Oip5作为用于癌症治疗和诊断的靶基因的制作方法

专利名称：Oip5作为用于癌症治疗和诊断的靶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症研究、癌症诊断和癌症治疗领域。 此外，本发明涉及筛选用于治疗和/或预防癌症的药剂的方法。
背景技术：
肺癌是全世界癌症死亡的首要原因，而非小细胞肺癌(NSCLC)占到那些病例的几乎 80% (Greenlee RT, et al.，CA Cancer J Clin 2001;51:15-36)。食道鳞状细胞癌 (ESCC)是消化道的最致命恶性肿瘤之一，而且在诊断时大多数患者处于晚期(Shimada H， et al.，Surgery 2003 ；133 :486-94)。尽管使用与各种治疗模态(诸如放疗和化疗)组合的现代手术技术，ESCC的总体5年存活率仍然保持于40%至60% (Tamoto E，et al., Clin Cancer Res 2004 ;10 :36四_38)，而肺癌的总体 5 年存活率只有 15% (Greenlee RT, et al.，CA Cancer J Clin 2001 ；51 15-36)。为了分离用于诊断、治疗、和/或预防肺癌和食道癌的潜在治疗分子靶，使用含有27，648种基因的cDNA微阵列对来自101名肺癌和19名ESCC患者的癌细胞的基因表达序型实施了基因组范围的分析(W02004/031413，W02007/013665, W02007/013671, Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53, Kikuchi T, et al., Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Kakiuchi S, et al. , Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99, Kakiuchi S, et al. , Hum Mol Genet 2004 ；13 :3029-43,Kikuchi Τ,et al. ，Int J Oncol 2006 ；28 :799-805, Taniwaki M, et al. ， Int J Oncol 2006 ；29 567—75，& Yiimiibuki T, et al. , Int JOncol 2006;28:1375-84)。为了验证各基因产物的生物学和临床病理意义，借助RNAi技术及使用临床肺癌材料的肿瘤组织微阵列分析，实施了功能丧失效果的高 fflfiffit (Suzuki C, et al. ， Cancer Res 2003 ；63 :7038-41, Ishikawa N, et al. ， Clin Cancer Res 2004 ；10 :8363-70, Kato T, et al.，Cancer Res2005 ；65 :5638-46, Furukawa C, et al. , Cancer Res 2005 ；65 :7102-10, Ishikawa N, et al. , Cancer Res 2005 ；65 9176-84, Suzuki C, et al. , Cancer Res2005；65 :11314-25, Ishikawa N, et al. , Cancer Sci 2006 ；97 :737-45, Takahashi K, et al. Cancer Res 2006 ；66 :9408-19, Hayama S, et al. , Cancer Res2006 ；66 :10339-48,Kato Τ,et al. ,Clin Cancer Res 2007 ；13 :434-42, Suzuki C,etal. ,Mol Cancer Ther 2007 ；6 :542-51,Yamabuki Τ, et al. , Cancer Res2007 ； 67 :2517-25, Hayama S, et al. , Cancer Res 2007 ；67 :4113-22, Kato Τ, et al. , Cancer Res 2007 ；67 :8544-53,Taniwaki Μ, et al. ,Clin Cancer Res2007 ；13 :6624-31, Ishikawa N，et al., Cancer Res 2007 ；67 :11601-11,Mano Y, etal. , Cancer Sci 2007 ；98 :1902-13, Suda Τ, et al. , Cancer Sci 2007 ；98 :1803-8, Kato Τ, et al. , Clin Cancer Res 2008 ；14 :2363-70 及 Mizukami Y, et al.，Cancer Sci 2008 ；99 :1448-54)。
