专利名称：Psma6基因中一个用于猪肉产品dna溯源的新snp分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属食品安全领域，具体涉及PSMA6基因中一个用于猪肉产品DNA溯源的新 SNP分子标记。
背景技术：
肉产品追溯系统作为一种食品质量安全风险控制管理手段，在越来越多的国家中
得到应用，甚至一些国家以法规的形式明确规定不具备可追溯条件的肉产品禁止进入市
场。受我国饮食习惯的影响，猪肉是人们日常生活中最主要的肉产品，因此猪肉产品的安全
成为肉产品安全的重点。通过猪肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关
产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个
获取有效可靠信息的途径，更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，
为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，有助于社会的安定。 在我国的猪肉产品追溯体系中，主要使用的是标签溯源技术(物理方法)。如2004
年，上海在规模化养猪厂建立了 "电子档案"；2005年福建省开通了肉产品质量查询系统；
2008年，杭州建立了 "放心肉"的质量安全信息可追溯体系，同年北京市建立了畜禽产品追
溯系统，纳入14家生猪屠宰企业和所有牛羊肉家禽生产加工企业，使用的是IC卡和电子标
签(RFID)技术。国外肉产品追溯系统采用的是DNA溯源技术(生物学方法)。相比之下，
我国采用的标签溯源技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为
改换等缺点，而DNA溯源技术不受人为因素影响，结果准确，并且检测手段简单快捷等成为
目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术。 用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR 分子标记(微卫星标记)和SNP分子标记(单核苷酸多态性)。其中SNP是最简单的多态 形式，是由DNA序列中某个特定位点上的单个核苷酸发生变异而引起的序列多态性。但并 非所有的SNP标记都可以用作溯源，可以用于溯源的SNP标记至少具有以下特点(l)变异 度高，等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布差异小。 PSMA6基因是蛋白酶体亚家族的成员。泛素_蛋白酶体是一类重要的水解酶，通过 对底物蛋白进行泛醌化，为蛋白酶体识别降解，从而严格控制着细胞内蛋白质的质量，调节 蛋白的激活，失活，周转，数量，继而影响着机体一系列的生理反应和机能。Sjakste通过短 片段测序的方法，获得人PSMA6基因的基因组片段，并且确定其基因的基本结构。PSMA6基 因包含7个外显子，长度19kb。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种PSMA6基因中一个用于猪肉产品DNA溯 源的新SNP分子标记。本发明对猪PSMA6基因进行分离，并进行SNP寻找，并进一步进行了 变异度的筛选，以期获得可用于肉产品安全性溯源的分子标记。
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为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现 PSMA 6基因中一个用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记，是通过在6个猪品 种或品系的试验群体(共计145个体)中，通过克隆测序、序列分析比较，分析其PSMA6基 因的SNP位点等位基因的分布情况，进一步筛选获得本发明的用于猪肉产品DNA溯源的新 SNP分子标记。具体步骤如下 (1)在NCBI数据库中，以猪PSMA6基因的mRNA序列(NM_001139472)为模板设计 引物分离猪PSMA6基因的DNA片段，测序并分析。 所得PSMA6基因长628bp，其中包含完整的内含子2、内含子3和完整外显子2的 序列，部分外显子1和部分外显子3的序列。 (2)该PSMA6基因的序列如SEQ ID NO 1所示，其第21位碱基处有一个碱基突变 21C-21T，检测该碱基突变21C-21T的正、反向引物的DNA序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。采集6个品种和品系的耳组织样，145个个体。 (3)检测SNP标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP标记，并采 用PCR-BseLI-RFLP的方法对其进行检测。 本发明采用克隆子测序比较的方法检测到猪PSMA6基因基因组片段中存在的SNP 位点，并通过在试验猪群中进行SNP标记变异度的分析，获得一个新的可以用于猪肉产品 DNA溯源的SNP分子标记，该新SNP分子标记可应用于猪肉产品的安全性溯源。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。 实施例1 分子标记的查找 (1)引物设计在NCB数据库中，以猪PSMA6基因的mRNA序列(NM_001139472)为模板，使用 Primer 5. 0设计扩增引物，用于查找新SNP位点。
