专利名称：基于雀稗固氮菌的根际促生菌肥及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物肥料领域，涉及一种菌肥，同时还涉及该菌肥的生产方法，尤其涉 及一种对小麦类禾本科作物具有固氮、溶磷、促生作用的高效根际菌肥及其制备方法。
背景技术：
植物根际促生菌(PlantGrowth Promoting Rhizobacteria，简称 PGPR)是指自 由生活在土壤或定植于植物根表、根内或茎叶的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物 产量的有益微生物。通常指具有固氮、溶磷、产生植物激素、分泌抗生素和产生促进植物生 长生理活性物质等能力或至少具有其中之一能力的细菌。其可增加植物的植物量，提高植 物营养品质，诱导植物系统产生抗病性等诸多功效。PGPR是80年代发展起来的一种菌肥， 它应用面积较广，主要用于禾本科、蔬菜类，它能产生生长素、抑制病原菌、固氮和分解磷化 物，PGPR的作用不是单一的，接种大量优势有益细菌于作物根际，促生作用是综合的结果， 它并不是普通微肥某一种效应而是一种综合效应。作用机理分泌植物促生物质，有人从能 促进难溶性磷转化的50个分离物中，发现43个产生植物生长激素，29个产生赤霉素，45个 产生激动素类物质，在这些PGPR中还分泌多种维生素，细维生Bi、B6、H、B12等，还有的能 分泌氨基酸；促进出芽，调控土传病害。减轻土传病害、降低发生的次数。PGPR能产生铁载 体，它能对Fe3+具有超强络合力，能产生大量铁载体的根际细菌在与不能产生铁载体或产 量很小的有害微生物竞争铁素营养时将占优势，从而抑制有害微生物的生长繁殖，表现出 生物防治作用。目前，国内PGI^R菌的研究及相关生态菌肥的生产报道不多。国外，特别是印度、巴 基斯坦、巴西、美国、澳大利亚等国家做了广泛的研究，已有自己的PGI^R生态菌肥产品，同 时新的研究领域和新技术不断出现。因不同生境的植物根系、茎杆生存着特定的促生菌菌 株，因此我们只能借鉴国外的成功经验，从我国特定气候，生境中分离出PGH 菌株，以生产 出适合我国气候、生境的生物菌肥，同时要在理论方面作更是深入的研究。目前，国内豆科 植物生物肥料较多，但禾本科及其他非豆科植物生物肥料空缺。世界范围内禾本科作物种 植面积较大，具有重要的经济价值和生态功能。它们大多数都以氮、磷为主要的营养元素。 大量研究结果表明，PGI^R在小麦、玉米、水稻、甘蔗等禾本科植物根际得到分离，PGPR的研 究范围和内容也在不断扩展和深入。PGI^R特别是兼具固氮、溶磷、产生植物激素、分泌抗生 素于一身的菌种，是宝贵的生物资源，它们的开发利用将在生物菌肥的研制和禾本科植物 的研发中起到举足轻重的作用。故从市场需求及人们环保意识增强等方面考虑，生态菌肥 的研究及其开发具有重要的现实意义和广阔的发展前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是，提供一种具有固氮、溶磷、分泌促生植物激 素作用的菌肥，该肥料适应性强、性能稳定，具有固氮、溶磷、促生长等多种功能。同时，本发 明的目的还在于提供一种小麦禾本科作物用高效根际菌肥的制备方法。本发明通过如下技术措施实现菌株雀稗固氮菌的筛选1. 土样采集样品采自临沂地区小麦根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，低 温保存。2.培养基(I)LB培养基蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g,总体积1000ml (蒸馏 水补足)，PH 7. 0-7. 5 ；(2) NFM 培养基苹果酸 5g、K2PHO4 0. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、CaCl2 · 2H20 0. 02g、 NaCl 0. lg、NaMoO4 · 2H20 0. 002g、KOH 4. 5g, Bromothymol Blue(BTB 0.5 % )5ml、 BiotinelOug、Agar 2% (固体培养基)，总体积 1000ml (蒸馏水补足)，PH7. 0-7. 5 ；(3)CCM 培养基=KH2PO4 0. 2g、NaCl 0. lg、K2HPO4 0. 8g、Na2FeEDTA28mg、钼酸钠 25mg、酵母浸膏lOOmg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸钠0. 