生产方法

专利名称：生产方法
生产方法本发明涉及用于在宿主细胞中由甘油产生1，2_丙二醇的方法。更具体地，本发 明描述了使得能够从甘油的纯制剂和粗制剂专门合成丙二醇的1，2_异构体的重组酶促活 性。本发明还提供了用于1，2-丙二醇的产生的关键活性的过表达和失活的适当的组合。1,2-丙二醇(丙二醇；1，2-PD)是广泛用作不饱和聚醚树脂、药物制剂和化妆品、 液体洗涤剂、冷冻剂和防冻液或除冰液的组分的主要散装化学药品(bulk chemical)。因为 1,2-PD具有光学活性，因此1，2-PD的对映体纯的制剂可能在医学、农业或生理学应用方面 特别引人注意。目前通过包括处理大量有毒化合物如表氯醇或氢过氧化物的化学合成从石油化 学品产生1，2_丙二醇。在常规化学合成中，通过水化从丙烯产生的环氧丙烷获得1，2-PD。 化学合成产生消旋1，2-PD并且需要大量的水以防止聚乙二醇形成。常规的化学合成依赖 于化石资源并且导致大量副产品的产生；从而其在环境和经济方面看来是问题的。已知可利用微生物由作为底物的糖产生1，2丙二醇(Kluyver和Schellen， 1937)(Heath, Ε. C.，1962)(Altaras, N. Ε,2001)(TranDin, K,198)(Cameron, D. C.，1986) (Cameron, D. C, 1998) (Park, Y. H.，2006 ；US 7，049，109 B2)。US 6087140和US 6303352描述了利用重组生物由糖(除了 6-脱氧己糖外)产生 1,2-PDο在WO 2005/073364, US 2007/072279中，描述了籍以产生和选择显示增强的从非 特定的碳源产生1，2-PD的能力的微生物的方法。更具体地，已教导一组基因的失活产生具 有单个或多个突变的菌株(其为通过恒化器-发酵(chemostat-fermentation)进行的随 后选择步骤的基础)。应用的焦点集中在编码aldA和gloA活性的基因的失活。所有公开 的实施例针对大肠杆菌(E. coli)MG1655，所述大肠杆菌在至少下列两个基因中具有突变 磷酸三糖异构酶(tpiA)和丙酮酸甲酸裂解酶(pflAB)的两个亚基。此外，实施例明确地提 及葡萄糖作为用于发酵的碳源。因此在本领域内存在对改进用于1，2_丙二醇(1，2-PD)的产生的生物技术方法的 未满足的需要。还存在对可用于这样的方法的改良微生物菌株的未满足的需要。本发明通过为到目前为止仍然阻碍该领域中的重大进步的问题提供解决办法来 满足该未满足的需要。为了解决这些问题，本发明提供了用于从非发酵性廉价碳底物产生1，2丙二醇 (1,2-PD)的改进的生物技术方法，其中碳底物维持生物质的产生并且同时用作为产生1，2 丙二醇(1，2-PD)的底物。本发明还提供了特别适合于本方法的特殊要求，从而特别适合用 于根据本发明的方法的改良微生物菌株。特别地，本发明提供了当在非发酵性碳底物上生长时，特别是当在作为唯一碳源 的甘油上生长时，产生高水平1，2丙二醇(1，2-PD)的经工程改造的宿主细胞，特别是微生 物或菌株，其中碳底物维持生物质的产生并且同时用作产生1，2丙二醇(1，2-PD)的底物。在本发明的一个实施方案中，提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时产生高水 平的1，2丙二醇(1，2-PD)的经工程改造的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中所述甘油具有至少70 %，特别地至少75 %，特别地至少80 %，特别地至少85 %，特别地至少90 %，特 别地至少95%，特别地至少99%和达到100%的纯度，落在上面确定的范围内的所有整数 也一起包括在其中。在特定的实施方案中，所述甘油具有80%至90%，特别地大约85%的纯度。在本发明的一个实施方案中，提供了当在作为唯一的碳源的甘油上生长时能够产 生高水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过引入 编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因对所述宿主细胞，特别是所述微生物或菌株，进 行工程改造用以过表达丙二醇氧化还原酶(fucO)。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将至少一 个编码选自甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的酶 活性的另外的基因与编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主细胞 (就此表达所述活性和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性)来对所述宿主细胞，特别是所述微 生物或菌株进行工程改造以共表达选自甘油脱氢酶(gldA)，二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲 基乙二醛合酶(mgsA)的至少一个酶蛋白以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将编码甘 油脱氢酶(gldA)活性的基因与编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因共引入所述宿主 细胞(就此表达所述甘油脱氢酶(gldA)活性和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性)来对所述 宿主细胞，特别地所述微生物或菌株进行工程改造以共表达甘油脱氢酶(gldA)活性和丙 二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将编码二 羟基丙酮激酶(dhaK)活性的基因与编码编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因一起 共引入所述宿主细胞(就此表达所述二羟基丙酮激酶(dhaK)活性和丙二醇氧化还原酶 (fucO)活性)来对所述宿主细胞，特别是所述微生物或菌株进行工程改造以共表达二羟基 丙酮激酶(dhaK)活性和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将编码甲 基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因与编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因一起共引入 所述宿主细胞(就此表达所述甲基乙二醛合酶(mgsA)活性和丙二醇氧化还原酶(fucO)活 性)来对所述宿主细胞，特别是所述微生物或菌株进行工程改造以共表达甲基乙二醛合酶 (mgsA)活性和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别地通过将编码甘 油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激酶(dhaK)活性的基因与编码丙二醇氧化还原酶(fucO) 活性的基因一起共引入所述宿主细胞(就此表达所述甘油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激 酶(dhaK)活性以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性)来对所述宿主细胞，特别是所述微生 物或菌株进行工程改造以共表达甘油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激酶(dhaK)活性以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将编码甘 