专利名称：：基于srap标记的茄子亲缘关系的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种农作物育种
技术领域：
的检测方法，具体是一种基于SRAP(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism,序列相关扩增多态性)标记的茄子亲缘关系的检测方法。
背景技术：
：在农业生产中与人类经济生活密切相关的绝大多数重要农艺性状是数量性状，这些性状呈连续变异，由大量的、效应微小并且可加的基因控制，并且易受环境因素的影响。这些性状由于存在很小的差异，在亲本选配时通常凭借育种学家的田间观察，这在很大程度上限制了作物新品种选育。而分子标记技术的发明有助于理清育种材料之间的亲缘关系，大大推进了育种进程。人类遗传学家D.R.L.Botstein等于1980年首先提出了RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性片段长度多态性)技术即通过限制性内切酶酶切基因组DNA，然后利用同位素标记的探针与酶切产物杂交来揭示其DNA多态性。1985年，聚酶链式反应(PCR)技术的诞生，使直接体外扩增DNA以检测其多态性成为可能。随后基于这两种技术的新型分子标记不断涌现如RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(amplifiedfragmentslengthpolymorphism,扩增片段长度多态性)、SSR(simplesequencer印eats，简单序列重复)以及SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性)。但研究表明RAPD标记需要的DNA量少，分析程序简单，但为显性标记，不能区分纯合与杂合型，且重复性差，在实际应用中也存在一定困难；RFLP标记存在需要DNA样品量大，操作程序繁琐和多态性检出率低的缺点；SSR属共显性标记，可靠性高，重演性好，分辨力强，但茄子上已经开发的SSR标记数量较少。SRAP技术由Li和Quiros于2001年发明的基于PCR的双引物分子标记系统。该技术针对基因外显子富含GC，内含子富含AT的特点，进行特殊的引物设计。其中，正向引物对外显子进行特异扩增，反向引物对内含子区域和启动子区域进行特异扩增。由于外显子序列在不同个体中通常是保守的，由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含AT的区域序列通常见于启动子和内含子中，从而使得扩增片段呈现多态性。正向引物5'端为一段14碱基的核心序列组成，其中前10个碱基为"填充"序列(fillersequence)，无任何特异组成，接着为CCGG序列，随CCGG之后为3个选择性碱基，选择性碱基的变化与相同核心序列组合成一套正向引物。反向引物的组成与正向引物类似，但"填充"序列后连接的为AATT;AATT序列后为3个选择性可变碱基，位于引物3'端。由于该方法扩增片段是保守的开放阅读框架(openreadingframe)区域，而且茄子遗传基础非常狭窄，于是Li，G和S皿，Z.D等开发了更多的SRAP引物。由于SRAP技术具有简单、高效、高共显性、重复性高、易测序等优点，现在已经用于甘蓝、西葫芦、野牛草、棉花等的遗传图谱构建和遗传亲缘关系分析。经对现有技术的文献检索发现，Karihaloo，J.L等在《TheoreticalandAppliedGenetics》(理论与应用遗4传学)1995年第6期767770页发表了题为《RandomamplifiedpolymorphicDNAvariationintheeggplant,SolariummelongenaL(Solanaceae)》(禾U用RAPD技术检领lj茄子变异)一文，文中评述22对RAPD引物中一共扩增出130条条带，但是只有4条在栽培种中存在差异，由此说明RAPD技术在检测茄子尤其是栽培种的多态性较差；Mace，E.S等在《TheoreticalandAppliedGenetics》(理论与应用遗传学)1999年第34期626633页发表了题为《AFLPanalysisofgeneticrelationshipsamongthecultivatedeggplant,Sola皿mmelongenaL，andwildrelatives(Solanaceae)》(莉子栽培种及野生种遗传关系AFLP分析)一文，文中评述AFLP是一种有效的评价遗传亲缘关系的工具，但是AFLP技术对模板DNA要求较高，成本较高，操作步骤繁琐，不利于在实践中应用；Stagel，A等在《BMCGenomics》(BMC基因组学)2008年第7期357370页发表了题为《Gene-basedmicrosatellitedevelopmentformappingandphylogenystudiesineggplant》(为茄子图谱与系统发生学研究开发基于基因的微卫星标记)一文，作者设计了50对引物，其中有39对可以扩增出产物，但是只有11对可以在栽培种呈现多态性。由于从网上可以获得的EST序列很少，通常设计大量SSR引物需要构建基因组文库，并对每个克隆进行测序，尽管操作简单，但是耗费成本较高，不利于推广。