5ml、蒸馏水900ml。3.菌株筛选方法取样品lg，在无菌条件下用0. 85%生理盐水配成10-4、10_5、10-6三个稀释度，各稀 释度的悬浮液接种于盛有半固体NFM、CCM培养基的血清试管瓶中，28-30°C培养48h后，注 入ImlC2H2，再置于28-30°C培养24h_48h后，对有C2H4产生的样品以平板划线法将其分别再 培养于LB、NFM、CCM平板培养基上，置于28-30°C的培养箱中培养24-48h。然后分别挑取不 同的典型单个菌落，并接种于新准备的CCM、NFM血清小瓶中，测定其固氮活性。挑选出生长 快、圈大的菌落再分离纯化后，转斜面4°C保藏。4、菌株拮抗反应试验分别将培养纯化的菌株划线接种到盛有LB固体培养基的同一培养皿中，置于 28-30°C培养箱中，培养4-8d，并定期观察细菌交叉点的细菌生长情况，判定其有无抑制作 用。若该交叉点细菌不生长或生长差，说明这两种细菌共存时有拮抗作用；反之，若该交叉 点细菌生长良好，说明这两种细菌可共存，其间没有抑制作用。将相互之间不发生拮抗反应 的各个菌株悬浮液混合，否则单独使用。本发明提供了一种根际促生菌肥，是由每500_700g吸附剂中加入130_170ml菌悬 液制成，雀稗固氮菌活菌数0. 5X108-2X108cfU/g。前述的根际促生菌肥，优选的方案是所述的吸附剂为泥炭、活性碳、蛭石或其中 的混合物。所述的吸附剂优选为对PGPR菌株无毒、吸水保水性能好、pH值在6. 5-7. 0之间、 颗粒细小且易与种子粘着、不易结块、廉价的泥炭(干燥、粉碎至100目。)为接种载体。发明还还提供了根际促生菌肥的制备方法，包括以下步骤[1]菌悬液的制备(1)雀稗固氮菌斜面28-30°C，培养2-3d ；(2)摇瓶种子培养培养瓶盛培养基300ml，121°C灭菌20-30min，冷却后接入Iml 斜面菌株，置于28°C振荡培养，摇床转速125rpm/min，培养时间2_3d ；(3)扩大发酵300L发酵罐装入培养基150L，121°C灭菌后置于室温下2_3d，经检 查无污染后，接入15L种子培养液，置于28°C下的轨道摇床，转速为125rpm/min，培养时间 3-4d，所得即为菌悬液；
[2]吸附剂的处理将吸附剂干燥、粉碎，过100目筛，121°C灭菌2_3h，分装500g/袋备用；[3]菌肥接种和培养用已灭菌的量筒量取150ml菌悬液接种到500g灭菌的吸附剂中，在无菌操作下装 入塑料包装袋中立即封口，并将菌悬液与吸附剂混勻，再用灭菌针在塑料袋的四周及中间 扎几个孔，置于28-30°C培养6-7d，使雀稗固氮菌进一步繁殖，活菌数均在IO8个/g，包装后 常温下保存，即为根际促生菌肥。前述的制备方法，所述步骤(1)的培养基是蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、 Agar 20g，蒸馏水 1000ml，PH 7. 0-7. 5。前述的制备方法，所述步骤(2)和步骤(3)的培养基是糖浆10g、酵母膏5g、 CMC-Na5g、KH2PO4O. 5g、MgSO4O. 25g、蒸馏水 1000ml, PH 7. 0-7. 5。本发明与现有技术相比，具有下述突出的技术效果1、本发明采用特殊培养(LB、NFM、CCM)基法从小麦根际分离出具有固氮、分泌植 物生长类物质及容磷作用的固氮菌株；2、本发明菌株从我国小麦根际获得，适应性强、性能稳定，能产生多种小麦生长促 进物质，小麦植株生长健壮，产量、产值高；3、本发明产品，不含有无机化肥的成分，长期使用不会污染土壤，并可改良土壤。
具体实施例方式下面结合实施例、实验例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用蛋白胨、酵母膏、NaCl、K2PH04等常规药品皆为国产分析纯，均可从市 场购买配制。实施例1菌株雀稗固氮菌的筛选。1. 土样采集样品采自临沂地区小麦根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，低 温保存。2.培养基(I)LB培养基蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g,总体积1000ml (蒸馏 水补足)，PH 7. 0-7. 5 ；(2) NFM 培养基苹果酸 5g、K2PHO4 0. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、CaCl2 · 2H20 0. 02g、 NaCl 0. lg、NaMoO4 · 2H20 0. 