油脱氢酶(gldA)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因与编码丙二醇氧化还原酶(fucO) 活性的基因一起共引入所述宿主细胞(就此表达所述甘油脱氢酶(gldA)和甲基乙二醛合 酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性)来对所述宿主细胞，特别地所述微生 物或菌株进行工程改造以共表达甘油脱氢酶(gldA)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性以及丙 二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将编码 二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因与编码丙二醇氧化还原酶 (fucO)活性的基因一起共引入所述宿主细胞(就此表达二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙 二醛合酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性)来对所述宿主细胞，特别是所 述微生物或菌株进行工程改造以共表达二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA) 活性以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将编码 甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的基因与编 码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主细胞(就此表达甘油脱氢 酶(gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化还原酶 (fucO)活性)来对所述宿主细胞，特别是所述微生物或菌株进行工程改造以共表达甘油脱 氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性以及丙二醇氧化还原 酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将编码甘 油脱水酶活性的基因与编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主 细胞(就此表达甘油脱水酶活性以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性)来对所述宿主细 胞，特别是所述微生物或菌株进行工程改造以共表达甘油脱水酶活性和丙二醇氧化还原酶 (fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中特别是通过将选自 dkgA、dkgB、yeaE和yghZ的编码醛酮还原酶活性的基因(特别是微生物基因)与编码丙二 醇氧化还原酶(fucO)活性的基因一起共引入所述宿主细胞(就此表达所述醛酮还原酶活 性和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性)来对所述宿主细胞，特别是所述微生物或菌株进行工 程改造以共表达醛酮还原酶活性(特别是由选自dkgA、dkgB、yeaE和yghZ的基因，特别是 微生物基因贡献的醛酮还原酶活性)和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中已通过重组DNA技术 对所述宿主细胞，特别是所述微生物或菌株进行了工程改造。
在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中所述宿主细胞，特别是 微生物或菌株在阿拉伯糖代谢中具有缺陷。在一个实施方案中，所述宿主细胞，特别是所述 微生物或菌株由于降低的核酮糖激酶活性或丢失核酮糖激酶活性而在阿拉伯糖代谢中具 有缺陷。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中所述宿主细胞，特别是 微生物或菌株在甲基乙二醛代谢中具有缺陷。在一个实施方案中，所述宿主细胞，特别是所 述微生物或菌株由于降低的或丢失选自乙二醛酶系统I、乙二醛酶系统II、乳酸脱氢酶A、 乙二醛酶系统III、醛脱氢酶A活性的酶活性，尤其是由于降低的乙二醛酶系统I活性或丢 失乙二醛酶系统I活性而在甲基乙二醛的代谢中具有缺陷。在一个实施方案中，本发明提供了当在作为唯一碳源的甘油上生长时能够产生高 水平的1，2丙二醇(1，2-PD)的宿主细胞，特别是微生物或菌株，其中所述宿主细胞，特别是 微生物或菌株在磷酸二羟丙酮代谢中具有缺陷。在一个实施方案中，所述宿主细胞，特别是 所述微生物或菌株由于降低的磷酸三糖异构酶活性或丢失磷酸三糖异构酶活性而在磷酸 二羟丙酮的代谢中具有缺陷。在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的和如本文中之前描述的宿主细 胞，特别是微生物或菌株，其中所述微生物是大肠杆菌。在一个实施方案中，本发明提供了用于制备1，2_丙二醇的方法，其中将根据本发 明的宿主细胞，特别是微生物菌株培养在含有简单碳源，特别是粗制甘油制剂的适当培养 基中，之后回收以及必要时纯化产生的1，2_丙二醇。特别，本发明提供了通过将根据本发明的宿主细胞特别是微生物或菌株培养在非 发酵性碳底物上来产生1，2_丙二醇的方法，其包括i)培养根据本发明的和如本文中之前描述的所述宿主细胞，特别是所述微生物或 菌株，该宿主细胞在含有非发酵性碳底物的培养基中过表达丙二醇氧化还原酶(fucO)活 性，其中碳底物维持生物质的产生并且同时用作为产生1，2丙二醇(1，2-PD)的底物，并且 非发酵性碳源被根据本发明的宿主细胞，特别是微生物或菌株代谢成1，2_丙二醇ii)回收根据步骤i)产生的1，2_丙二醇；和，任选地，iii)纯化回收的1，2-丙二醇。在本发明的一个实施方案中，所述非发酵性碳底物是粗制甘油制剂，特别是含有 具有至少70 %，特别地至少75 %，特别地至少80 %，特别地至少85 %，特别地至少90 %，特 别地至少95%，特别地至少99%和达到100%的纯度的甘油的制剂。在特定的实施方案中，甘油具有80 %至90 %，特别地大约85 %的纯度。在一个实施方案中，非发酵性碳源，特别是如本文中之前描述的粗制甘油制剂被 选择性代谢成1，2-丙二醇。在一个实施方案中，本发明提供了如本文中之前描述的产生1，2_丙二醇的方法， 其中将根据本发明的和如本文中之前描述的经工程改造过表达丙二醇氧化还酶(fucO)的 宿主细胞，特别是微生物或菌株用于所述方法。在一个实施方案中，本发明提供了如本文中之前描述的产生1，2_丙二醇的方法，其中将根据本发明的和如本文中之前描述的宿主细胞，特别是微生物或菌株用于所述方 法，所述宿主细胞经工程改造共表达至少一种选自甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶 (dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的另外的酶蛋白以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性。在本发明的一个实施方案中，使用根据本发明的和如本文中之前描述的宿主细 胞，特别是微生物或菌株，其中已使至少一个参与与1，2-PD的产生相竞争的非产生性路径 的酶活性失活。特别地，使用微生物突变体，特别是大肠杆菌的突变体，在所述突变体中已使编码 乙二醛酶系统I和II (gloA和gloB)、乳酸脱氢酶A(IdhA)、乙二醛酶系统111(通过使主调 节剂rpoS失活间接地)和醛脱氢酶的基因中的一个或多个基因失活。