杂交缓冲液中；10.微球于》3000g离心2—5min;11将微球重悬于75ul的lXTm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE);12.37。C孵育15min，于Lurainex仪器上检测。六、结果检测与数据分析反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10XPCR阴性对照MFI;2.NETMFI=样品MFI—PCR阴性对照MFI(NETMFI小于O的以O表示)；3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值突变比值=突变型NETMFI+(突变型NETMFI+野生型NETMFI)4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。使用本方法检测大量样本的TPMT基因多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子；30%-70%视为杂合子；80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的TPMT基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的TPMT基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出TPMT基因的SNP类型，且结果稳定可靠。表4样本检测结果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表5样本TMPT基因多态性分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>二、样品检测采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对血清样品1-10进行检测，检测结果如下(表中数据为检测荧光值)表7样本检测结果与基因多态性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>序列表<110〉广州益善生物技术有限公司<120〉TPMT基因SNP检测的特异性序列、液相芯片及方法<160〉24<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉24<212>腿〈213〉人工序列〈400〉1tcaattacttcactttaatccttt24<210〉2〈211〉24<212〉画<213>人工序列〈400>2aatcttactacaaatcctttcttt24〈210〉3<211>24〈212>DNA21〈213〉人工序列<400>3cttttcaaatcaatactcaacttt<210>4〈211〉24<212〉DNA〈213>人工序列<400>4caatttactcatatacatcacttt〈210>5〈211〉24〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉5ctetcttcatatactttatactaca<210〉6〈211〉24<212>腿<213〉人工序列〈400>6ctttcaattacaatactcattaca<210〉7<211>22〈212>廳〈213〉人工序列<400>7tgtatgattttatgcaggtttg22〈210〉8〈211〉22<212〉画<213>人工序列〈400>8tgtatgattttatgcaggtttc22<210>9〈211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈400>9acatga/tttgggatagaggag21〈210〉10〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉10acatgatttgggatagaggaa〈210〉11〈211〉24〈212>DNA<213〉人工序列<400〉11tcatttacttttctgtaagtagat<210>12〈211〉24〈212〉腿〈213>人工序列〈400〉12tcatttacttttctgtaagtagac〈210〉13<211>24〈212〉廳<213>人工序列〈400〉13a犯ggattaaagtgaagtaattga〈210〉142124242424<211>24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉14aaagaaaggatttgtagtaagatt24〈210〉15〈211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列<400>15aaagttgagtattgatttgaa_aa_g24〈210〉16<211>24〈212>謹<213>人工序列〈400>16aaagtgatgtatatgagtaaattg24〈210〉17<211>24<212>DNA〈213>人工序列<400〉17tgtagtataaagtatatgaagtag<210〉18<211〉24<212>腿<213>人工序列〈400〉18tgtaatgagtattgtaattgaaag2424<210〉19〈211〉21〈212〉腿<213>人工序列〈400>19ctttgaaaccctatgaacctg〈210〉20〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉20cttttgtggggatatggatac〈210〉21〈211>2126〈212>DNA<213>人工序列<400>21gattgttgaagtaccagcatg<210>22〈211>21<212〉DNA〈213>人工序列〈400〉22tacttaccatttgcgatcacc<210>23〈211〉21〈212>DNA<213〉人工序列<400>23ccctgatgtcattcttcatag21〈210〉24〈211〉21<212>腿〈213〉人工序列<400>24cctcaaaaacatgtcagtgtg权利要求1、一种TPMT基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1).针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物对，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，针对不同野生型和突变型的特异性引物序列分别选自SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、和/或SEQIDNO.11及SEQIDNO.12；所述tag序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.6中的序列；(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQIDNO.13～SEQIDNO.18中的序列；(3).用于扩增具有G238C、G460A和/或A719GSNP位点的TPMT基因目标序列的引物。2、根据权利要求1所述的TPMT基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对选自针对G238CSNP位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.7组成的序列，及由SEQIDNO.2和SEQIDN0.8组成的序列;针对G460ASNP位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.9组成的序列，及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.IO组成的序列;和/或针对A719GSNP位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.ll组成的序列，及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.12组成的序列。3、根据权利要求1所述的TPMT基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增用的引物包括有针对G238CSNP位点的SEQIDNO.19和SEQIDNO.20，针对G460ASNP位点的SEQIDN0.21和SEQIDNO.22，和/或针X寸A719GSNP位点的SEQIDNO.23和SEQIDNO.24。4.根据权利要求1一3任一项所述的TPMT基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。5.根据权利要求4所述的TPMT基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5—10个T。6.根据权利要求1所述的TPMT基因SNP检测液相芯片，其特征是，(1)所述野生型及突变型特异性ASPE引物对为针对G238CSNP位点的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.7组成的序列，及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.8组成的序列;针对G460ASNP位点的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.9组成的序列，及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.IO组成的序列；禾口针对A719GSNP位点的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.ll组成的序列，及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.12组成的序列;(2)分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列为SEQIDNO.13SEQIDNO.18中的序列;(3)所述扩增用的引物有针对G238CSNP位点的SEQIDNO.19和SEQIDNO.20，针对G460ASNP位点的SEQIDNO.21和SEQIDNO.22，和针对A719GSNP位点的SEQIDNO.23和SEQIDNO.24。7、一种使用权利要求1-6任一项所述液相芯片对TPMT基因SNP检测的方法，主要包括以下步骤(一)PCR扩增待测样品DNA;(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；(六)通过荧光检测仪检测。8.—种用于TPMT基因SNP检测的特异性引物序列，包括针对G238C野生型和突变型的SNP位点SEQIDN0.7和SEQIDNO.8;针对G460A野生型和突变型的SNP位点的SEQIDNO.9和SEQIDNO.10;和/或针对A719G野生型和突变型的SNP位点的SEQIDNO.ll和SEQIDNO.12。全文摘要本发明公开了TPMT基因SNP检测液相芯片、特异性引物和方法，所述液相芯片包括针对每种型别的突变位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物对、分别包被有特异的anti-tag序列的微球，和用于扩增具有TPMT基因G238C、G460A和/或A719GSNP位点的目标序列的引物。所制备的TPMT基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。所述检测方法步骤简单，3种突变位点可以一步检测中完成，操作方便，并且避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。文档编号C12Q1/68GK101671739SQ20091019315公开日2010年3月17日申请日期2009年10月19日优先权日2009年10月19日发明者何嘉英,杨惠夷,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司