专利名称：一种硝基苯衍生物的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从海洋内生真菌的培养液中提取分离的硝基苯衍生物的制备方
法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
自从1929年从陆地微生物中制备出青霉素以来，微生物次级代谢产物已成为药 物的丰富来源，绝大多数临床应用的抗生素都来源于真菌和细菌。微生物中的活性次级代 谢产物还有其他的药用价值，如抗肿瘤，治疗心脑血管疾病，酶抑制剂等。海洋微生物的生 活环境与陆生微生物相比迥然不同，特别是高压、高盐度、贫营养、低温、低光照、缺氧等特 殊环境因素决定了海洋微生物发展出独特的代谢方式，也提供了陆生微生物无法提供的活 性次级代谢产物，海洋微生物被认为是高新颖性化学结构和药物先导化合物重要的潜在资 源，人们对从海洋微生物中寻找新的特效药物寄于极大希望。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从海洋内生真菌的培养液中提取分离的硝基苯衍生
物的制备方法和作为抗肿瘤药物的应用，它能满足现有技术的上述需求。 —种硝基苯衍生物的制备方法，其特征在于先在菌种培养基中对海洋内生真菌进
行菌种培养，再在发酵培养基中进行发酵培养，将发酵产生的液体过滤，除掉菌体，得到的
发酵液用有机溶剂萃取；所得萃取液浓縮后进行柱层析或薄层层析色谱分离，将所得洗脱
液浓縮，得无色晶体，即为硝基苯衍生物。 上述的硝基苯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。 本发明的硝基苯衍生物对人鼻咽癌KB和人鼻咽癌耐药株KBV200肿瘤细胞具有强 的抑制活性，可用作抗肿瘤药物，并且原料可以进行大规模生产，应用前景广阔。
具体实施例方式
制备本发明的化合物时，采取下述各步骤 (1)先在菌种培养基中对海洋内生真菌进行菌种培养，所用的培养基含有葡萄糖 1.0% (重量百分数，下同)、酵母膏0. 1%、蛋白胨0. 2%、琼脂1.0%、氯化钠0. 3%，其余为 水。使用时将上述培养基制成试管斜面，上述真菌菌株在3(TC下培养5天。
所述的菌种培养基含有葡萄糖O. 1% _5.0%、酵母膏0.01% _1%、蛋白胨 0.01% -1%、琼脂0. 1% -3. 0%、氯化钠0. 05% _5%，其余为水。培养温度为15-35t:，培 养时间为3-10天。 (2)上述培养所得的真菌菌种再在发酵培养基中进行发酵培养，所用的发酵培养 基含有葡萄糖1.0%、酵母膏0. 1%、蛋白胨0.2%、氯化钠0.3%，其余为水。真菌菌株于 28。C培养30天。 所述的发酵培养基含有葡萄糖O. 1% _5.0%、酵母膏0.01% _1%、蛋白胨0.01% _1%、氯化钠0.05% _5%，其余为水。培养温度为15-35"，培养时间为7-40天。 (3)硝基苯衍生物1，3-二氯甲基-2-甲基-5-硝基苯的提取分离 将前一步骤发酵产生的液体过滤，除去菌体，所得的发酵液用有机溶剂乙酸乙酯
萃取5次，将所得萃取液合并浓縮后，进行柱层析或薄层层析色谱分离，将所得洗脱液浓縮
得无色晶体，即为本发明制备的1， 3- 二氯甲基-2-甲基-5-硝基苯。 所述的有机溶剂乙酸乙酯可改用正丁醇或氯仿或二氯甲烷。 本实施例制得的1，3-二氯甲基-2_甲基-5-硝基苯的结构式为 本发明制备的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用
本发明的化合物的抗肿瘤活性试验 将对数增长期的人鼻咽癌KB和人鼻咽癌耐药株KBV200肿瘤细胞分别制备成靶 细胞悬液。取96孔培养板，每孔加入190ii L、含有3. OXl(f个上述靶细胞的悬液，恒温培 养24h后，加入lOyL含不同浓度测试样品的培养基，对照组加等体积的含10%胎牛血清 (FBS)的RPMI-1640培养液。置37°C、5% C02条件下培养68h，弃上清液，直接于光学显微 镜下观察细胞形态。然后按10 y L/孔加入3-(4， 5- 二甲基-2-噻唑)-2， 5- 二苯基溴化四 唑(MTT)液，继续培养4h，弃去上清液。加入二甲基亚砜(DMSO) 100 y L/孔，吹打，使样品充 分溶解，用酶标仪以试验波长为570nm、参比波长为450nm测定光密度OD值。再按
杀伤率=(对照孔OD值-药物孔OD值)/对照孔OD值
计算杀伤率，绘制剂量反应回归曲线，计算半数杀伤浓度IC5。。
实验表明，本发明制备的1，3-二氯甲基-2_甲基-5-硝基苯对人鼻咽癌KB和人 鼻咽癌耐药株KBV200细胞具有明显的抑制活性，其IC5。值分别为1. 57ii g/mL和2. 67 y g/ mL，可用作抗肿瘤药物，并且原料可以进行大规模生产，应用前景广阔。
权利要求
一种硝基苯衍生物的制备方法，其特征在于先在菌种培养基中对海洋内生真菌进行菌种培养，再在发酵培养基中进行发酵培养，将发酵产生的液体过滤，除掉菌体，得到的发酵液用有机溶剂萃取；所得萃取液浓缩后进行柱层析或薄层层析色谱分离，将所得洗脱液浓缩，得无色晶体，即为硝基苯衍生物。
2. 如权利要求l所述的制备方法，其特征在于所述的菌种培养基含有葡萄糖 0. 1 % -5. 0%、酵母膏0.01 % -1 %、蛋白胨0.01 % -1 %、琼脂0. 1 % 3. 0%、氯化钠 0. 05% _5%，其余为水。
3. 如权利要求l所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基含有葡萄糖 0. 1% -5. 0%、酵母膏0.01% _1%、蛋白胨0. 01% _1%、氯化钠0. 05% _5%，其余为水。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、氯 仿或二氯甲烷。
5. 权利要求1所述的硝基苯衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从海洋内生真菌的培养液中提取分离的硝基苯衍生物的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。制备时先在菌种培养基中对海洋内生真菌进行菌种培养，再在发酵培养基中进行发酵培养，将发酵产生的液体过滤，除掉菌体，所得发酵液用有机溶剂萃取；所得萃取液浓缩后进行柱层析或薄层层析色谱分离，将所得洗脱液浓缩，得无色晶体，即为硝基苯衍生物。本发明的硝基苯衍生物对人鼻咽癌KB和人鼻咽癌耐药株KBV200肿瘤细胞具有强的抑制活性，可用作抗肿瘤药物，并且原料可以进行大规模生产，应用前景广阔。
文档编号C12P13/00GK101768612SQ200910256558
公开日2010年7月7日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者佘志刚, 林永成, 王长云, 邵长伦, 魏美燕 申请人:中国海洋大学