在另一个实施方案中，使用其中已使编码gloA活性的基因部分或完全失活的微 生物突变体或菌株，特别是大肠杆菌突变体在另一个实施方案中，在根据本发明的方法中使用阿拉伯糖代谢失活的微生物突 变体或菌株。在本发明的一个实施方案中，将大肠杆菌菌株，特别是大肠杆菌菌株MG1655和 DH5ci，分别用作宿主生物。在本发明的一个实施方案中，编码选自甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶 (dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)以及丙二醇氧化还原酶(fucO)的酶活性的基因中的至少 一个基因处于诱导型启动子，特别是阿拉伯糖诱导的启动子，尤其是ParaBAD启动子的控 制之下。在本发明的一个实施方案中，提供了合成操纵子并且将所述操纵子用于根据本 发明的提供宿主细胞，特别是微生物或菌株的方法，所述宿主细胞共表达选自甘油脱氢酶 (gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)活性的至少一个酶活性以及丙 二醇氧化还原酶(fucO)活性。在本发明的一个实施方案中，编码上述活性的基因处于诱导 型启动子，特别是阿拉伯糖诱导的启动子，尤其是ParaBAD启动子的控制之下。在一个实施方案中，提供了包含编码丙二醇氧化还原酶(fucO)的基因和至少一 个编码选自甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶和甲基乙二醛合酶(mgsA)的酶蛋白的另外的基 因的合成操纵子，特别是包含编码丙二醇氧化还原酶(fucO)、甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶 和甲基乙二醛合酶(mgsA)的基因的合成操纵子。在一个实施方案中，根据本发明的合成操纵子处于诱导型启动子特别是阿拉伯糖 诱导的启动子的控制之下。在本发明的一个实施方案中，编码当诱导时从所述操纵子转录的基因的连续物 (succession of gene)的基因如下mgsA、gldA、dhaK、fucO。本发明还涉及包含根据本发明的和如本文中之前描述的操纵子的多核苷酸分子 或构建体，特别是质粒和载体分子以及涉及包含所述多核苷酸分子的宿主细胞，特别是微 生物宿主细胞。附图和序列表的概述

图1举例说明大肠杆菌的野生型(黑色条)和突变型菌株(gloA突变体，灰色条； gloB突变体，阴影线条)的生长被不同量的加入至肉汤培养基的甲基乙二醛抑制。图2是当糖或甘油是碳底物时产生1，2_PD的路径的示意图。
图3和4举例说明本发明中描述的质粒的图谱。术语“多核苷酸”在本文中理解为是指高分子量的聚合物分子，其可以是单链或 双链的，可由含有糖、磷酸和作为嘌呤或嘧啶的碱基的单体(核苷酸)组成。因此术语“多 核苷酸”主要是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链的或双链的，任选地包含能够整合入 DNA或RNA聚合物的合成的、非天然或改变的核苷酸碱基。除非另外指出，否则本发明的特 定核酸序列还明确地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确 指定的序列。特别地，简并密码子置换可通过产生其中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基置 换一个或多个选择的(或所有)密码子的第3位置的序列来获得(Batzer，等人(1991)； Ohtsuka，等人，(1985)；和Rossolini，等人(1994))。术语多核苷酸与核酸、核酸分子可互 换使用并且可包括基因、cDNA和由基因编码的mRNA等。术语“构建体”是指来源于任何来源的质粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或单链或 双链DNA或RNA的线性或环状核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已被连接或重组入独特结 构，所述结构能够将启动子片段和编码根据本发明的酶活性的选择的基因产物的DNA序列 以及适当的3'非翻译序列引入细胞。术语“转化”或“转染”涉及在核酸整合后细胞中获得新基因。术语“表达”是指将编码基因产物的序列的基因转录和翻译成基因产物。在表达 中，编码基因产物的序列的DNA链首先被转录成通常为信使RNA的互补RNA，然后，如果基因 产物是蛋白质的话，所转录的信使RNA被翻译成上述基因产物。本文中使用的术语“质粒”或“载体”或“粘粒”是指通常携带不是细胞的中心代谢 的部分的基因并且通常以环状双链DNA分子的形式存在的染色体外元件。用于本说明书中的术语“调控子(regulator) ”是指具有功能性启动子的和任何相 关转录元件(例如，增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI部分等)的碱基序列。用于本说明书的术语“有效地连接”意指在宿主细胞中以可操作的状态将控制基 因表达的各种调控元件例如启动子、增强子等与目的基因连接，就此使所述目的基因能够 表达。对于本领域技术人员来说众所周知的是调控子的类型和种类可视宿主而变化。术语“缺失”是抑制基因活性，其通常由抑制可以是失活、抑制的活性组成，或其 可以是所述基因的至少部分的缺失(例如其表达所必需的启动子区域的全部或部分的缺 失)，以使其不表达或无功能或以使表达产物丧失其功能(例如所述基因的编码部分的缺 失)。优选，基因的缺失基本上是对该基因的抑制，所述基因可被帮助鉴定、分离和纯化根据 本发明的菌株的筛选标记基因替代。例如，可通过例如大肠杆菌的recA-蛋白介导的同源 重组使基因失活(Cunningham，等人(1980))。简而言之，失活方案可以如下将DNA的线性片段引入细胞。体外获得该片段并 且其包含侧翼连接基因的两个区域和位于两个侧翼区域之间的编码筛选基因产物的基因 (通常抗生素抗性基因)。该片段从而提供了灭活的基因。通过在选择培养基上涂板来选 择已经历重组事件并且整合了合成片段的细胞。选择已经历双重组事件，其中天然基因已 被失活的基因替换的细胞。术语“碳底物”意指能够被微生物代谢的任何碳源，其中底物包含至少一个碳原子。
术语“非发酵性碳底物”，如本发明中所使用的，是指不支持给定的生物在外源电 子受体不存在的情况下产生生物质的氧化还原过程的碳底物。1，2_丙二醇(丙二醇；1，2_PD)是广泛用作不饱和聚酯树脂、药物制剂和化妆品、 液体洗涤剂、冷却剂(coolant)和防冻液或除冰液的成分的主要散装化学品。因为1，2丙 二醇(1，2-PD)具有光学活性，因此对映体纯的1，2丙二醇(1，2-PD)的制剂在医学、农业或 生理学应用方面可能特别引人注意。可利用微生物从作为底物和唯一碳源的糖产生1，2丙二醇(1，2-PD)。近年来，就 用作发酵底物而言，可选择的底物例如甘油(而非例如糖碳源)已吸引了人们相当多的注 意。对甘油的兴趣主要归因于显著增加的生物柴油或生物乙醇的生产。这两种方法都产生 甘油作为主要副产品，其构成例如产生的生物柴油的10% (w/w) 0本发明现提供了用于从非发酵性廉价的碳底物特别是粗制甘油制剂产生1，2丙 二醇(1，2-PD)的改进的生物技术方法，其中碳底物维持生物质的产生并且同时用作产生 1，2丙二醇(1，2-PD)的底物。本发明还提供了改良微生物菌株，其特别适合该方法的特殊 要求，从而特别适合用于根据本发明的方法。在优选实施方案中，本发明提供了使用宿主细胞特别是微生物或菌株(所述宿主 细胞经工程改造包含一个或多个参与由甘油产生1，2丙二醇(1，2-PD)的产生路径的基因) 将甘油或粗制甘油制剂作为非发酵性碳源直接生物转化成1，2-丙二醇。