专利名称：一种利用秸秆发酵生产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及利用纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶，将木
质纤维素酶解成葡萄糖和木酮糖，酵母利用葡萄糖和木酮糖作为碳源，发酵生产乙醇的方 法。
背景技术：
在研究纤维素发酵生产乙醇的过程中，为了防止糖积累和产物抑制酶解反应、提 高纤维素酶的催化水解效率，提出了同步糖化发酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)模式，受到了广泛的重视。在同步糖化发酵过程中，酶解产生的单糖被 酵母及时消化，系统内单糖浓度持续保持较低的水平，可达到消除葡萄糖等产物抑制酶解 的目的。而且，酶解和发酵过程同步完成可减少成本，在提高固液比反应和增大乙醇浓度方 面也比先糖化后发酵(S印arateHydrolysis and Fermentation, SHF)更具优越性。当玉米 秸秆不溶物含量为8%时，SSF工艺总乙醇产量比SHF工艺高13X。当预处理过程中产生 抑制剂时，SSF总乙醇产量增加，而SHF总乙醇产量却有所降低。 木质纤维素的主要成分为纤维素(35% 50%)、半纤维素(20% 35%)和木质
素(5% 30%)。充分利用木质纤维素的水解产物-木糖发酵生产乙醇，能使乙醇产量增
加25%。因此，发酵木糖生产乙醇的方法是高效利用生物质资源的关键技术之一。 目前利用基因工程技术构建了能代谢木糖的重组酿酒酵母。虽然工程菌株有较高
的木糖利用率，但在发酵过程中由于中间产物木糖醇的积累，代谢流不能很好地向下进行，
这已成为酿酒酵母木糖代谢工程菌生产乙醇的瓶颈。其主要原因是木糖还原酶和木糖醇脱
氢酶的辅酶分别倾向于NADra和NAD+。 一方面，这两个辅酶在酿酒酵母中不能直接转化，其
再生过程彼此独立，造成了细胞内辅酶氧化还原的不平衡；另一方面，在乙醇发酵的氧限制
条件下，酵母细胞内NADH积累，不能及时还原成木糖醇脱氢酶所需的辅酶NAD+，使得中间产
物木糖醇积累，从而影响乙醇的产率。 木糖是木质纤维素水解液中含量仅次于葡萄糖的单糖。酿酒酵母由于缺乏转化木 糖为木酮糖的酶系，不能直接利用木糖，但能利用其异构体木酮糖。 为了解决上述问题，本发明提供了一种以木质纤维素为原料生产乙醇的方法，本 发明在高效利用生物质资源、提高乙醇产量，以及节约成本等方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用秸秆发酵生产乙醇的方法，该方法利用纤维素酶、
木聚糖酶和木糖异构酶酶解木质纤维素，酶解产物经酿酒酵母发酵得到乙醇(见图1)。 本发明的方法包括如下步骤 1)用稀酸或碱溶液对秸秆进行预处理； 2)分离固相物质，用60°C的温水洗涤两次； 3)将固相物质放入发酵罐中，加入2 4倍蒸馏水，加热至100 12(TC保持20
340min，待温度降至5(TC时，加入酶制剂，搅拌； 4)按酶解液总体积的10% 15%加入0D6。。 为6 12的酵母种子液进行发酵。
5)分离与纯化乙醇。 其中，所述秸秆为玉米秸秆；所述固相物质含有木质纤维素，木质纤维素包括纤维 素、半纤维素和木质素； 步骤3)中所述酶制剂由纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶组成；每lg固相物质分 别加入20 30U纤维素酶、110 300U木聚糖酶、100 280U木糖异构酶；所述搅拌开始 的速度为100 120rpm/min，4 6h后提高到200 240rpm/min ;
步骤4)中所述酵母为酿酒酵母。 酶促反应为纤维素酶将纤维素酶解成葡萄糖，木聚糖酶将半纤维素酶解成为木 糖，木糖异构酶将木糖转变成木酮糖； 优选地，所述木聚糖酶将半纤维素酶解成为木糖，同时，所述木糖异构酶将木糖转 变成木酮糖； 所述纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶的酶促反应同步进行； 酵母直接代谢纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶的酶解产物葡萄糖和木酮糖； 纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶的酶促反应与酵母利用酶解产物发酵同步进行。 本发明的技术效果在于 1.木质纤维素在纤维素酶和木聚糖酶作用下水解成葡萄糖和木糖，木糖在木糖异 构酶的作用下生成木酮糖，酿酒酵母可直接利用酶解产物葡萄糖和木酮糖，发酵生成乙醇。
