专利名称：Tt1基因在提高微生物耐酸碱性中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及TTl基因在提高微生物耐酸碱性中的用途。
背景技术：
环境中的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数即PH值来表示。环境中的pH值对微 生物的生命活动影响很大，主要作用在于由于pH的变化引起微生物体表面的电荷变化，进而影响微生物对营养物的吸收；pH除了对微生物细胞有直接影响外，还可以影响培养基中有机化合物的离子化作 用，从而对微生物有间接影响，因为多数非离子状态化合物比离子状态化合物更容易渗入 细胞；酶只有在最适宜的PH值时才能发挥最大活性，不适宜的PH值使酶的活性降低，进 而影响微生物细胞内的生物化学过程；过高或过低的PH都降低微生物对高温的抵抗能力。每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。在最适范围内酶活性最高，如果其 他条件适合，微生物的生长速率也最高。大多数细菌、藻类和原生动物的最适PH为6. 5 7. 5，在pH 4 10之间也可以生长；放线菌一般在微碱性即pH7. 5 8最适合；酵母菌、霉 菌则适合于PH5 6的酸性环境，但生存范围在pHl. 5 10之间。有些细菌甚至可在强酸 性或强碱性环境中生活。微生物在基质中生长，代谢作用会改变基质中氢离子浓度。随着环境PH值的不断 变化，微生物生长受阻，当超过最低或最高PH值时，将引起微生物的死亡。同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也 不同。在发酵工业中，控制PH值尤其重要，例如Aspergillus niger在pH2 2. 5范围时 有利于合成柠檬酸，当在PH2. 5 6. 5范围内时以菌体生长为主，而在pH7. 0时，则以合成 草酸为主。丙酮丁醇梭菌在PH5. 5 7. 0范围时，以菌体生长为主，而在pH4. 3 5. 3范围 内才进行丙酮丁醇发酵。同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如黑曲霉pH值 为2 3时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少 量柠檬酸。随着分子生物技术的迅速发展和基因克隆技术的不断完善，因工程研究正向纵深 发展，培育出抗性微生物品种也是一个可行之道，其关键是寻找到有效的抗性基因。在申请 人之前递交的中国专利申请200810045667. 8中记载了分离自油菜的新基因，命名为TT1。本领域需要开发出能够提高微生物抗酸碱性的备选基因，以及运用基因工程技术 提高微生物抗酸碱性的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为提高微生物抗酸碱性的转基因技术领域提供一种 新的有效选择。
本发明解决该技术问题的技术方案是提供了 TTl基因在提高微生物耐酸碱性中 的用途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；或(2)在(1)中的核苷酸序列经过取 代、缺失或添加一个或几个核苷酸所得的衍生序列，且该衍生序列与SEQ ID NO :1的序列编 码功能相同的多肽。本发明解同时提供了 TTl基因编码的多肽在提高微生物耐酸碱性中的用途。上述 TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过 取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码 功能相同的多肽。能提高微生物耐酸碱性。本发明还提供了一种培育抗酸碱微生物的方法。该方法包括以下步骤(1)将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TTl基因的重组 载体；(2)将步骤(1)中的重组载体转入微生物；(3)经筛选获得转化微生物，然后将转化微生物培育成转基因耐酸碱株系。本发明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，该 基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法，筛选到油菜中 的一个EST序列，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE的方法获得序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。然后根据SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列设计一对PCR引物，从油 菜cDNA中扩增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。在本发明中，“在SEQ ID NO=I中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO :1所编码的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同 氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO 1 同源性低至约89%的简并序列也能编码出SEQ ID NO :1所述的序列。另外“在SEQ ID NO 1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度 严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO :1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该 术语还包括与SEQ ID NO :1中的核苷酸序列的同源性至少80%，较佳地至少89%，更佳地 至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高微生物的耐酸 碱性。该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO :1相同功能的蛋白的SEQ ID NO=I 中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1 90个，较佳地1 60个，更佳地1 20个，最佳地1 10个)核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为 10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其编码的 多肽也能提高微生物的耐酸碱性本发明所述重组载体，是将TTl基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域
4已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如PBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上述重组质粒转化宿主微生物，筛选获得转化微生物及其后代。本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况即线性DNA序列的某些部分能够 影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽 的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ；如果启动子控制序 列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位 置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前 导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明的有益效果在于本发明提供了 TTl基因在提高微生物耐酸碱性方面的用 途，在本发明的实施例中也通过实验证明转入了 TTl基因并过表达的微生物在较高和较低 PH值环境下其生存能力有了明显提高，证明了 TTl基因能有效的提高微生物的耐酸碱性。 本发明培育耐酸碱微生物的方法也简便而有效，为提高微生物耐酸碱性提供了新的有效选 择，具有好的应用前景。