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法。本发明的方法简单易行，成本低，效率高，每个SRAP引物在栽培种中平均检测出0.75个多态位点。本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤步骤一，提取茄子的DNA;步骤二，SRAP-PCR扩增，得到扩增产物；步骤三，对扩增产物电泳，得电泳凝胶；步骤四，对电泳凝胶进行银染显色；步骤五，对电泳结果结合形态性状和系谱关系来区分不同品种茄子间的亲缘关系。所述的结合形态性状和系谱关系来区分，是指如果这两者相同，则是同一种材料，或来自于同一祖先，反之，则没有亲缘关系。此方法可以非常清晰和直观地说明各品系之间的亲缘关系远近步骤二中，所述SRAP-PCR扩增具体为采用lOiiL反应体系进行SRAP扩增，其中，10iiL反应体系具体为2.Ommol*L—'MgCl^200iimol*L—MNTPs，0.5iimol*L—1引物，Taq聚合酶0.5U，4050ng模板DNA，用重蒸水调整终体积至10yL，反应混合物用20yL石蜡油覆盖；PCR扩增程序为94°C3分钟；94°C45秒，35°C45秒，72°C1分钟，5个循环；94°C45秒，50°C45秒，72°C1分钟，35个循环；最后72°C7分钟。步骤二中，所述SRAP-PCR扩增所用引物选自以下引物组合中的多种5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明的方法简单易行，成本低，效率高，每个SRAP引物在栽培种中平均检测出0.75个多态位点。图1为实施例1中15种不同茄子品系亲缘关系的聚类分析图2为实施例2中15种不同茄子品系亲缘关系的聚类分析图3为实施例3中15种不同茄子品系亲缘关系的聚类分析图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中涉及到的茄子品种均可以通过公开的市售渠道获得，并均在已经公开的期刊文献中记载。实施例1以15份茄子品系为试验材料，具体如表1所示。培养如下选用55t:温水浸种15分钟；然后转入3(TC的常温水中继续浸泡810小时。将浸过的种子用干净的纱布包好，放于3(TC光照培养箱中黑暗中催芽。待34天后，见7080%的种子破嘴时可停止催芽，播到由草炭、蛭石及有机肥(体积比4:4:1)混合的基质中，浇透水后打0.5cm深的孔，将种子播到孔中，然后覆O.5cm厚的草炭。用黑色膜封严后置于3(TC左右的苗床上，45天后茄子种子出土，然后转到日温25°C，夜温18°C的人工气候室内培养2周，等两叶一心时取茄子真叶提取DNA。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>步骤一，DNA的提取基因组DNA提取和纯化参照CTAB方法。提取后的DNA稀释到20ngyL，4。C保存。步骤二，SRAP-PCR扩增采用10iiL反应体系进行SRAP扩增2.OmmolL—1MgCl2(氯化镁)，200iimolL—MNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)，0.5iimo1L—1弓|物，Taq聚合酶0.5U，4050ng模板DNA，用重蒸水调整终体积至10yL，反应混合物用20yL石蜡油覆盖。PCR扩增程序为94t:预变性3分钟；94t:变性45秒，35。C复性45秒，72。C延伸1分钟，5个循环；94°C变性45秒，5(TC复性45秒，72t:延伸1分钟，35个循环；最后72"C延伸7分钟。所用试剂25,1L—1MgCl2，10,1L—1dNTP，5UiiL—1Taq聚合酶、引物及电泳所用试剂，均购自上海生物工程公司。SRAP-PCR扩增中，采用的引物具体为以下组合，见表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中，所述引物具体如表3所示表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>步骤三，电泳PCR扩增产物通过6%的变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离。扩增产物与上样缓冲液l:1体积混合，变性之后加于胶板上样孔，在60W的恒功率下电泳。步骤四，银染显色(1)固定将带胶的玻板放入盛有2L新配制的0.5%的冰醋酸和10%无水乙醇混合液的固定盒中，在摇床上轻摇20分钟，直至胶面上二甲苯氰颜色全部褪掉；(2)水洗放到盛有蒸馏水的水洗盒中，轻摇3分钟；(3)银染水洗完毕，放入盛有2L0.2X的AgN03染色液的染色盒中，轻摇30分钟；(4)事先配制2L1.5%NaOH和0.5%甲醛的显影液，摇匀待用；(5)再水洗从染色盒中取出胶板，放到水洗盒中清洗，时间不超过10秒。(6)显影水洗后迅速将胶板放入显影盒中显影，直至出现清晰的条带；(7)定影最后用2L0.75%无水化20)3定影液定影。取出胶板，清水冲洗，银染结束。步骤五，聚类分析结果13对引物组合总共产生62条差异条带。将电泳图谱上同一扩增位点上有带记录为1，无带记录为0，作0，1矩阵图输入计算机。