特别地，已通过重 组DNA技术对根据本发明的宿主细胞特别是微生物或菌株进行了工程改造，从而产生重组 宿主细胞，特别是重组微生物或菌株，所述重组宿主细胞包含参与磷酸二羟丙酮和甲基乙 二醛(1，2丙二醇(1，2-PD)的产生路径中的两个至关重要的前体化合物)的代谢的基因。 特别地，提供了宿主细胞，特别是微生物或菌株，所述宿主细胞具有选自编码展示甘油脱氢 酶活性、二羟基丙酮激酶活性、甲基乙二醛合酶活性和丙二醇氧化还原酶活性的酶的基因， 所述酶能够以高选择性将甘油转化成1，2丙二醇(1，2-PD)。在优选实施方案中，在本发明的范围内使用经工程改造的大肠杆菌菌株，特别是 重组大肠杆菌菌株。在本发明内令人惊讶地发现来自生物柴油生产的普通粗制甘油(85%的纯度)可 用作许多种不同来源的生物在好氧和缺氧条件下生长的底物。可证明大多数受试生物就生 物质产生而言与纯甘油相比较，不受粗制甘油损害，从而表明可利用粗制甘油并且其对于 微生物通常是无毒的。生物质产生不受粗制甘油制剂中发现的杂质影响。因此，来自生物 柴油生产或可选择的来源的粗制甘油可被微生物同样良好地用作碳源，从而所述粗制甘油 可在无需进一步加工的情况下在用于生物质产生的发酵过程中用作一般可再生碳源。因而粗制甘油制剂，特别是来自生物柴油或生物乙醇生产的粗制甘油制剂可用于 根据本发明的用于产生1，2丙二醇(1，2-PD)的方法。1，2丙二醇(1，2-PD)的产生路径中的第一关键前体化合物是磷酸二羟丙酮 (DHAP)。通过甲基乙二醛合酶(mg sA)的活性将DHAP转化成甲基乙二醛(第二必需前体 化合物)。甲基乙二醛最终转化成S-乳酸醛(S-Iactaldehyde)。迄今为止未鉴定的甘油 脱水酶活性可将甘油转化成R或S-乳酸醛，其分别被进一步代谢为R-或S-I，2-PD。然而 有人提出宿主细胞的内源性还原活性从R-乳酸醛产生R-l，2-PD，S-乳酸醛似乎是丙二醇 氧化还原酶(fucO)的底物，所述酶可将S-乳酸醛转化成S-l，2-PD(AltaraS，N. Ε.，1999 ；Applield andEnvironmental Microbiology(65)，1180—1185)。因此假设通过将丙二醇氧化还原酶(fucO)引入宿主生物，产生1，2丙二醇(1， 2-PD)的网络的灵活性(flexibility)可通过接受乳酸醛的S-对映体以转化成1，2丙二 醇(1，2-PD)而得到扩大。此外，可得出丙二醇氧化还原酶(fucO)活性可能是不依赖于甲 基乙二醛路径由甘油产生1，2丙二醇(1，2-PD)所必需的。因此，将包含编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的核苷酸序列的多核苷酸补充 给无论培养条件如何，不从甘油产生可检测量的1，2丙二醇(1，2-PD)的野生型菌株。在本发明的一个实施方案中，将编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因克隆 入宿主生物(所述宿主生物不从甘油产生可检测量的1，2丙二醇(1，2-PD))并且所述基因 在好氧和半缺氧条件下，在于含有甘油的基本培养基中的所述宿主中过表达。丙二醇氧化 还原酶(fucO)活性的过表达导致1，2丙二醇(1，2-PD)的产生。1，2丙二醇(1，2-PD)的产生路径中的另外的关键前体化合物是磷酸二羟丙酮 (DHAP) 0在本发明的一个实施方案中，通过工程改造将产生作为1，2丙二醇(1，2-PD)_合 成的前体的磷酸二羟丙酮的可选择路径引入微生物菌株，特别是大肠杆菌菌株，所述路径 不依赖于作用于甘油磷酸激酶(glpK)的内源调控网络产生必需前体DHAP。特别地，将包含编码甘油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激酶(dhaK)活性的核苷酸 序列的DNA分子引入宿主生物，特别是大肠杆菌宿主。可从大肠杆菌菌株，特别是大肠杆菌 K12分离编码甘油脱氢酶(gldA)的基因并且将其克隆入适当的质粒。在一个实施方案中，可将编码甘油脱氢酶(gldA)的基因与编码二羟基丙酮激酶 (dhaK)活性的基因一起克隆入适当的质粒。可从柠檬酸杆菌(Citrobacter)菌株，特别是 弗氏柠檬酸杆菌(CitrcAacterfreimdii)菌株分离编码二羟基丙酮激酶(dhaK)活性的基 因。在本发明的另一个实施方案中，将甘油脱氢酶(gldA)基因克隆入独立于和与甘 油脱氢酶(gldA)分开的适当质粒。在本发明的一个实施方案中，引入的编码甘油脱氢酶(gldA)和/或二羟基丙酮激 酶(dhaK)活性的编码序列处于诱导型启动子，特别是阿拉伯糖诱导的启动子(paraBAD)的 控制之下。可将产生磷酸二羟丙酮的该可选择路径的分别编码甘油脱氢酶(gldA)和二羟基 丙酮激酶(dhaK)活性的基因与包含编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的核苷酸序列的多 核苷酸一起(分别作为单个表达盒(其中编码序列处于其自已的启动子和终止信号的控制 之下，所述表达盒可位于不同质粒上或位于单个质粒上)或以包含处于共同启动子和终止 序列的控制之下的两个或更多个所述基因的合成操纵子的形式)引入野生型宿主生物。在本发明的一个实施方案中，将编码甘油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激酶 (dhaK)活性的基因克隆入已包含编码丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因的单个质粒， 从而产生包含编码甘油脱氢酶(gldA)和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因的质粒，或 包含编码二羟基丙酮激酶(dhaK)和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因的质粒。在一个实施方案中，产生包含编码甘油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激酶(dhaK) 以及丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的基因的质粒。可将编码不同酶活性的不同基因序列排列在质粒上例如用以产生合成操纵子，其中两个或更多个基因排列在共同调控序列包括启动子和多腺苷酸化序列的控制之下。在一 个实施方案中，合成操纵子处于诱导型启动子特别是阿拉伯糖诱导的启动子的控制之下。DHAP是产生1，2丙二醇(1，2_PD)的路径的初始中间产物。糖酵解路径的磷酸三 糖异构酶(tpi)与甲基乙二醛合酶竞争DHAP。为了驱动1，2丙二醇(1，2-PD)产生，可将编 码甲基乙二醛合酶的mgsA整合入合成操纵子以使平衡移向1，2丙二醇(1，2-PD)的产生。在本发明的一个实施方案中，从而提供了除了参与磷酸二羟丙酮路径的基因外还 包含参与甲基乙二醛的产生的另外的基因(特别是甲基乙二醛合酶基因，特别是大肠杆菌 的甲基乙二醛合酶基因)的延长的合成操纵子。然后将所得的质粒引入宿主细胞，特别是微生物宿主细胞或菌株，特别是大肠杆 菌菌株，无论培养条件如何，所述宿主细胞不能够由甘油产生可检测量的1，2丙二醇(1， 2-PD)。在本发明的一个实施方案中，宿主生物不具有活性阿拉伯糖代谢或之前已通过缺 失或使至少一个参与阿拉伯糖代谢的必需基因例如编码核酮糖激酶活性(araB)的基因失 活来使其失去阿拉伯糖代谢活性。在好氧和半缺氧条件下在含有甘油的基本培养基中培养 相应的菌株，然后从上清液中分离1，2丙二醇(1，2-PD)并且对其进行分析。丙二醇氧化还原酶基因(fucO)的过表达导致从粗制甘油制剂产生1，2丙二醇(1， 2-PD)。可通过共表达二羟基丙酮激酶(dhaK)和/或甘油脱氢酶基因(gldA)以及丙二醇 氧化还原酶基因(fucO)来增加1，2丙二醇(1，2-PD)的量。可通过共表达二羟基丙酮激酶 (dhaK)和/或甘油脱氢酶基因(gldA)和/或甲基乙二醛合酶基因(mgsA)以及丙二醇氧化 还原酶基因(fucO)和/或使用宿主细胞，特别是微生物宿主细胞或菌株(所述宿主细胞在 至少一个竞争1. 