专利名称：一种同步混菌发酵甘油制备丙酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种丙酸生物发酵法制备的方法，具体地说涉及一种同步混菌发酵甘
油制备丙酸的工艺流程和方法，以及两菌种混合培养的方法和技术。
背景技术：
丙酸及其衍生物是一类重要的工业原料，可以广泛应用于食品，医药，饲料等行业。丙酸及其盐如丙酸钙、丙酸锌、丙酸钾能有效地抑制霉菌、嗜氧芽孢杆菌，而且对人体基本无害，广泛应用在谷物、饲料和食品中，是良好的防腐保鲜剂。丙酸酯类是重要的溶剂和香料，可用于黄油、西洋酒以及冷食面包、冷饮和口香糖制造中。丙酸氯及丙酸酐是重要的农药、医药中间体，可用来生产VBe、抗癌药丙酸羟甲雄酮等。丙酸盐是大环内酯类抗生素如沙霉素、利福霉素、M-90等生物合成的重要前体。另外，丙酸还可用作电镀助剂、乳化剂和生产生物降解塑料等。随着农业、轻纺、食品、医药等工业的发展，对农药除草剂、涂料杀菌剂、食品保护剂及饲料添加剂等的需求量日益增加，丙酸需求量也在日益增加。2001年世界丙酸总产量约30. 45万吨，主要集中于美国、英国、德国、日本和南非等国。而我国丙酸生产与需求缺口非常大，主要依赖于进口 。
丙酸的生产方法有化学合成法和发酵法 化学合成法是以石油化工产品为原料，在高温高压条件下使用催化剂催化合成。微生物发酵法是丙酸菌在常温常压下利用农副产品等代谢产生丙酸。目前工业生产方法主要是化学合成法。在当前全世界面临环境污染、能源短缺的情况下，用微生物发酵法来大规模生产丙酸是一条值得探索的新途径。 在发酵法生产丙酸的工艺流程中，原料费用及后处理费用占据了成本的一大部分。而利用甘油为原料进行丙酸的发酵生产，不仅底物转化率高，而且副产物少，利于后处理提纯。此外，随着生物柴油的快速发展，作为副产物的甘油将成为一种稳定而且廉价的碳源。因此，使用生物柴油生产过程中产生的副产物甘油作为原料进行丙酸的发酵生产可大幅度降低生产成本，并且有更好的商业前景。 以甘油为原料进行丙酸的制备工艺中，有几个瓶颈制约着该项技术的应用。其一，菌体生长速率和发酵速率低，发酵周期长。其二，产物抑制，中等浓度的丙酸和乙酸就能抑制生产从而导致丙酸产量低。
发明内容
本发明的目的是提供一种由混菌发酵甘油制备丙酸的方法，通过利用菌体之间的相互作用，不仅提高了菌体浓度，而且增强了菌体对产物抑制的抗性，最终大大提高了丙酸 为实现上述目的，本发明提供的同步混菌发酵甘油制备丙酸的方法，采用厌氧菌
和兼性需氧菌两种菌株，在微氧或厌氧条件下发酵积累丙酸；其主要步骤为 1)兼性需氧菌接种于培养基上进行好氧培养，厌氧菌接种于培养基上进行厌氧培养； 2)将步骤1培养的兼性需氧菌接种于液体种子培养基上进行好氧培养；将步骤1培养的厌氧菌接种于液体种子培养基上进行厌氧培养； 3)将步骤2中培养的兼性需氧菌和厌氧菌的两种菌种的种子液同时加入发酵培养基中进行厌氧液态发酵制备丙酸； 其中，发酵培养基为步骤2中进行厌氧培养的液体种子培养基中加入甘油；
所述的方法中，厌氧菌是产丙酸丙酸杆菌1. 2225(Propionibacteri丽cidipropionici 1.2225)，兼性需氧菌是皱褶假丝酵母(Candida rugosa)。 所述的方法中，进行好氧培养的液体种子培养基为酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖，pH为6. 8-7.0 ;进行厌氧培养的液体种子培养基为胰酶大豆肉汤、酵母提取物、K2HP04、KH2P04， pH为6. 8-7. 0。 所述的方法中，步骤1中好氧培养条件是培养温度30-32t:，培养时间24-48小时；厌氧培养条件是培养温度30-32t:，培养时间48-72小时。 所述的方法中，步骤2中好氧培养条件是培养温度为30-32t:，培养时间18-24
小时；厌氧培养条件是培养温度30-32t:，培养时间36-48小时。 所述的方法中，步骤3的发酵培养基中，甘油的加入量为15-25/L。 所述的方法中，步骤3中兼性需氧菌和厌氧菌种子的总接种量为5-10% (v/v)，兼
性需氧菌和厌氧菌的加入比例为1-2.5 : l-2.5(w/w，以细胞干重计)，发酵温度3(TC，时间
7-10天。 所述的方法中，步骤3进行发酵后，采用气相色谱法(GC)测定丙酸含量。 本发明利用产丙酸丙酸杆菌和皱褶假丝酵母联合厌氧液体发酵甘油制备丙酸，该