2.本发明使用酿酒酵母发酵生产乙醇，克服了基因工程重组酿酒酵母发酵生产乙 醇不稳定、木糖残留量高的不足。 3.本发明采用的木质纤维素同步糖化、异构化发酵生产乙醇的方法，能提高木糖 的利用效率、縮短发酵周期、提高乙醇产量，在高效利用生物质资源的同时，降低了乙醇的 生产成本。
图1为木质纤维素同步糖化、异构化发酵生产乙醇的流程图； 图2为木糖标准品的HPLC图； 图3为木酮糖标准品的HPLC图； 图4为木糖异构化为木酮糖试验的HPLC图； 图5为稀酸预处理后玉米秸秆同步糖化、木糖异构化发酵生产乙醇的分析图； 图6为碱预处理后玉米秸秆同步糖化、木糖异构化发酵生产乙醇的分析图； 图7为碱预处理后玉米秸秆同步糖化(不加木糖异构酶)生产乙醇的分析图。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在没有背 离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发 明的范围。
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若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
1.试药 木糖标准品(BIO BASIC INC.)，木酮糖标准品(BIO BASICINC.)，纤维素酶(夏盛
生物科技有限公司)，木聚糖酶(夏盛生物科技有限公司)，木糖异构酶(安徽中科大易元
生物技术有限公司)。 2.酿酒酵母种子液的培养基 培养基胰蛋白胨2g，酵母提取物lg，葡萄糖2g，加水至100mL，pH自然。121°〇高
压灭菌15min，4t:冷冻保存。 实施例l木糖的异构化试验 使用市售的木糖异构酶进行木糖转化木酮糖试验，整个反应总体积为IOL， 在120r/min搅拌下进行，反应体系为D-木糖30% (W/V) ， CoCl2 6H20 2X 10—4mol/L， MgS04*7H20 2X 10—3mol/L，加入木糖异构酶的量为106U/L。在pH 5. 0， 35。C条件下反应，12h 后取反应液进行处理。采用高效液相色谱法进行分析。 1.标准品溶液的配制分别取木糖标准品和木酮糖标准品各500mg，用双蒸水 (ddH20)溶解并定容至50ml 。 2.异构化反应液的处理将反应液以12， OOOrpm离心20min，取上清液超声脱气， 用O. 45iim有机相滤膜过滤。
3. HPLC的色谱条件为 色谱仪Agilent 1200HPLC(Agilent 1200色谱工作站)；色谱柱87H3离子交换 色谱柱；检测器示差折光检测器；流动相0. 005mol/L H2S04 ;流速0. 5ml/min ;柱温50°C ; 进样量20iU。 结果如图2、图3和图4所示，木糖异构酶催化木糖生成木酮糖的转化率为57%。
实施例2稀酸预处理后玉米秸秆同步糖化、木糖异构化发酵生产乙醇实验
1.玉米秸秆稀酸预处理 取干燥的玉米秸秆10kg，按固液比1 : 6的比例加水，再按1 : 2的比例加入硫 酸，加热至12(TC保持2h后离心，用6(TC的温水洗涤两次。取固相分析水份为63. 46%， 除水分外，干料中纤维素58. 64%，半纤维素4. 37%，木质素25. 21%，灰份4. 29%。
2.预处理后木质纤维素糖化、木糖异构化发酵生产乙醇实验
将上述预处理后的木质纤维素(干料)1. 5kg放入12L发酵罐中，加蒸馏水4. 5L， 加热至115t:保持20min，然后待温度降至50°C时，加入酶制剂，每lg上述干料加入20U纤 维素酶、110U木聚糖酶和IOOU木糖异构酶，开始酶解的搅拌速度为120rpm/min，4h后提高 到200rpm/min。 12h后将酶解液温度降至35°C ，按酶解液总体积的15%加入0D6。Qnm为6的 酿酒酵母种子液，同时加入O. 8%酵母粉、0. 5% (NH4)2S04、0. 2% MgS04 *7H20、0. 2% KH2P04。 每隔4h分别测定葡萄糖、木糖、木酮糖、乙醇的含量(见图5)。
实施例3碱预处理后玉米秸秆同步糖化、木糖异构化发酵生产乙醇实验
1.玉米秸秆的碱预处理 取干燥的玉米秸秆10kg，按固液比1 : 6的比例加水，再按重量比加入1.5% NaOH，加热至IO(TC保持lh后离心，用6(TC的温水洗涤两次。取固相分析水份68. 46%， 除水分外，干料中纤维素62.3%，半纤维素23.6%，木质素7. 2 % ，灰份4. 7 % 。
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2.预处理后木质纤维素糖化、木糖异构化发酵生产乙醇实验