2-丙二醇产生性路径中的关键前体化合物的非产生性路径中具有缺陷) 来实现进一步提高。以所述方式如5' -mgSA、gldA、dahK、fuC0-3'排列参与催化的基因是优选的，然 而本发明不限于该特定的排列。所述基因的任何顺序可能适合于1，2丙二醇(1，2-PD)的产生。已显示路径对于丙二醇的1，2丙二醇(1，2-PD)异构体的产生是特异性的，因为未 检测到1，3-丙二醇。从细菌基因组获得期望的基因的方法在分子生物学领域内是普通的并且熟知的。 例如，如果已知基因的序列，可通过限制性内切核酸酶降解产生适当的基因组文库，然后可 利用与期望的基因序列互补的探针筛选所述文库。在分离该序列后，可使用标准引物指导 的扩增方法例如聚合酶链式反应(PCR)(美国专利4，683，202)扩增DNA以获得适合用于使 用适当载体进行转化的DNA量。可选择地，可产生其中可将基因组DNA的大片段(35-451Λ) 包装入载体并且用于转化适当的宿主的粘粒文库。粘粒载体的独特性在于能够容纳大量 DNA0通常，粘粒载体具有至少一个拷贝的cos DNA序列，该序列是包装和随后环化外源DNA 所必需的。除了 cos序列外，此类载体还将包含复制起始点例如ColEl和药物抗性标记例 如抗氨苄西林或新霉素的基因。使用粘粒载体转化适当的细菌宿主的方法已在Sambrook 等人，(1989)中获得详尽描述。一般地，为了克隆粘粒，使用适当的限制性内切核酸酶分离 外源DNA，并且将其与粘粒载体的cos区邻接。然后将含有线性化的外源DNA的粘粒载体与 包装DNA的载体例如噬菌体1反应。在包装过程中，cos位点初切割，然后外源DNA被包装入细菌病毒颗粒的头部。然后可将这些颗粒用于转化适当的宿主细胞例如大肠杆菌。当注 射入细胞后，外源DNA在cos粘性末端的影响下环化。这样，外源DNA的大片段可被引入重 组宿主细胞并且在其中表达。在已分离基因并且将其序列输入public domain后，本领域技术人员可使用例如 GenBank中给出的此类已知基因的参照序列来确定其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动 物和植物等中的等价基因。有利地使用可使用序列比对确定的与来自其他微生物的基因的 共有序列和通过设计简并探针(通过所述探针可将相应的基因克隆入另一种生物)来进行 该常规工作。此类常规分子生物学技术对于本领域技术人员来说是熟知的并且描述于例如 Sambrook 等人(1989)中。在另一个实施方案中，本发明提供了适合用于根据本发明的酶促活性的克隆、转 化和表达的许多种载体以及转化和表达盒。所述载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以 是复制型或复制缺陷型。在后一种情况下，病毒扩增通常将只在互补宿主/细胞中才发生。可将本发明的多核苷酸或基因连接至含有筛选标记的载体以在宿主中进行扩增。 通常，以沉淀例如磷酸钙沉淀或氯化铷沉淀的形式或以与带电荷的脂质的复合物的形式或 以基于碳的簇例如富勒烯(fulleren)的形式引入质粒载体。当载体是病毒时，在用于宿主 细胞之前可使用适当的包装细胞系体外包装其。在本发明的的载体的更优选实施方案中，将多核苷酸有效地连接至表达控制序 列，从而允许在原核或真核细胞或其分离级分中表达。所述多核苷酸的表达包括将多核苷酸优选转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞 例如细菌或直菌细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞，特别是细菌或真菌细 胞中表达的调控元件对于本领域技术人员来说是熟知的。它们通常包含确保转录起始的调 控序列和任选地确保转录终止和转录物稳定的多腺苷酸化信号。另外的调控元件可包括转 录以及翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括例如大肠杆菌中的 lac.trp或tac启动子，允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOXl或 GALl启动子。除了负责转录起始的元件外，此类调控元件还可在多核苷酸的下游包括转录 终止信号。在本说明书中，合适的表达载体在本领域内是已知的，例如Okayama-Berg cDNA ^ ii ic # pcDVl (Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAU pcDNA3 (In-vitrogene)、 pSPORTl (GIBCO BRL) ,pSE380 (In-vitrogene)或任何 pBR322 或 pUC18_ 来源的质粒。优选， 所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。来源于病毒例如逆转录病毒、痘苗病毒、 腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送 入靶细胞群体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组病毒载体；参见，例如，描述于 Sambrook, (1989)和Ausubel (1994)中的技术。可选择地，可将本发明的多核苷酸和载体 重建入脂质体以递送至靶细胞。本发明还涉及使用本发明的多核苷酸、本发明的基因或本发明的载体进行了基因 工程改造的宿主细胞。用于1，2-丙二醇的重组产生的合适的宿主细胞可以是原核或真核 细胞并且将只受宿主细胞表达活性酶的能力限制。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。可将存在于宿主细胞中的本发明的多核苷酸或载体整合入宿主细胞的基因组或其可以以染色体外形式保持。在这方面，还应理 解本发明还涉及可用于“基因打靶”和/或“基因替代”以通过同源重组恢复突变基因或 产生突变基因的重组DNA分子；参见例如Mouellic，(1990) Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞例如细菌或真菌细胞、昆虫细胞、动 物细胞、哺乳动物细胞或人细胞，特别是细菌或真菌细胞。优选宿主将是通常用于 产生甘油或1，2_丙二醇的宿主。优选真菌细胞是例如曲霉菌属(Aspergillus)、 酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属 (Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母 属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor) 和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌细胞，特别是酿酒酵母(S. cerevisiae)种的真菌 细胞。术语“原核”是指包括可用多核苷酸转化或转染以表达根据本发明的酶活性的 所有细菌和古细菌(archaea)。原核宿主可包括革兰阴性以及革兰阳性细菌例如柠檬 SIff^M (Citrobacter) > Jgff^M (Enterobacter) > It ^M (Clostridium) >K 菌属(Klebsiella)、气杆菌属(Aerobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、甲基细菌属 (Methylobacter) K^M (Escherichia)、Π K^M (Salmonella) > Wl^PfMM (Bacillus)、链霉菌属(Sti^ptomyces)和假单胞菌属(I^seudomonas)。