通过酵母双杂交分析发现0IP5(opa相互作用蛋白5)与淋病奈瑟氏菌(Neisseria Gonorrhoeae)不透明相关(Opa)蛋白相互作用(Williams，J. Μ.，et al.，Mol Microbiol 1998 ；27(1) :171-86)。0IP5涉及淋球菌粘附及侵袭人上皮细胞。一项先前的研究证明了人胃癌中升高的 0IP5mRNA 表达(Nakamura Y, et al.，Ann Surg Oncol 2007 ；14 :885-92.)， 而且先前报告说一些蛋白，诸如Rafl，与0IP5相互作用(Yuryev, A. and L. P. ffennogle, Genomics 2003 ；81(2) :112-25)，然而，尚未阐明0IP5在致癌作用中的生物学作用。 引用表专利文献W02004/031413 [PTL 2]W02007/013665 [PTL 3]W02007/013671 非专利文献Shimada H, et al.，Surgery 2003；133 :486-94 [NPL 3]Tarmoto E, et al.，Clin Cancer Res 2004 ；10 :3629-38 [NPL 4]Daigo Y and Nakamura Y,Gen Thorac Cardiovasc Surg2008 ；56 :43-53 [NPL 5]Kikuchi Τ, et al. , Oncogene 2003；22 :2192-205 [NPL 6]Kakiuchi S, et al. ，Mol Cancer Res 2003 ；1 :485-99 [NPL 7]Kakiuchi S, et al.，Hum Mol Genet 2004；13 :3029-43 [NPL 8]Kikuchi Τ, et al.，Int J Oncol 2006；28 :799-805 [NPL 9]Taniwaki Μ, et al. ， Int J Oncol 2006；29 :567-75 [NPL 10] Yamabuki Τ, et al.，Int J Oncol 2006 ；28 :1375-84 [NPL 11]Suzuki C,et al.，Cancer Res 2003 ；63 :7038-41 [NPL 12]Ishikawa N, et al.，Clin Cancer Res 2004；10 :8363-70 [NPL 13]Kato Τ,et al.，Cancer Res 2005；65 :5638-46 [NPL 14]Furukawa C, et al.，Cancer Res 2005；65 :7102-10 [NPL 15]Ishikawa N, et al.，Cancer Res 2005；65 :9176-84 [NPL 16] Suzuki C, et al. , Cancer Res 2005 ；65 :11314-25 [NPL 17]Ishikawa N, et al.，Cancer Sci 2006；97 :737-45 [NPL 18]Takahashi K, et al. Cancer Res 2006 ；66 :9408-19 [NPL 19]Hayama S, et al.，Cancer Res 2006 ；66 :10339-48 [NPL 20]Kato Τ, et al.，Clin Cancer Res 2007 ；13 :434-42 [NPL 21]Suzuki C,et al. ，Mol Cancer Ther 2007 ；6 :542-51 [NPL 22]Yamabuki Τ, et al.，Cancer Res 2007；67 :2517-25 [NPL 23]Hayama S, et al.，Cancer Res 2007；67 :4113-22 [NPL 24]Kato Τ,et al.，Cancer Res 2007；67 :8544-53 [NPL 25]Taniwaki Μ, et al. ，Clin Cancer Res 2007 ；13 :6624-31 [NPL 26]Ishikawa N, et al.，Cancer Res 2007 ；67 :11601-11
[NPL 27]Mano Y, et al.，Cancer Sci 2007 ；98 :1902-13[NPL 28]Suda T,et al.，Cancer Sci 2007；98 :1803-8[NPL 29]Kato T,et al.，Clin Cancer Res 2008；14 :2363-70[NPL 30]Mizukami Y, et al.，Cancer Sci 2008；99 :1448-54[NPL 31]ffilliams, J. Μ. , et al.，Mol Microbiol 1998 ；27(1) :171-86[NPL 32]Yuryev, A. and L. P. ffennogle, Genomics 2003 ；81 (2)[NPL 33]Nakamura Y, et al.，Ann Surg Oncol 2007 ；14 :885-92.发明概述在本发明中，公开了 0IP5过表达能促成肺癌和食道癌细胞的恶性性质。因此，靶向0IP5分子可能有希望开发肺癌和食道癌的临床管理中的新诊断和治疗策略。特别地，本发明源自如下的发现，即由特定序列(特别是SEQ ID N0:11和12)构成的双链分子有效抑制肺癌和/或食道癌细胞的细胞生长。具体地，本发明提供了靶向0IP5 基因的小干扰RNA(SiRNA)。这些双链分子可以以分离的状态利用，或者在载体中编码并自载体表达。因而，本发明的一个目的是提供此类双链分子以及表达它们的载体和宿主细胞。在一个方面，本发明提供了用于抑制细胞生长及治疗肺癌和/或食道癌的方法， 其通过将本发明的双链分子或载体施用于需要它们的受试者来进行。此类方法涵盖对有此需要的受试者施用由一种或多种本发明双链分子或载体构成的组合物。在另一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的组合物，其含有至少一种本发明双链分子或载体。