采用NTSYS-pc软件(版本2.1)，计算Jaccard相似矩阵，根据UPGMA方法构建聚类树状，如图1所示。从图1可以看出这15份材料大体可以分为三类，第一类包括1、3、7、8、9、10、14，其中1与14号遗传相似系数为1.00，说明亲缘关系最近。第二类包括2、4、5、6、11、12号，13与15号构成第三类，它与其它品系的遗传相似系数分别为0.20，0.IO，从而与第一类和第二类的亲缘关系最远。总之，通过这种方法可以非常清晰和直观地说明各品系之间的亲缘关系远近，为育种上亲本选配提供理论依据。实施例2以15份茄子品系为试验材料，具体如表4所示，培养过程同实施例1。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>DNA的提取，同实施例1。SRAP-PCR扩增，同实施例1，不同之处在在于，所用引物组合如表5所示0D8GA340D26GA340D10GA19SA7GA50D12GA5SA7GA120D15GA11SA8GA30D15GA33SA14GA20D22GA19SA17GA50D22GA34SA18PM180D26GA30SA21GA5步骤三，电泳，同实施例1。步骤四，银染显色，同实施例1。步骤五，聚类分析结果16对引物组合总共产生80条差异条带。将电泳图谱上同一扩增位点上有带记录为l，无带记录为O，作O，l矩阵图输入计算机。采用NTSYS-pc软件(版本2.l)，计算Jaccard相似矩阵，根据UPGMA方法构建聚类树状，如图2所示。这15份材料都是栽培种，其平均遗传相似系数为0.89。从图2可以看出这15份材料大体可以分为三类，第一类包括1、3、4、14，第二类包括2、5、6、7、9、10、11、12和13号，第二类中有三组没有被区分开，分别为(2、6、7)，(9、10)，(12、13)。要区分它们，则需要结合形态性状和系谱关系来区分。如果这两者相同，则可能是同一种材料，或来自于同一祖先。而8与15号构成第三类。此方法可以非常清晰和直观地说明各品系之间的亲缘关系远近，为育种上亲本选配提供理论依据。实施例3以15份茄子品系为试验材料，具体见表6，培养过程同实施例1。表6步骤一，步骤二，表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>步骤一，DNA的提取，同实施例1。步骤二，SRAP-PCR扩增，同实施例1，不同之处在在于，所用引物组合如表7所示表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>步骤三，电泳，同实施例1。步骤四，银染显色，同实施例1。步骤五，聚类分析结果16对引物组合总共产生80条差异条带。将电泳图谱上同一扩增位点上有带记录为l，无带记录为O，作O，l矩阵图输入计算机。采用NTSYS-pc软件(版本2.l)，计算Jaccard相似矩阵，根据UPGMA方法构建聚类树状，如图3所示。从图3可以看出这15份材料大体可以分为三类。第一类为15，其与其它品系的平均相似系数为0.49;第二类为12，其与其它品系的平均相似系数为0.54;其它13份材料为第三类。从而非常清晰和直观地说明各品系之间的亲缘关系远近，为育种上亲本选配提供理论依据。0080]序列表0081]〈110〉上海交通大学0082]〈120〉基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法0083]〈160>210084]〈170>PatentInversion3.30085]〈210>10086]〈211>180087]〈212>DNA0088]〈213〉人工序列0089]〈400>10090]cac朋gtcgctg3g朋gg0091]〈210>20092]〈211>180093]〈212>DNA0094]〈213〉人工序列0095]〈400>20096]￡lgg￡lggg￡l￡l￡lggtctggt0097]〈210>30098]〈211>210099]〈212>DNA0100]〈213〉人工序列0101]〈400>30102]ttg朋tetccagtgt朋ggtt0103]〈210>40104]〈211>180105]〈212>DNA0106]〈213〉人工序列0107]〈400>40108]gcgaggatgctactggtt0109]〈210>5:o"o]:o川]:o"2]:o"3]:oii4]<211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5gcgaggatgctactggtt:0115]〈210>6:0116]〈211>17:0117]〈212〉DNA:0118]〈213>人工序列:0119]〈400>6.0120]cgcaagacccaccacaa17:0121]〈210>7:0122]〈211>17:0123]<212>DNA:0124]〈213>人工序列:0125]〈400>7.0126]ggatgaagcgacaagtc17:0127]〈210>8:0128]〈211>21:0129]〈212>DNA:0130]〈213〉人工序列:0131]〈400>8:0132]ttaccttggtcatacaacatt21:0133]〈210>