本发明中最优选的 是大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌(S. typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、克雷伯氏菌属种和酵母菌属种，特别是大肠杆菌属种。其特殊实例包括大肠杆菌MG1655(ATCC 700926 ；Bachmann, B.，pp. 2460-2488 in Neidhardt 等人 1996)、大肠杆菌XLl-Blue MRF'[由 Mratagene，Strategies, 5,81 (1992) 制造的]、大肠杆菌 C600 [Genetics, 39,440 (1954)],大肠杆菌 Y1088 [Science, 222, 778 (1983)]、大肠杆菌 Y1090 [Science, 222, 778 (1983)]、大肠杆菌 NM522 [J. Mol. Biol.， 166，1 (1983)]、大肠杆菌 K802 [J. Mol. Biol. ,16,118 (1966)]、大肠杆菌 JM109 [Gene, 38 275 (1985)]、大肠杆菌 DH5 α [J. Mol. Biol. , 166,557(1983)1 等。可通过使用其中已降低或消除了参与非产生性路径的一些或所有酶活性的适当 的微生物突变体来实现1，2-PD产量的进一步提高。例如，由mgsA和tpi编码的酶促活性竞 争DHAP。已显示甲基乙二醛合酶活性(mgsA)被二磷酸盐灭活(Hopper，D.J. 1972)。为了 促进DHAP至甲基乙二醛的转化，可通过筛选利用产生mgsA的编码序列内的变异的任何方 法例如易错PCR(error-prone PCR)获得的变异文库来鉴定MgsA的磷酸非敏感型突变体。 用mgsA变体的质粒文库转化之前已使磷酸三糖异构酶(tpiA)和内源mgsA失活的微生物 菌株特别是大肠杆菌克隆，然后将其培养在非选择固体培养基上。通过在含有高浓度的甘 油或DHAP (板B)或高浓度的二磷酸盐和甘油或DHAP (板C)的琼脂板上影印培养初始转化 体(板A)，将可选择可在板A和B上生长但不能在板C上生长的克隆。此类克隆编码具有 在高浓度磷酸盐存在的情况下产生毒性水平的甲基乙二醛的显著活性的mgsA变体。可如对于甲基乙二醛合酶突变体所描述的一样产生磷酸三糖异构酶突变体。通过 比较复杂培养基(例如Luria Broth, LB)、葡萄糖和甘油上的生长动力学鉴定在生长动力 学上显著受损的Tpi-突变体。以甘油作为唯一的碳源和能源，目的突变体与未修饰菌株相 比较显示更慢的生长或不生长，然而利用LB或葡萄糖作为碳源的生长动力学不受影响。
存在用于MG脱毒的两个其他主要路径，所述路径就1，2 PD生物合成而言是产生 性的。利用所谓的MG还原酶作为初始步骤催化它们。有人提出几个酶编码应当通过使竞 争性非产生性路径失活来增强的该活性。在本发明的一个实施方案中，构建微生物突变体，特别是大肠杆菌的突变体，其中 已通过例如单基因敲除使编码乙二醛酶系统I和II(gloA和gloB)、乳酸脱氢酶A(IdhA)、 乙二醛酶系统III (通过使主调控子rpoS失活间接地)和醛脱氢酶A(aldA)的基因中的一 个或多个失活例如来显著降低或完全抑制功能性酶活性。这样，可获得具有一个或多个所 述失活的基因的微生物突变体，特别是其中使2、特别地3、特别地4、特别地5个选自编码乙 二醛酶系统I (gloA)、乙二醛酶系统II (gloB)、乳酸脱氢酶A(IdhA)、乙二醛酶系统III (通 过使主调控子rpoS失活间接地)和醛脱氢酶A(aldA)的基因失活的突变体。在本发明的一个实施方案中，提供了其中已使编码gloA活性的基因部分或完全 失活的微生物突变体，特别是大肠杆菌突变体。在本发明的一个实施方案中，使宿主细胞，特别是微生物或菌株，尤其是原核微生 物例如大肠杆菌丧失其将甲基乙二醛(MG)代谢成D-和/或L-乳酸(MG-至-乳酸的代 谢)的能力。这可通过例如使乙二醛酶A失活(优选与使编码乙二醛酶B、可选择的σ因 子rpoS和醛还原酶A的基因中的一个或多个失活组合)来实现。在优选实施方案中，菌株 缺乏所有上文所列的活性和/或基因。在另一个实施方案中，用包含编码选自甲基乙二醛合酶(mgsA)、甘油脱氢酶 (gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的酶活性的基因的多核 苷酸，特别是用质粒pDP_mgdf转化例如通过使乙二醛酶A失活而产生的阿拉伯糖代谢和MG 至乳酸的代谢失活的菌株，然而，合成操纵子中基因的排列不限于质粒pDP_mgdf中显示的 排列，其可以是任何顺序。本发明还涉及未丧失阿拉伯糖代谢功能的菌株例如野生型大肠 杆菌。在另一个实施方案中，用赋予醛酮还原酶活性的质粒编码的基因转化优选丧失但 不必丧失MG至乳酸的代谢的活性的菌株。编码活性的基因获自一组大肠杆菌基因，包括 dkgA、dkgB、yeaE 禾口 yghZ。在优选实施方案中，用编码醛酮还原酶活性(例如大肠杆菌的DkgA)的质粒转化 表达甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶、丙二醇氧化还原酶(fucO)和甲基乙二醛合酶 (例如通过质粒pDP_mgdf)的菌株，然后将其培养在包含粗制甘油作为碳源的培养基中。在特别优选实施方案中，MG至乳酸的代谢失活并且表达甘油脱氢酶(gldA)、二羟 基丙酮激酶、丙二醇氧化还原酶(fucO)和甲基乙二醛合酶(例如质粒pDP_mgdf上编码的) 的菌株表达醛酮还原酶活性(例如，在质粒PCR2. 1上编码的大肠杆菌的dkgA)并且培养在 含有粗制甘油作为碳源的培养基中。本发明还提及未丧失阿拉伯糖代谢能力的菌株和/或从微生物的染色体表达本 发明中引述的相关酶活性的菌株。可使用本领域技术人员通常已知的任何技术将编码根据本发明的酶活性的多核 苷酸用于转化或转染宿主细胞。优先用于将此类基因引入菌株的技术是电穿孔，其对于本领域技术人员来说是熟 知的。简而言之，电穿孔方案可以如下将目的异源基因于启动子与终止子之间克隆入表达载体。该载体还具有抗生素抗性基因(用以选择含有其的细胞)和宿主菌株的功能性复制 起始点(这样其可得到保持)。方案需要制备电感受态细胞，然后用载体通过电穿孔转化 其。根据本发明，通过电穿孔引入的基因优选是根据本发明的编码选自甘油脱氢酶(gldA)、 二羟基丙酮激酶(dhaK)、甲基乙二醛合酶(mgsA)和丙二醇氧化还原酶(fucO)活性的酶活 性的基因。用于制备融合的有效连接的基因和在细菌或动物细胞中表达它们的方法在本领 域内是熟知的(Sambrook，同上)。本文中描述的基因构建体和方法可用于在例如原核宿主 中表达本发明的多肽。一般地，与宿主相关，使用含有促进插入的多核苷酸高效转录的启动 子序列的表达载体。表达载体通常包含复制起始点、启动子和终止子以及能够提供转化细 胞的表型选择的特定基因。可按照本领域内已知的获得最佳细胞生长的技术在发酵罐中生 长和培养转化的原核宿主。通常，将细胞于30°C下培养在适当的培养基中。本发明中的优选培养基是已知成 份培养基或合成培养基，例如含有甘油作为碳源的基本培养基M9。还可使用常用的商业上 制备的培养基例如Luria Bertani (LB)肉汤、Sabouraud Dextrose(SD)肉汤或酵母麦芽提 取物(YeastMalt Extract) (YM)肉汤并且微生物学或发酵科学领域内的技术人员知道用于 培养特定微生物的适当的培养基。还可将已知直接或间接调节分解代谢物抑制的试剂例如 环腺苷2' 3'-单磷酸或环腺苷2' 5'-单磷酸的用途整合入反应介质。类似地，还可 将已知调节酶促活性的导致1，2-PD的产量增加的试剂(例如，亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和碱 (alkalis))的用途与基因操作结合使用或作为对基因操作的另一选择使用。