正向引物5' -GGTGGCCTTACATCAGTAGC-3'
反向引物5' -GCTGTCATTCCTGTCATCAC-3' PCR反应总体积为20 ii l，其中猪基因组DNA约lOOng，含1 X buffer (Promega)， 1. 5,1/L MgCl2， dNTP终浓度为150 ii mol/L，引物终浓度为0. 2 ii mol/L， 2U Taq DNA聚合 酶(Promega) 。 PCR扩增程序是94。C 4min，然后循环35次(94°C 30s，退火56°C 30s，72。C 延伸20s)，最后72t:延伸lOmin。 PCR反应产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)克隆测序分析将得到的PSMA6基因PCR产物按照以下方法进行克隆。
PCR产物的纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1. 5ml Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(华舜)纯化。 连接反应将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接反应总体积是10 iU，其 中包括5iU solution I，O. 5iU的T载体，2. 5iU的纯化PCR产物，最后加入2iU灭菌水
置4t:水浴过夜。 感受态细胞(Competent cells)购自天根生化科技有限公司。 转化无菌状态下取100 120 ill感受态细胞于1. 5ml Ependorf f管中，将5的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42t:热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出 后冰浴3 4min，加入400 y 1无抗生素的LB液体培养基，37。C平放lh后倒置培养。
菌落PCR鉴定经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37。C培养过夜，随机挑取多 个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。测序分析发现引物扩增的DNA序列长628bp， 该序列的21碱基处存在一个碱基突变(21C-21T)，通过分子生物学软件分析，发现21碱基 处的碱基突变导至文BseLI-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性。
(3)RFLP检测条件酶切反应体积是10 ii l，其中IXbuffer 10ii 1， PCR产物3 5iU，限制性内切酶BseLI为0. 5 iil (5U)，用H20补足10 yl， 37。C水浴4h，用10wt^的聚 丙烯酰铵凝胶检测酶切结果并记录基因型。T等位基因只有628bp —个片段，C等位基因有 602bp和21bp两个片段，这两个等位基因可组成三种基因型CC， CT， TT。
实施例2
等位基因的分布情况
(1)试验群体的设计 试验组采集小山猪(28)、通城猪(43头)、二花脸猪(26头)、长白(15头)、大白 (18头)和杜洛克(15头)个体的耳组织，提取DNA，共计145个DNA样本。试验群体目的 在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。 (2)基因型检测利用正向引物和反向引物扩增并BseLI-RFLP检测试验群体所有 的个体基因型。 (3)统计分析记录所有个体的基因型，并计算等位基因频率，结果见表1。 表1 PCR-RFLP-BseLI多态性在6猪品种或品系中的分布
品种个基因型基因频率体CCCTTTCT
小梅山2821610.85710.1429
通城猪43251530.75580.2442
二花脸2617720.78850.2115
0037]长白1510500.66670.3333
大白1812510,80060.1994
杜洛克159420.73330.2667 分析该SNP位点等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的 C等位基因频率占优势，但是等位基因间的频率差异并不是很大，可能与样本数目偏小有 关；而且品种或品系间，等位基因频率C和T的分布差异小，初步认为该SNP分子标记可以 作为猪肉产品安全性溯源的候选标记。 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参