002g、KOH 4. 5g, Bromothymol Blue(BTB 0.5 % )5ml、 BiotinelOug、Agar 2% (固体培养基)，总体积 1000ml (蒸馏水补足)，PH7. 0-7. 5 ；(3)CCM 培养基=KH2PO4 0. 2g、NaCl 0. lg、K2HPO4 0. 8g、Na2FeEDTA28mg、钼酸钠 25mg、酵母浸膏100mg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸钠0. 5ml、蒸馏水900ml。3.菌株筛选方法取样品lg，在无菌条件下用0. 85%生理盐水配成10-4、10_5、10-6三个稀释度，各稀 释度的悬浮液接种于盛有半固体NFM、CCM培养基的血清试管瓶中，28-30°C培养48h后，注 入ImlC2H2，再置于28-30°C培养24h_48h后，对有C2H4产生的样品以平板划线法将其分别再 培养于LB、NFM、CCM平板培养基上，置于28-30°C的培养箱中培养24-48h。然后分别挑取不同的典型单个菌落，并接种于新准备的CCM、NFM血清小瓶中，测定其固氮活性。挑选出生长 快、圈大的菌落再分离纯化后，转斜面4°C保藏。4、菌株拮抗反应试验分别将培养纯化的菌株划线接种到盛有LB固体培养基的同一培养皿中，置于 28-30°C培养箱中，培养4-8d，并定期观察细菌交叉点的细菌生长情况，判定其有无抑制作 用。若该交叉点细菌不生长或生长差，说明这两种细菌共存时有拮抗作用；反之，若该交叉 点细菌生长良好，说明这两种细菌可共存，其间没有抑制作用。将相互之间不发生拮抗反应 的各个菌株悬浮液混合，否则单独使用。实施例2根际促生菌肥的制作。本实施例根际促生菌肥是由500g吸附剂中加入130ml菌悬液制成，雀稗固氮菌活 菌数2X108cfu/g。吸附剂为泥炭，优选对PGI3R菌株无毒、吸水保水性能好、pH值在6. 5-7. 0 之间、颗粒细小且易与种子粘着、不易结块、廉价的泥炭(干燥、粉碎至100目。)该根际促生菌肥的制备方法，包括以下步骤[1]菌悬液的制备(1)雀稗固氮菌斜面28-30°C，培养2-3d ；(2)摇瓶种子培养培养瓶盛培养基300ml，121°C灭菌20-30min，冷却后接入Iml 斜面菌株，置于28°C振荡培养，摇床转速125rpm/min，培养时间2_3d ；(3)扩大发酵300L发酵罐装入培养基150L，121°C灭菌后置于室温下2_3d，经检 查无污染后，接入15L种子培养液，置于28°C下的轨道摇床，转速为125rpm/min，培养时间 3-4d，所得即为菌悬液；[2]吸附剂的处理将吸附剂干燥、粉碎，过100目筛，121°C灭菌2_3h，分装500g/袋备用；[3]菌肥接种和培养用已灭菌的量筒量取150ml菌悬液接种到500g灭菌的吸附剂中，在无菌操作下装 入塑料包装袋中立即封口，并将菌悬液与吸附剂混勻，再用灭菌针在塑料袋的四周及中间 扎几个孔，置于28-30°C培养6-7d，使雀稗固氮菌进一步繁殖，活菌数均在IO8个/g，包装后 常温下保存，即为根际促生菌肥。所述步骤(1)的培养基是蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g，蒸馏水 1000ml, PH 7. 0-7. 5。所述步骤⑵和步骤(3)的培养基是糖浆10g、酵母膏5g、CMC-Na5g、KH2P040. 5g、 MgSO4O. 25g、蒸溜水 1000ml，PH 7. 0-7. 5。实施例3根际促生菌肥的制作。本实施例根际促生菌肥是由700g吸附剂中加入 170ml菌悬液制成，雀稗固氮菌活菌数0.5X108cfu/g。吸附剂为活性碳。该根际促生菌肥 的制备方法同实施例2。实验例1实验地点山东临沭县；实验方法1、实验材料供试小麦品种农大 664;供试土壤试验前耕层(0-20cm) 土壤养分含量，有机质1. 57 %，全氮0. 099 %，全磷 0.072%，全钾 1.08% ；碱解氮 96. 37mg/kg，速效磷 21.40mg/kg，速效钾 107. 33mg/kg。2、实 验处理每个处理实验小区面积4亩，采用随机区组排列，每个处理设置3个重复。所有试 验小区的条件(如土壤、灌溉、肥料、生育期和行株距等田间管理措施以及光照等因素)一致，且符合当地科学的农业种植实践。试验设计为4个处理，其处理名称代号及内容如下①根际促生菌肥60斤/亩配施磷二铵10斤/亩；②根际促生菌肥40斤/亩配施磷二铵20斤/亩；③根际促生菌肥30斤/亩配施磷二铵30斤/亩；④磷二铵50斤/亩。各处理追肥一致，统一追施尿素40斤/亩。1、试验结果分析1. 1实施例2根际促生菌肥对小麦性状的影响表1不同处理对小麦主要经济性状的影响