图1、pH4. 0，37°C转TTl基因大肠杆菌和非转基因大肠杆菌的生长情况。纵坐标 为0D600值，横坐标为培养时间。图 2、ρΗ4· 0、5· 5、7· 0、8· 5,10. 0，37°C，14h，转 TTl 基因(T)和非转基因大肠杆菌 (C)的生长情况。
具体实施例方式
下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的 常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施 例中，所用载体PET28，pGEX-2T，pGEM-T购自于Qiagen公司，菌株BL21购自于Qiagen公 司，菌株EHA105、载体pBI121购自于Clontech公司。其余化学试剂均为市售分析纯。下述实施例中，“SEQ ID NO 1”单独出现时，本领域技术人员可理解1其为“SEQ IDNO 1所示核苷酸序列”的简称，实施例一TTl基因的克隆及获取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方 法(见Clontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID N0:3所示)， 再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE (见Takara公司所公开的资料)的方法获得本发明 所述提高微生物耐酸碱性的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根据SEQ ID NO :1所示核苷酸序列设计引物，上游引物(SEQID NO 5) :5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO 6) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下
1. 95°C 4min (预变性)2. 95°C 30s (变性)3. 53°C 30s (复性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2 4步骤循环30次6. 72 °C 5min (终延伸)7.4°C 保存。对PCR产物纯化(按Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒说明书操作)，经测序验证， 得到序列SEQ ID NO 1的基因片段。实施例二、过表达TTl基因的微生物的制备根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列设计引物，上游引物(SEQID NO 7) :5，-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO 8) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，PCR程序如下1. 95°C 4min (预变性)2. 95°C 30s (变性)3. 53°C 30s (复性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2-4步骤循环30次6. 72 °C 5min (终延伸)7.4°C 保存。对PCR产物纯化(见Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒说明书)，然后用BamHl与 Sacl酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点BamHl与Sacl)，获含SEQ ID NO :1的 过量表达重组质粒。将重组质粒转化E. coli，涂布于含Amp的LB固体培养基上。经测序验 证，得到含重组质粒的E. coli pET28菌株。实施例三转TTl基因微生物在各种PH条件下的生长实验配制培养基配制LB液体培养基，加入抗生素Kan 50ug/ml，Cam 50ug/ml及 0. ImMIPTG后，分装，分别调pH至4. 0,5. 5,7. 0,8. 5、10. 0后再分装试管，每种pH装2管，每 管5ml，待用。制备细菌悬液取转TTl基因和非转基因大肠杆菌单菌落37°C过夜活化。滴加供试菌在各pH水平的每管LB液体培养基中接入活化菌液0. 05ml，摇勻后 振荡培养(370C，225rpm，14h)。培养与观察37°C培养14h后观察结果。以目测来判断转TTl基因大肠杆菌在各 档PH条件下的生长情况(以“_”表示不生长，“ + ”表示稍有生长，“++”表示生长好，“+++” 表示高浓度菌液)，结果见图2。同时定时多次测试OD值，用以绘制不同pH值下的生长曲 线，结果见图1。结果发现转有TTl耐热基因的大肠杆菌比非转基因的大肠杆菌有较高的酸碱耐 受性。正常pH条件下(pH7.0)，转TTl基因(T)和非转基因(C)的生长情况基本相同，如图可见，菌液浓度基本一致。而在酸性条件下，转TTl基因(T)和非转基因(C)的生长情况出 现差异，如图可见，PH5. 5时，转TTl基因(T)菌液浓度较高，非转基因(C)菌液浓度较低； PH4.0时，转TTl基因(T)菌液浓度较高，非转基因(C)细菌几乎不生长。而在碱性性条件 下，转TTl基因(T)和非转基因(C)的生长情况也存在差异，如图可见，pH8. 5时，转TTl基 因(T)菌液浓度较高，非转基因(C)菌液浓度较低；pHIO时，转TTl基因(T)菌液浓度较高， 非转基因(C)细菌几乎不生长。定时多次对37°C、pH4. 0条件下，转TTl基因大肠杆菌和非转基因大肠杆菌的生长 情况进行测定(北京普析通仪器公司TU-1800型紫外分光光度计)，OD值越大，表明菌液浓 度越大，如图可见，随时间变化，转TTl基因大肠杆菌的生长曲线斜率明显大于非转TTl基 因大肠杆菌，说明转TTl基因大肠杆菌的生长速度明显大于非转TTl基因大肠杆菌。实施例四TTl基因提高微生物耐酸碱性的初步机理研究本发明使用宝生物工程(大连)有限公司销售的E. coli CHIP Version 2. O基因 芯片，按其说书进行操作(基因筛选标准见表1)，对过表达TTl基因的大肠杆菌与空白对照 的大肠杆菌的基因组表达进行比较，以初步探讨TTl基因提高耐酸碱性的机理。参照组转入空pET28a的大肠杆菌(Cy3)，实验组TTl-pET28a (Cy5)表1基因筛选标准
权利要求
TT1基因在提高微生物耐酸碱性中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因编码的多肽在提高微生物耐酸碱性中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码功能相同或相似的多肽。
5.一种培育耐酸碱微生物的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TTl基因的重组载体；(2)将步骤(1)中的重组载体转入微生物；(3)经筛选获得转化微生物，然后将转化微生物培育成转基因耐酸碱株系。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码功能相同或相似的多肽。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高微生物耐酸碱性中的用途。本发明要解决的技术问题是为提高微生物抗酸碱性的转基因技术领域提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高微生物抗酸碱性方面的用途，经实验证明转入了TT1基因并过表达的微生物在较高和较低pH值环境下其生存能力有了明显提高，证明了TT1基因能有效的提高微生物的耐酸碱性。本发明培育耐酸碱微生物的方法也简便而有效，为提高微生物耐酸碱性提供了新的有效选择，具有好的应用前景。
文档编号C12N15/70GK101962653SQ200910304708
公开日2011年2月2日 申请日期2009年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者杨毅 申请人:四川贝安迪生物基因工程有限公司