将上述预处理后的木质纤维素(干料)1. 5kg放入12L发酵罐中，加蒸馏水4. 5L， 加热至115t:保持20min，待温度降至50°C时，加入酶制剂，每lg上述干料加入30U纤维素 酶、300U木聚糖酶和280U木糖异构酶，开始酶解的搅拌速度为120rpm/min，4h后提高到 200rpm/min。 12h后将酶解液温度降至35°C ，按酶解液总体积的10%加入0D6。Qnm为12的酿 酒酵母种子液，同时加入0. 8%酵母粉、0. 5% (NH4)2S04、0. 2% MgS04 7H20、0. 2% KH2P04。 每隔4h取样，分别测定葡萄糖、木糖、木酮糖、乙醇的含量(见图6)。
实施例4碱预处理后玉米秸秆同步糖化(不加木糖异构酶)生产乙醇实验
按实施例3的方法对玉米秸秆进行碱预处理，将1. 5kg预处理后的木质纤维素加 入到12L发酵罐中，加4. 5L蒸馏水，加热至115t:维持20min，然后将温度降至5(TC，每lg 处理后的木质纤维素加入30U纤维素酶、300U木聚糖酶，以120rpm/min的速度搅拌进行酶 解，4h后将酶解搅拌速度提高到200rpm/min。 12h后将酶解液的温度降至35 °C ，按酶解液总 体积的10%加入0D6。。 为12的酿酒酵母种子液，同时加入0. 8%酵母粉、0. 5% (NH4)2S04、 0. 2% MgS04 7H20、0. 2% KH2P04。每4h取样，分别测定葡萄糖、木糖、木酮糖和乙醇的含量 (见图7)。 由实施例3和实施例4可知，加入木糖异构酶后，木糖的转化率和乙醇的产量都相 对提高。 对软木材(玉米秸秆)生产乙醇的过程分析表明，同步糖化发酵(SSF)模式比先 糖化后发酵(SHF)模式更经济。实验表明SSF模式具有工艺简单、发酵时间短、设备投资省、 节约能耗等优点。
权利要求
一种利用作物秸秆发酵生产乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤1)用稀酸或碱溶液对秸秆进行预处理；2)分离固相物质，用60℃的温水洗涤两次；3)将固相物质放入发酵罐中，加入2～4倍蒸馏水，加热至100～120℃保持20～40min，待温度降至50℃时，加入酶制剂，搅拌；4)按酶解液总体积的10％～15％加入OD600nm为6～12的酵母种子液进行发酵；5)分离与纯化乙醇。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶制剂由纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶组成。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每lg固相物质加入20 30U纤维素酶。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每lg固相物质加入110 300U木聚糖酶。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每lg固相物质加入100 280U木糖异构酶。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述搅拌开始的速度为100 120rpm/min，4 6h后提高到200 240rpm/min。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述酵母为酿酒酵母。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述秸秆为玉米秸秆。
9. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶的酶促反应与酵母利用酶解产物发酵同步进行。
全文摘要
本发明提供了一种木质纤维素同步糖化、异构化发酵生产乙醇的方法。该方法利用纤维素酶、木聚糖酶和木糖异构酶酶解木质纤维素，酶解产物经发酵得到乙醇。本发明方法采用同步进行木质纤维素的糖化、异构化和发酵来生产乙醇，具有减少酶解产物对纤维素酶和木聚糖酶的负反馈抑制、提高酶解速度、缩短发酵周期、降低生产成本等优点。
文档编号C12P7/10GK101705255SQ20091025000
公开日2010年5月12日 申请日期2009年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者徐斌, 李荣杰, 段绪果, 胡长浩, 薛亮, 薛培俭 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司