方法利用菌体之间的相互作用，不仅提高了菌体浓度，而且增强了菌体对产物抑制的抗性，
最终大大提高了丙酸产量。
具体实施例方式
本发明所采用菌种分别为产丙酸丙酸杆菌和皱褶假丝酵母，并以YPD培养基作为皱褶假丝酵母的种子培养基，以TY培养基作为产丙酸丙酸杆菌的种子培养基；以TY培养基加入一定浓度的甘油作为发酵培养基。制备丙酸的步骤如下 1)将兼性需氧菌接种于斜面培养基上，进行好氧培养；将厌氧菌接种于斜面培养基上，进行厌氧培养； 2)将步骤1培养的皱褶假丝酵母接种于种子培养基上好氧培养；将步骤1培养的产丙酸丙酸杆菌接种于种子培养基上厌氧培养； 3)将发酵培养基装入发酵罐中，灭菌，将步骤2中两种菌的种子同时加入发酵罐中，进行厌氧液态发酵，制备丙酸。
具体地说，本发明提供的由同步混菌发酵甘油制备丙酸的方法如下
l)采用的菌种 产丙酸丙酸杆菌1. 2225(Propionibacteri咖acidipropionici 1. 2225)刍皮褶假丝酵母(Candida rugosa) 2)采用液体YPD培养基和TY培养基配制种子培养基其中YPD培养基配制为在
41L培养基中加入10g酵母提取物、10g蛋白胨、20g萄糖，pH调整至7. 0。 TY培养基配制为在1L培养基中加入5g胰酶大豆肉汤、10g酵母提取物、2.5g
K2HP04、1.5g KH2P04， pH调整至7. 0，通入N2 : H2 : C02 = 80 : 5 : 15以保持培养基厌氧
状态，12rC灭菌20分钟。培养基配制，接种，取样均在厌氧工作站进行操作。 3)配制液体发酵培养基 以TY培养基加入一定浓度的甘油作为发酵培养基。pH调整至7.0。 4)将产丙酸丙酸杆菌接种于斜面固体培养基上，厌氧培养48-72小时，培养温度
是30-32 。C ; 将皱褶假丝酵母接种于斜面固体培养基上，好氧培养24-48小时，培养温度为30-32 °C。 5)将步骤4培养的两株菌分别接种于50-100ml种子培养基，分别进行厌氧和好氧培养；皱褶假丝酵母好氧培养，培养温度为3(TC，培养时间18-24小时；产丙酸丙酸杆菌厌氧培养，培养温度30-32t:，培养时间36-48小时。 6)将发酵培养基装入发酵罐中，12rC灭菌20分钟。将上述两种菌的种子液，按总接种量5-10% (v/v)同时加入到液体发酵培养基中，两菌种加入比例为1-2.5 : 1-2. 5(w/w，以细胞干重计)，发酵温度3(TC，时间7-10天。
7)采用GC法测定丙酸含量。 本发明采用甘油为原料，产物单一，主要为丙酸，含有少量乙酸和丙醇，利于后处
理，可以大大降低生产成本。利用产丙酸丙酸杆菌和皱褶假丝酵母之间的协同增效作用，不
仅提高了生物量，而且降低了产物抑制从而大大提高了丙酸产量。本发明使用生物柴油生
产过程中产生的副产物甘油为原料进行丙酸的生物发酵法制备，对资源的再生利用及减少
石化产品使用和缓解环境压力具有重要意义。 下面结合实施例对本方明的方法作更进一步的说明。 实施例1 1、配制种子培养基 以TY培养基作为产丙酸丙酸杆菌的种子培养基，具体组成如下 在1L培养基中加入5g胰酶大豆肉汤，10g酵母提取物，2. 5gK2HP04，l. 5g KH2P04。
pH调整至7.o，通入N2 : h2 : co2 = 80 : 5 : 15以保持培养基厌氧状态，12rc灭菌20分
钟。培养基配制，接种，取样均在厌氧工作站进行操作。 以YPD培养基作为皱褶假丝酵母的种子培养基，具体组成如下 在1L培养基中加入10g酵母提取物，10g蛋白胨，20g葡萄糖。pH调整至7.0。 2、配制发酵培养基，TY培养基按20g/l的量加入甘油，pH为7. 0。 3、发酵工艺 1)将产丙酸丙酸杆菌接种于斜面固体培养基上，厌氧培养72小时，培养温度是30°C ;将皱褶假丝酵母接种于斜面固体培养基上，好氧培养48小时，培养温度为30°C。
2)将产丙酸丙酸杆菌接种于50ml的液体种子培养基，进行厌氧培养，培养温度3(TC，培养时间48小时；将皱褶假丝酵母接种于100ml的液体种子培养基，进行好氧培养，培养温度3(TC，培养时间24小时。 3)将发酵培养基2000ml装入发酵罐中，12rC灭菌20分钟。将上述两种菌种的种子液，按总接种量10% (v/v)同时加入发酵罐中，接种比例为1 : 2.5(w/w，以细胞干重