5照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。附本发明中所涉及到的核苷酸/氨基酸序列表〈110〉上海市农业科学院〈120〉PSMA6基因中一个用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记〈160>3〈210>1〈211>628〈212>DNA〈213〉猪(Sus scrofa)〈220〉〈221>gene〈222〉 (1) . (628)〈223〉〈220〉<221>mutation〈222〉 (21)〈223>n = c或t〈220〉〈221>exon〈222>(1). . (69)〈223〉<220>〈221〉intron〈222>(70). . (545)〈223><220>〈221>exon〈222〉 (546) . (628)〈223〉〈400>1〈401〉ggt ggc ctt aca tea gta get gtc aga ggg aaa gac tgt gca gta attGly Gly Leu Thr Ser Val Ala Val Arg Gly Lys Asp Cys Ala Val lie15 10 15gtc 3C3 cag朋g朋a gte cctVal Thr Gin Lys Lys Val Pro20
gteagtegte ctgcctggat cattgteg朋tec朋3gc朋gagtttttcatgagtttgtt129caagagtgtg ttattat.atg ttaacattat ttttgctttg accctactttcctgtcatcc189朋g朋gtgtt cattgagaaa ctatggacag atgagctgag t3gacag朋ttgacatgttg249aaattcatgc tetgattgta agcacaatga gatttctaga tcttttgtgttcagggacct309cgaaacacac tttgatgagc tgtegttctt acccacagga aatgcatcat369agaaaacagt cgtgtgtggt ccatccctcc catttttttt ggtttteactgte朋朋tga429gcagaaaacc tttettetac agttcattgt teteagtcca tggtetttttttttetcact489acacagaggc ctgtgatttt ttttttttta attttcttga ttattttgttcatteg545gac aaa tta ctg g3t tcc age aca gtg act cbc tte ttc aag ate act593Asp Lys Leu Leu Asp Ser Ser Thr Val Thr His Leu Phe Lys lie Thr2530 35g朋朋c ate ggc tgt gtg atg 3C3 gga atg aca gc628Glu Asn lie Gly Cys Val Met Thr Gly Met Thr4045 50〈210>2
〈211>20〈212〉DNA〈213〉猪(Sus scrofa)〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) . (20)〈223〉〈400>2ggtggcctta atcagtagc20〈210>3<211>20〈212>DNA〈213〉猪(Sus scrofa)〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) . (22)〈223〉〈400>3gctgtcattc tgtcatcac20
权利要求
PSMA6基因中一个用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记，其特征在于，是在6个猪品种或品系的试验群体中，通过克隆测序、序列分析比较，分析其PSMA6基因的SNP位点等位基因的分布情况，进一步筛选获得所述用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记。
2. 根据权利要求1所述的新SNP分子标记，其特征在于，所述PSMA6基因长628bp，其中包含完整的内含子2、内含子3和完整外显子2的序列，部分外显子1和部分外显子3的序列。
3. 根据权利要求2所述的新SNP分子标记，其特征在于，所述PSMA6基因的序列如SEQID NO 1所示。
4. 根据权利要求3所述的新SNP分子标记，其特征在于，所述PSMA6基因的第21位碱基处有一碱基突变21C-21T。
5. 根据权利要求3所述的新SNP分子标记，其特征在于，检测所述碱基突变21C-21T的正、反向引物的DNA序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID N03所示。
6. 权利要求1所述的新SNP分子标记采用PCR-BseLI-RFLP方法检测。
全文摘要
本发明公开了PSMA6基因中一个用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记。在6个猪品种或品系的试验群体(共计145个个体)中，通过克隆测序、序列分析比较，分析其PSMA6基因的SNP位点等位基因的分布情况，进一步筛选获得本发明的用于猪肉产品DNA溯源的新SNP分子标记。所述PSMA6基因长628bp，其中包含完整的内含子2、内含子3和完整外显子2的序列，部分外显子1和部分外显子3的序列。其序列如SEQ ID NO 1所示，在其第21位碱基处有一个碱基突变21C-21T。本发明的新SNP分子标记可应用于猪肉产品的安全件溯源。
文档编号C12Q1/68GK101712993SQ200910200680
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者吴潇, 唐雪明, 朱宏, 王金斌, 蒋玲曦, 谭芙蓉, 赵凯, 陶世如 申请人:上海市农业科学院