用于发酵的合适的pH范围是pH 5.0至？!1 9.0，其中？!1 6. O至pH 8. O优选作为 初始条件的范围。可在好氧条件、微氧条件或缺氧条件下进行反应，其中好氧条件或微氧条 件是优选的。分批发酵和连续发酵本发明使用分批发酵法。经典的分批发酵是封闭的系统，其 中在发酵开始时设定培养基的组成并且该组成在发酵过程中不经历人工改变。因此，在发 酵开始时，用期望的生物接种培养基，并且在不向系统加入任何东西的情况下允许发酵进 行。然而，通常就碳源的加入而言分批发酵是“分批的”并且经常在控制因子例如PH和氧气 浓度下进行尝试。分批系统的代谢产物和生物质组成持续变化直至发酵停止的时候。在分 批培养中，细胞缓慢通过静止延滞期(static lag phase)至高对数生长期以及最后至静止 期(此时生长率降低或停止)。如果不进行处理，静止生长期中的细胞将最终死亡。对数生 长期中的细胞负责终产物或中间产物的大量产生。标准分批系统的变型是也适合于本发明 的分批补料发酵系统O^ed-Batchfermentation system)。在分批系统的该典型的变型中， 随着发酵进行以递增的方式加入底物。当分解代谢物抑制倾向于抑制细胞的代谢时和在 期望在培养基中具有有限量的底物时，分批补料系统非常有用。分批补料系统中实际底物 浓度的测量是非常困难的，因此基于可测量因子例如PH、溶解氧和废气例如二氧化碳(CO. sub. 2)的分压的变化来估计其。分批和分批补料发酵在本领域内是常见的并且熟知的，实 例可见于Brock，同上。还预期方法可适用于连续发酵法。连续发酵是开放系统，其中向生物 反应器中连续加入已知成份的发酵培养基并且同时取出等量的条件化培养基以进行加工。 连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵允许 调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因子或许多因子。例如，一个方法可将限制性营养物例如碳源或氮气水平维持在固定比率并且允许调节所有其他参数。在其他系统中，可连 续改变许多影响生长的因子同时使通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统努 力保持稳态生长条件(steady state growth condition)，从而由于培养基被取走而引起 的细胞损失必须通过发酵中细胞的生长率来平衡。调节营养物和生长因子以进行连续发酵 过程的方法以及用于使产物形成的比率最大化的技术在工业微生物学领域中是熟知的，许 多方法由Brock(同上)详细描述。可使用分批、分批补料或连续方法进行本发明，并且任 何已知的发酵模式可以是合适的。此外，预期可将细胞作为完整的细胞催化剂固定在基质 上并且使其经历发酵条件以进行1，2-丙二醇的产生。然后可从已成熟生长的培养基或细胞裂解物分离1，2丙二醇产物。可通过任何 常规方法分离和纯化微生物或其它方式产生的丙二醇。用于从发酵或培养培养基纯化丙 二醇的方法在本领域内是已知的。例如，可通过使用有机溶剂、蒸馏和柱层析(美国专利 5，356，812)使反应混合物经历提取来从细胞培养基获得丙二醇。用于该方法的特别好的有 机溶剂是环己烷(美国专利5，008, 473)。为了进行工业应用，从大体积的发酵液纯化1，2_丙二醇需要非实验室规模方法。 待克服的困难包括从液体培养基中除去细胞物质(澄清)、通过提取或除去水分浓缩1， 2-丙二醇以及将残留的杂质与部分纯化的单体分离。通常通过过滤、离心或错流微孔过滤 (crossf lowmicrofiltration)进行肉汤澄清。适当的过滤器例如由 Mi 11 ipore (Mi 11 ipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, Mass.)或 Filmtec (Dow Chemical Co.)制造。离 心有效地除去了大量细胞，但取决于肉汤的性质，并非总是完全去除细胞。错流微孔过滤产 生极其澄清的滤液。浓缩物是浆体(slurry)而非高固体块(high-solidcake)。本领域技 术人员能够改进澄清方法以使其最适合于将使用的发酵装置和条件。减少澄清的肉汤中的 水因1，2_丙二醇在水中的高溶解度而变得复杂。从澄清的肉汤提取1，2_丙二醇可通过许 多方法来完成，包括蒸发/蒸馏、膜技术、利用有机溶剂和吸附进行的提取。可将旋转蒸发 器用于初步减少澄清内汤的水体积。该方法在申请者的手中已享有良好的成功。外源蛋白 质和盐的沉淀未显示影响1，2_丙二醇的回收。可分开地或与蒸发结合使用膜技术。合适 的膜可(i)允许1，2-丙醇通过，阻挡水和其他进料分子，(ii)允许水和其他分子通过，阻 挡1，2_丙二醇或(iii)允许水和1，2_丙二醇通过同时阻挡其他分子。在本发明中方法 (iii)是优选的。特别有用的是反渗透膜例如SW-302540(FilmteC，DOW Chemical Co.)和 由 Millipore (MilliporeCorporation，Bedford, Mass.)制造的 DL 和 SH 系列的反渗透膜。 在蒸发和膜浓缩后，可在有机溶剂中提取部分纯化的1，2_丙二醇。合适的溶剂可包括醇例 如叔戊醇、环戊醇、辛醇、丙醇、甲醇和乙醇。还可使用非醇例如辛酮、环己烷和戊醛。在本 发明的说明书中，醇是优选的并且乙醇是最优选的。可选择地，可通过咐附至不同的工业吸 附剂来进一步浓缩1，2-丙二醇。活性碳和环糊精聚合物例如由AmericanMaize Products Company生产的是特别合适的。在提取或吸附后，必须提纯部分纯化的1，2-丙二醇。可通 过电渗析(对于脱盐特别有用)实现提纯，所述电渗析利用阴离子和阳离子交换膜或双极 (阴极和阳极)膜(参见例如，Grandison, Alistair S.，(1996))的组合。本发明中的优 选提纯方法是蒸馏。可分批进行蒸馏，其中操作压力是环境压力或低于例如大约25in.Hg 的真空。蒸馏的监控显示按第一至最后的顺序蒸发的材料始于轻有机物、水、二元醇(包括 1，2_丙二醇)和最终重材料例如甘油和沉淀的固体。实施例下列实施例提供了举例说明的实施方案。根据本公开内容和本领域技术人员的一 般水平，本领域技术人员将理解下列实施例旨在仅为举例说明性的并且可使用许多变化、 改进和改变而不背离在此所述主题的范围。构建和扩增本发明中描述的菌株所必需的所有操作和技术对于本领域技术人员 来说是已知的。技术细节描述于例如Ausubel等人1995 ;Sambrook，J，2001和Miller, J. H. 1992中以及本发明中引用的相关公开案中。实施例1 一般方法1. 1菌株的培养在经设计包含低水平磷酸盐的已知成份基本培养基中培养大肠杆菌，因为磷酸盐 是已知的甲基乙二醛合酶抑制剂。每升培养基含有(NH4) 2S04-3g酵母抽提物_0，2gCoCl2-I，9e_6g双-(2-羟乙基)-亚胺基-三-(羟甲基)-甲烷-IOgKH2PO4-0,002gK2HPO4-0,0085gMgSO4-O, 225g微量元素溶液[Pfennig，1966]-Iml适当时，向培养基中加入抗生素。使用的浓度是庆大霉素，5yg/l，氨苄西林， 10μ g/1。从生物柴油生产获得粗制甘油，其具有85%的纯度。在培养试管(总体积30ml，接种物5ml)或用橡皮塞密封的玻璃瓶(总体积12ml， 接种物IOml)(以产生半缺氧条件)中常规地增殖大肠杆菌菌株。术语“在好氧条件下培 养”意指在搅拌的情况下在非密封容器中进行的培养。在该背景中半缺氧意指在不搅拌的 情况下在于好氧条件下制备的培养基中且在密封的容器例如在接种后用橡皮塞密封的瓶 中(以避免外部氧扩散进来)进行的菌株培养。分别地对于好氧和半缺氧条件，培养时间 在2至5天之间变化。一般地，当光密度不能再增加时终止实验。1.2 1，2_PD形成的分析利用3个不同的方法(包括比色测定、HPLC和GC-MS)测定培养肉汤的上清液中 的1，2-PD水平。然而使用阳离子交换柱的HPLC不能区分丙二醇的1，2_和1，3_异构体， 比色测定对于1，2-PD是特异性的。