9:0134]〈211>21:0135]〈212>DNA:0136]<213>人工序列:0137]〈400>9:0138]ttaccttggtcatacaacatt21:0139]〈210>10:0140]〈211>17:0141]〈212>DNA:0142]〈213>人工序列:0143]〈400〉10:0144]acgagttgcggaagtgg17:0145]〈210>11:0146]〈211>19:0147]〈212>DNA:0148]〈213>人工序列〈400>11g朋tgcagg3gaacacgtt〈210>12〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>12ttgaactggc3gaaagggt<210>13〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<400>13tcatctcaaaccatctacac〈210>14〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>14ggjmcc朋3c3catg朋ga〈210>15〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>15cattgtggtggttattgtca〈210>16〈211>20〈212>醒<213>人工序列〈400>16caccaccatcatcatatctt〈210>17〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>17tt朋gggcata肪3catgg;at〈210>1819192019202021:0188]:0189]:0190]:0191]〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>18:0192]:0193]〈210>19:0194]〈211〉18:0195]〈212>DNA:0196]<213>人工序列:0197]〈400>19.0198]ctctccaccgcacatatc18:0199]〈210>20:0200]<211>20:0201]〈212>DNA:0202]〈213>人工序列:0203]〈400>20:0204]ccaaatggaac朋aatgatg20:0205]〈210>21:0206]〈211>18:0207]〈212>DNA:0208]<213>人工序列:0209]〈400>21:0210]aagcgatcaaagcgggtg18权利要求一种基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，提取茄子的DNA；步骤二，SRAP-PCR扩增，得到扩增产物；步骤三，对扩增产物电泳，得电泳凝胶；步骤四，对电泳凝胶进行银染显色；步骤五，对电泳结果结合形态性状和系谱关系来区分各个品种茄子间的亲缘关系。2.根据权利要求1所述的基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法，其特征是，所述的结合形态性状和系谱关系来区分，是指如果这两者相同，则是同一种材料，或来自于同一祖先，反之，则没有亲缘关系。3.根据权利要求1所述的基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法，其特征是，步骤二中，所述SRAP-PCR扩增具体为采用lOiiL反应体系进行SRAP扩增，其中，lOiiL反应体系具体为2.OmmolL-lMgC12，200iimolL_ldNTPs，0.5iimolL_l引物，Taq聚合酶0.5U，4050ng模板DNA，用重蒸水调整终体积至10yL，反应混合物用20yL石蜡油覆盖；PCR扩增程序为94°C3分钟；94°C45秒，35。C45秒，72。C1分钟，5个循环；94°C45秒，50°C45秒，72t:1分钟，35个循环；最后72°C7分钟。4.根据权利要求1或3所述的基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法，其特征是，步骤二中，所述SRAP-PCR扩增所用引物选自以下引物组合中的多种<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>其中，所述引物具体如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>全文摘要一种农作物育种
技术领域：
的种基于SRAP标记的茄子亲缘关系的检测方法，包括如下步骤步骤一，提取茄子的DNA；步骤二，SRAP-PCR扩增，得到扩增产物；步骤三，对扩增产物电泳，得电泳凝胶；步骤四，对电泳凝胶进行银染显色；步骤五，对电泳结果进行聚类分析，确定不同品种茄子间的亲缘关系。本发明的方法简单易行，成本低，效率高，每个SRAP引物在栽培种中平均检测出0.75个多态位点。文档编号C12Q1/68GK101712998SQ20091030922公开日2010年5月26日申请日期2009年11月3日优先权日2009年11月3日发明者刘杨,庄天明,李怀志,陈火英,韩洪强申请人:上海交通大学