计)，进行厌氧液态发酵，发酵温度30°C ，时间10天，在发酵进行到96和168小时分两次补
加甘油，每1000ml发酵液补加20g甘油。每隔12小时取样一次，测定丙酸浓度。 4)采用GC法测定丙酸含量，以高纯氮气为载气，进样量O. 2iU，测定丙酸浓度。连
续发酵240小时，丙酸终浓度为33g/l。 实施例2 种子培养基配制同实施例1。
发酵培养基配制同实施例1 。 将发酵培养基2000ml装入发酵罐中，12rC灭菌20分钟。将上述两种菌种的种子液，按总接种量10% (v/v)同时加入发酵罐中，接种比例为2.5 : 1 (w/V，以细胞干重计)，进行厌氧液态发酵，发酵温度30°C，时间10天，在发酵进行到96和168小时分两次补加甘油，每1000ml发酵液补加20g甘油。每隔12小时取样一次，测定丙酸浓度。
检测丙酸浓度的方法如实施例1。连续发酵240小时，丙酸终浓度为27g/l。
权利要求
一种同步混菌发酵甘油制备丙酸的方法，采用厌氧菌和兼性需氧菌两种菌株，在厌氧条件下发酵积累丙酸；其主要步骤为1)兼性需氧菌接种于培养基上进行好氧培养，厌氧菌接种于培养基上进行厌氧培养；2)将步骤1培养的兼性需氧菌接种于种子培养基上进行好氧培养；将步骤1培养的厌氧菌接种于种子培养基上进行厌氧培养；3)将步骤2中培养的兼性需氧菌和厌氧菌的两种菌种的种子液同时加入发酵培养基中进行厌氧液态发酵制备丙酸；其中，发酵培养基为步骤2中进行厌氧培养的液体种子培养基中加入甘油；其中，所述厌氧菌是产丙酸丙酸杆菌1.2225(Propionibacteriumacidipropionici 1.2225)，兼性需氧菌是皱褶假丝酵母(Candida rugosa)。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，进行好氧培养的种子培养基为酵母提取物、蛋 白胨、葡萄糖，PH为6. 8-7. 0 ;进行厌氧培养的种子培养基为胰酶大豆肉汤、酵母提取物、 K2HP04、 KH2P04， pH为6. 8-7. 0。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中好氧培养条件是培养温度30-32°C ，培 养时间24-48小时；厌氧培养条件是培养温度30-32t:，培养时间48-72小时。
4. 根据权利要求l所述的方法，其中，步骤2中好氧培养条件是培养温度为30-32t:， 培养时间18-24小时；厌氧培养条件是在N2、 H2和C02的混合气体中，培养温度30-32°C， 培养时间36-48小时。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，混合气体^ : h2 : 0)2的体积比为80 : 5 : 15。
6. 根据权利要求l所述的方法，其中，步骤3的发酵培养基中，甘油的加入量为 20-60g/l。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3中兼性需氧菌和厌氧菌种子的总接种量 为体积比5-10%，兼性需氧菌和厌氧菌的重量比以细胞干重计为1-2. 5 : l-2.5，发酵温度 30。C，时间7-10天。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3进行发酵后，采用气相色谱法测定丙酸含
全文摘要
一种同步混菌发酵甘油制备丙酸的方法，其步骤为1)兼性需氧菌接种于培养基上进行好氧培养，厌氧菌接种于培养基上进行厌氧培养；2)将步骤1培养的兼性需氧菌接种于种子培养基上进行好氧培养；将步骤1培养的厌氧菌接种于种子培养基上进行厌氧培养；3)将步骤2中培养的兼性需氧菌和厌氧菌的两种菌种的种子液同时加入发酵培养基中进行厌氧液态发酵制备丙酸；其中，发酵培养基为步骤2中进行厌氧培养的液体种子培养基中加入甘油；其中，所述厌氧菌是产丙酸丙酸杆菌1.2225，兼性需氧菌是皱褶假丝酵母。
文档编号C12P7/52GK101705276SQ200910223508
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者刘寅, 张帆, 张永光, 张汝兵, 朱建航 申请人:青岛生物能源与过程研究所