GC-MS分析允许同时分别定量两种异构体。检测水平是 0. 5g/l (对于HPLC分析)、50mg/l (对于比色测定)和10mg/l (对于GC-MS分析)。关于常规分析，利用由Jones和Riddick {Jones，1957}描述的比色法测定上清液 中的1，2-PD。基本上，将硫酸加入至无细胞上清液样品，混合，然后加热。此后，加入茚三酮 溶液和亚硫酸氢钠，混合并且温育1小时。加入另一等份的硫酸，记录相当于1，2-PD的浓 度的595nm处的吸收。关于定量分析，通过GC-MS分析测量样品中的1，2_PD。通过与真实材料相比相同的保留时间和利用质量指纹图谱(mass-fingerprinting)鉴定1，2_PD。实施例2 重组牛物的构建2. 1用于本发明的菌株和质粒将大肠杆菌MG1655(F-X-ilvG-rfb_50 rph_l)禾口 DH5 α (Γ，Φ 80dlacZ Δ Μ15、 Δ (lacZYA-argF)U169、deoR、recAl、endAl、hsdR17(rk、mk+)、phoA、supE44、λ \ thi_l、 gyrA96、relAl)及其衍生物用作产生1，2_PD的宿主。此外，MG1655的基因组DNA提供了用 于相关基因的扩增的来源。来自弗氏柠檬酸杆菌(CitrcAacterfreundii) (DSM30040)的基 因组DNA用作扩增dhaK基因的模板。2. 2基因的分离和克降作为第一步骤，将甘油脱氢酶gldA(SEQ ID NO :29)的大肠杆菌基因引入质粒 pB2araJ(图3a)或质粒pCR2. 1 (图北)。用于目的基因的扩增的所有引物列于表1中。将 引物gldH_forl和gldH_revl用于从大肠杆菌扩增1，104-bp gldA片段。将凝胶纯化的 PCR-片段插入pB2araJ载体的AatII-SwaI位点以产生pDP_g。在该质粒中，gldA-表达 处于启动子paraBAD的控制之下，从而允许受L-阿拉伯糖密切调控的可诱导的表达，如由 Guzman等人(Guzman, L. Μ.，1995)描述的。使用引物dhaK_forl和dhaK_revl从弗氏柠檬 酸杆菌扩增dhaK-基因。获得的1659-nt序列示于SEQ ID NO :27中，相应的蛋白质序列示 于SEQ ID N0:30中。将凝胶纯化的dhaK片段插入pDP_g的Swal-AscI位点，从而产生共 转录gldA和dhaK的pDP_gd。将引物fuc0_forl和fuC0_revl用于扩增来自大肠杆菌的编 码丙二醇氧化还原酶(fuc0)的1152-nt基因(SEQ ID NO :31)，将所述基因连接pDP_gd的 AvrII-SmaI位点以获得共转录gldA、dhaK和fucO的质粒pDP_gdf。使用引物mgsA_xhoI_ for和mgSA_XhoI_rev从大肠杆菌扩增示于SEQID NO 32中的大肠杆菌甲基乙二醛合酶的 mgsA的468-bp片段，然后将其以有意方向引入BioI位点以获得pDP_mgdf。因而在诱导时 从质粒pDP_mgdf转录的基因的连续物如下mgsA、gldA、dhaK、fucO和lacZ-α，然而剩下的 LacZ α-肽只用于在适当的宿主菌株(例如DH5 a )中进行转录研究。完整质粒pDP_mgdf 的nt序列示于SEQ ID NO 28中。使用Taq-聚合酶以及引物dkgB_up和dkg_dw或dkgA_up和dkgA_dw从大肠杆菌 扩增分别编码多功能MG-还原酶(SEQ ID NO :33)和4-硝基苯甲醛还原酶(SEQ ID NO 34) 的基因dkgA和dkgB。通过TA克隆(Invitrogen)将纯化的PCR产物引入载体pCR2. 1 (图 3b)。表1 用于将在pB2araJ或pCR2. 1中克隆的基因的PCR扩增的引物
权利要求
1.当在作为唯一碳源的甘油上生长时产生高水平的1，2-丙二醇的经工程改造的宿主 细胞。
2.根据前述权利要求的任一项的宿主细胞，其中甘油具有80%至90%的纯度。
3.根据前述权利要求的任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞已通过引入编码丙二醇 氧化还原酶活性的基因进行了工程改造。
4.根据权利要求3的宿主细胞，其中所述宿主细胞已通过引入至少一个另外的基因进 行了工程改造，所述另外的基因编码选自甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲 基乙二醛合酶(mgsA)的酶活性，所述宿主细胞就此表达所述酶活性和丙二醇氧化还原酶 活性(fucO)。
5.根据权利要求3的宿主细胞，其中所述宿主细胞已通过引入另外的基因进行了工程 改造，所述另外的基因编码甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶和甲基乙二醛合酶，所述宿主细胞 就此表达所述甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶和甲基乙二醛合酶活性以及丙二醇氧化还原酶 活性。
6.根据权利要求3的宿主细胞，其中所述宿主细胞已通过引入另外的基因进行了工程 改造，所述另外的基因编码甘油脱水酶，所述宿主细胞就此表达所述甘油脱水酶活性和丙 二醇氧化还原酶活性。
7.根据权利要求3的宿主细胞，其中所述宿主细胞已通过引入另外的基因进行了工程 改造，所述另外的基因编码醛酮还原酶，所述宿主细胞就此表达所述醛酮还原酶活性以及 丙二醇氧化还原酶活性。
8.根据前述权利要求的任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞在至少选自下列的化合 物的代谢中具有缺陷i)阿拉伯糖ii)甲基乙二醛iii)磷酸二羟丙酮。
9.根据前述权利要求的任一项的宿主细胞，当在作为唯一碳源的甘油上生长时其产生 高水平的1，2-丙二醇，但基本上不产生1，3-丙二醇。
10.根据所述权利要求9的宿主细胞，其为大肠杆菌。
11.多核苷酸分子，其包含处于诱导型启动子的控制之下的合成操纵子，所述操纵子包 含编码甘油脱氢酶(gldA)和丙二醇氧化还原酶(fucO)的基因。
12.多核苷酸分子，其包含处于诱导型启动子控制之下的合成操纵子，所述操纵子包含 另外的基因进行了工程改造，所述另外的基因编码丙二醇氧化还原酶(fucO)的基因和至 少一个编码选自甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶(dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的 酶蛋白。
13.根据权利要求12的多核苷酸分子，其包含处于诱导型启动子控制之下的合成操纵 子，所述操纵子包含编码丙二醇氧化还原酶(fucO)、甘油脱氢酶(gldA)、二羟基丙酮激酶 (dhaK)和甲基乙二醛合酶(mgsA)的基因。
14.根据前述权利要求的任一项的微生物，其包含根据权利要求11至13的任一项的多 核苷酸。
15.用于产生1，2_丙二醇的方法，其包括将根据权利要求1至10和14的任一项的宿主细胞培养在含有简单碳源，特别是粗制甘油制剂的适当的生长培养基中，之后回收和任 选地纯化所产生的1，2_丙二醇。
全文摘要
本发明涉及由甘油产生1，2-丙二醇(1，2-PD)的微生物的开发，然而甘油同时是用于1，2-PD和生物质产生的底物碳源。本发明显示任何类型的甘油可用作为1，2-PD生物合成的碳底物。微生物是重组生物，优选是大肠杆菌K12菌株或其衍生物，特别是降低1，2-PD产量的竞争性路径失活的菌株。
文档编号C12N1/20GK102089421SQ200980122082
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月16日 优先权日2008年7月28日
发明者G·缪尔, J·埃克, J·马姆派尔 申请人:科莱恩金融(Bvi)有限公司