权利要求
1.雀稗固氮菌，其特征是，通过下述步骤获得A.土样采集样品采自临沂地区小麦根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯 袋中，低温保存；B.培养基(1)LB培养基蛋白胨 10g、酵母膏 5g、NaCl 10g、Agar 20g，总体积 1000ml，pH 7. 0-7. 5 ；(2)NFM 培养基苹果酸 5g、K2PHO4O. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、CaCl2 · 2H20 0. 02g、NaCl 0. Ig^NaMoO4 ·2Η20 0. 002g>K0H 4. 5g>Bromothymol Blue 5ml、Biotine 10ug>Agar2%, 体积 1000ml, pH7. 0-7. 5 ；(3)CCM 培养基=KH2PO4O. 2g、NaCl 0. Ig^K2HPO4O. 8g、Na2FeEDTA28mg、钼酸钠 25mg、酵母 浸膏lOOmg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸钠0. 5ml、蒸馏水900ml ；C.菌株筛选方法取样品lg，在无菌条件下用0.85%生理盐水配成10_4、10_5、10_6三个 稀释度，各稀释度的悬浮液接种于盛有半固体NFM、CCM培养基的血清试管瓶中，28-30°C培 养48h后，注入ImlC2H2，再置于28_30°C培养24h_48h后，对有C2H4产生的样品以平板划线 法将其分别再培养于LB、NFM、CCM平板培养基上，置于28_30°C的培养箱中培养24_48h，然 后分别挑取不同的典型单个菌落，并接种于新准备的CCM、NFM血清小瓶中，测定其固氮活 性，挑选出生长快、圈大的菌落再分离纯化后，转斜面4°C保藏。
2.一种根际促生菌肥，其特征在于由每500-700g吸附剂中加入130-170ml菌悬液制 成，雀稗固氮菌活菌数0. 5X108-2X108CfU/g。
3.权利要求2所述的根际促生菌肥，其特征在于所述的吸附剂为泥炭、活性碳、蛭石 或它们的混合物。
4.权利要求3所述的根际促生菌肥，其特征在于所述的吸附剂为泥炭。
5.一种根际促生菌肥的制备方法，其特征在于包括以下步骤A.菌悬液的制备(1)雀稗固氮菌斜面28-30°C，培养2-3d；(2)摇瓶种子培养培养瓶盛培养基300ml，121°C灭菌20-30min，冷却后接入Iml斜面 菌株，置于28°C振荡培养，摇床转速125rpm/min，培养时间2_3d ；(3)扩大发酵300L发酵罐装入培养基150L，121°C灭菌后置于室温下2_3d，经检查无 污染后，接入15L种子培养液，置于28°C下的轨道摇床，转速为125rpm/min，培养时间3_4d， 所得即为菌悬液；B.吸附剂的处理将吸附剂干燥、粉碎，过100目筛，121°C灭菌2-3h，分装500g/袋备用；C.菌肥接种和培养用已灭菌的量筒量取150ml菌悬液接种到500g灭菌的吸附剂中， 在无菌操作下装入塑料包装袋中立即封口，并将菌悬液与吸附剂混勻，再用灭菌针在塑料 袋的四周及中间扎几个孔，置于28-30°C培养6-7d，使雀稗固氮菌进一步繁殖，活菌数均在 IO8个/g，包装后常温下保存，即为根际促生菌肥。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)的培养基是蛋白胨10g、酵 母膏 5g、NaCl 10g、Agar 20g，蒸馏水 1000ml，pH 7· 0_7· 5。
7.权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)的培养基是糖浆 10g、酵母膏 5g、CMC-Na5g、KH2PO4O. 5g、MgSO4O. 25g、蒸馏水 1000ml, pH 7. 0-7. 5。
全文摘要
本发明公开了一种根际促生菌肥，是由每500-700g吸附剂中加入130-170ml菌悬液制成，雀稗固氮菌活菌数0.5×108-2×108cfu/g。本发明产品，不含有无机化肥的成分，长期使用不会污染土壤，并可改良土壤。
文档编号C12R1/01GK102108335SQ200910256099
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者范玲超, 葛雨明, 陈宏坤 申请人:山东金正大生态工程股份有限公司