专利名称：在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物和涉及编码lnt6多肽及其同源物的基因的相 ...的制作方法
技术领域：
本发明领域涉及植物育种和遗传学，具体地讲涉及植物中可用的赋予氮利用效率和/或氮限制条件耐受性的重组DNA构建体。
背景技术：
世界范围内非生物胁迫显著地限制了作物产量。据评估这些因素累积地造成平均 70%的农业产量减少。植物是固着的，必须适应它们周边的主要环境条件。这已经导致它们发展出基因调控、形态发生和代谢的高可塑性。适应和防御机制策略涉及激活编码对适应或防御不同胁迫重要的蛋白。植物氮吸收在它们的生长中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) 295-306 Q004))。植物从环境中的无机氮合成氨基酸。因此，氮肥已经成为提高栽培植物如玉米和大豆的产量有力工具。为了避免硝酸盐污染并保持足够的利润率，如今农民期望减少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生长和产量的提高。概括地说，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品种是所期望的。可利用激活标记来鉴定能影响性状的基因。已经在模型植物拟南芥属中使用该方法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入转录增强子元件能够显著激活和/或提高附近内源基因的表达。这种方法可以用于鉴定特定性状(例如植物的氮利用效率)的受关注的基因，当所述基因作为转基因进入生物中时能够改变该性状。发明概述本发明包括在一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、22、24、洸、28、30、31、33、 37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。 在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :18、20、22、对、26、沘、30、31、 33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。任选地，在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的所述对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的所述改变。在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性选自在绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性为产量或生物量并且所述改变为提高。在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物，其中所述植物选自玉米、 大豆、卡诺拉(canola)、稻、小麦、大麦和高粱。在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、洸、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或 47 进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述种子产生的植物在与不包含所述重组 DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性或至少一种农学特性的改变，或者两者皆有。在另一个实施方案中，增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或 47进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c) 获得源自步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组 DNA构建体，并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。在另一个实施方案中，评价植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组 DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或 47进行比较时，具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)评价该转子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。在另一个实施方案中，测定植物至少一种农学特性的改变的方法，所述方法包括 (a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、 44、45、46、或47进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获取来源于转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。任选地，所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性选自在绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。在另一个实施方案中，所述至少一种农学特性为产量或生物量并且所述改变为提
尚ο在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物选自玉米、 大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含 (a)编码多肽的核苷酸序列，其中SEQ ID N0:20、M、26J8、37或40的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法具有至少或 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100%互补的。所述多肽可包含SEQ ID N0:20、M、26J8、37或40的氨基酸序列，并且所述核苷酸序列可包含 SEQ ID NO :19、23、25、27、36 或 39 的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明任何分离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述分离的多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列，并且本发明涉及包含所述重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞可为真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞， 或者可为原核细胞，例如细菌。附图简述和序列表根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
图1示出pHSbarENDs2活化标记构建体的图谱，该构建体用于制备拟南芥属种群 (SEQ ID NO 1)ο图 2 示出载体 pDONR Zeo (SEQ ID NO :2)，GATEWAY 供体载体的图谱。attPl 位点位于核苷酸570-801 ；attP2位点位于核苷酸27M-2985 (互补链)。图 3 示出载体 pDONR 221 (SEQ ID NO :3)，GATEWAY 供体载体的图谱。attPl 位点位于核苷酸570-801 ；attP2位点位于核苷酸27M-2985 (互补链)。
图4示出载体pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷酸9695-9819 (互补链)。图5示出载体PHP27840 (SEQ ID NO 5)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸7310-7434 ；attR2位点位于核苷酸8890-9014。图6示出载体PHP23236(SEQ ID NO 6)的图谱，它是用于构建Gaspe Flint来源的玉米品系的表达载体的目的载体。attRl位点位于核苷酸2006-2130 ；attR2位点位于核苷酸 2899-3023。图7示出载体PHP10523 (SEQ ID NO :7)的图谱，该载体是存在于农杆菌菌株 LBA4404 中的质粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 165-174(1996) ；NCBI 通用标识符 59797027)。图8示出载体PHP23235 (SEQ ID NO 8)的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236 的载体。图 9 示出载体 PHP20234(SEQ ID NO 9)的图谱。图10示出目的载体PHP22655(SEQ ID NO 10)的图谱。图11示出用于筛选的五个品系(标记为1至5-每个品系有十一个个体)，加上野生型对照品系Cl (九个个体)的典型网格图案。图12示出通过图像分析测定的若干个不同硝酸钾浓度对植物颜色的效应。绿色区(色调50至66)对氮剂量的响应证明该区可被用于指示氮同化作用。图13为实施例18中用于半水栽玉米生长的培养基。图14是列出实施例18中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Flint衍生的玉米系生长和发育的影响相关的数据的图表。图15A-15G示出拟南芥LNT6多肽(SEQ ID NO 30)的全长氨基酸序列与SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、31、33、37、和 38 的 LNT6 同源物的多重比对。图16示出图15A-15G中显示的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值的图表。本文所附的序列描述和序列表遵循在37 C. F. R. § 1. 821-1. 825中所列出的用于专利申请公开中的核苷酸和/或氨基酸序列的规定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB标准的核苷酸序列的单字母编码和氨基酸序列的三字母编码，IUPAC-IUBMB标准描述于Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)中，它们引入本文以供参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R. § 1.822中所列出的规定。表1列出了本文所述的某些多肽、包含编码多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的对应标识符(SEQ ID NO:))。^ 1耐低氮蛋白(LNT)
权利要求
1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、 44、45、46、或47进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。
2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、 44、45、46、或47进行比较时具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
3.权利要求2的植物，其中所述至少一种农学特性是选自下列的至少一种绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、 果实含氮量、种子含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。
4.权利要求2或权利要求3的植物，其中在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的所述对照植物比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的所述改变。
5.权利要求2至4中任一项的植物，其中所述至少一种农学特性是产量或生物量，并且进一步地，其中所述改变是提高。
6.权利要求1至5中任一项的植物，其中所述植物选自玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、 大麦和高粱。
7.权利要求1至6中任一项的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA 构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与18、20、22、24、 26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46 或 47 进行比较时具有至少 50% 的序列同一性，并且其中从所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的氮胁迫耐受性或至少一种农学特性的改变，或者它们两者。
8.增加植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、 42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)获得源自步骤(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出提高的氮胁迫耐受性。
9.评估植物氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、 42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(d)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的氮胁迫耐受性。
10.测定植物农学特性的改变的方法，所述方法包括(a)将重组DNA构建体弓丨入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比对方法在与 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、 42、43、44、45、46或47进行比较时具有至少50%的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(d)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
11.权利要求10的方法，其中所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在氮限制条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述至少一种农学特性是选自下列的至少一种绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、 总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、早期幼苗活力、和低温胁迫下的出苗。
13.权利要求10至12中任一项的方法，其中所述至少一种农学特性是产量或生物量， 并且进一步地，其中所述改变是提高。
14.权利要求8至13中任一项的方法，其中所述植物选自玉米、大豆、卡诺拉、稻、小麦、大麦和高粱。
15.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)编码具有LNT6多肽活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比对方法在与SEQ ID NO :20、对、26、沘、37或40进行比较时具有至少90%的序列同一性，其中所述Clustal V比对方法采用以下逐对比对默认参数=KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5，和 DIAGONALS SAVED = 5，或(b)(a)的核苷酸序列的全长互补序列。
16.权利要求15的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQID NO =20,24,26,`28,37.或 40。
17.权利要求15的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQID NO 19、23、25、27、36或39。
18.包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列的权利要求15至17中任一项的多核苷酸。
全文摘要
本发明公开了尤其可用于在氮限制条件下改变植物农学特性的分离的多核苷酸和多肽以及重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建体的组合物(如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码LNT6多肽或其同源物。
文档编号C12N15/82GK102203263SQ200980143409
公开日2011年9月28日 申请日期2009年9月9日 优先权日2008年10月29日
发明者D·劳塞尔特, H·萨凯, M·奥克曼, S·M·艾伦, S·V·廷盖, S·卢克 申请人:先锋国际良种公司, 纳幕尔杜邦公司