在又一个方面，本发明提供了一种诊断或确定受试者中对肺癌和/或食道癌的倾向性的方法，其通过测定源自患者的生物样品中的0IP5表达水平来进行。0IP5基因表达水平与该基因的正常对照水平相比的升高指示受试者患有或有风险形成肺癌和/或食道癌。此外，本发明涉及如下的发现，即0IP5的高表达水平与较差存活率相关。因此，本发明提供了一种用于评估或确定肺癌和/或食道癌患者的预后的方法，该方法包括下述步骤检测0IP5的表达水平，将它与预确定的参照水平比较并根据它们之间的差异来确定患者的预后。在又一个方面，本发明提供了一种筛选用于治疗和/或预防肺癌和/或食道癌的化合物的方法。此类化合物可结合0IP5多肽或降低0IP5多肽的生物学活性或降低0IP5 基因或替代0IP5基因的报道基因的表达或抑制0IP5多肽与Rafl多肽之间的结合或抑制 0IP5多肽的磷酸化。本领域的技术人员会理解，本发明的一个或多个方面可以满足某些目的，而一个或多个其它方面可以满足某些其它目的。每一个目的可能不在全部方面均同等地适用于本发明的每一个方面。因此，前述目的可以择一地适用于本发明的任何一个方面。在联系附图和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的发明概要和后面的详细说明都仅仅提出了优选的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。附图简述本领域技术人员在考虑了下文的附图简述和本发明的详细描述及其优选实施方案后，将更明了本发明的不同方面和应用


图1，图1描绘肺癌和食道癌和正常组织中的0IP5表达。在A部分中，描绘了通过半定量RT-PCR分析检测的正常肺组织和15份临床肺癌样品[肺腺癌(ADC)JiSCCdP SCLC ；顶部小图]和15种肺癌细胞系(底部小图)中的0IP5表达。在B部分中，描绘了通过半定量RT-PCR分析检测的正常食道和10份临床ESCC组织样品(顶部小图)和10种 ESCC细胞系(底部小图)中的0IP5表达。在C部分中，描绘了 SBC-5细胞中内源0IP5蛋白的亚细胞定位。0IP5在核和胞质中被染色。DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。在D 部分中，描绘了 16种正常人组织中0IP5转录物的Northern印迹分析的结果。在睾丸中观察到强信号。图2，图2描绘了 0IP5蛋白表达及其与NSCLC患者的较差临床结果的关联。在A 部分中，描绘了肺癌(鳞状细胞癌，xlOO)和正常肺(xlOO)中0IP5表达的代表性例子，及放大视图(x200)。在B部分中，描绘了 NSCLC患者中的肿瘤特异性存活依照0IP5表达水平的Kaplan-Meier分析的结果(P < 0. 0099 ；时序检验)。图3，图3描绘了 0IP5对细胞生长的影响。在A部分中，描绘了通过半定量 RT-PCR (顶部小图)分析的LC319(左边)和SBC5(右边)细胞中响应si_0IP5 (si_l和-2) 或对照siRNA(LUC和On-Target plus/CNT)的0IP5表达。特别地，通过MTT测定评估的 LC319或SBC-5细胞响应si-l、si-2、si_LUC、或si-CNT的存活力(中部小图)。经特异性 siRNA或对照siRNA转染的LC319和SBC-5细胞的集落形成测定(底部小图)。所有实验以一式三份测定来进行。在B部分中，描绘了 0IP5对C0S-7细胞生长的影响。特别地，通过 Western印迹分析检查的，C0S-7细胞中的0IP5表达(左边顶部小图)。经pCAGGSn3Fc_0IP5 或模拟载体转染的细胞均以一式三份来培养，并通过MTT测定法来评估细胞存活力(右边小图)。自经0IP5表达质粒转染的细胞衍生的集落的大小和数目均大于用模拟载体转染的细胞(左边底部小图)。图4，图4描绘了内源和外源0IP5的磷酸化。特别地，通过用λ -PPase处理，内源或外源0ΙΡ5的上部(磷酸化的)条带减少了。图5，图5描绘了肺癌和食道癌及正常组织中的0ΙΡ5表达。在A部分中，通过 Western印迹分析检查了肺癌细胞系中的0IP5表达。ACTB表达充当数量对照。在B部分中，描绘了 SBC-5细胞中内源0IP5蛋白的亚细胞定位。0IP5在核和胞质中被染色。DAPI 指4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。图6，图6描绘了正常组织及肺癌和食道癌中的0IP5蛋白表达。在A部分中，描绘了 23种正常人组织中0IP5转录物的Northern印迹分析。在睾丸中观察到强信号。在 B部分中，通过免疫组织化学染色检测六种正常人组织以及多种组织学类型的肺癌和ESCC 中的0IP5表达(放大100倍)。阳性染色主要出现在睾丸细胞和肺癌细胞的核和胞质中。图7，图7描绘了 0IP5表达与NSCLC和ESCC患者的较差临床结果的关联。在 A部分中，描绘了肺癌(鳞状细胞癌)和正常肺中0IP5表达的代表性例子(顶部XlOO ； 底部X200)。在B部分中，描绘了 NSCLC患者的肿瘤特异性存活依照0IP5表达水平的 Kaplan-Meier分析(P = O. 0053 ；时序检验)。在C部分中，描绘了 ESCC和正常食道中0IP5 表达的代表性例子(顶部X100;底部X200)。在D部分中，描绘了 ESCC患者中的肿瘤特异性存活依照0IP5表达水平的Kaplan-Meier分析(P = 0. 0129 ；时序检验)。图8，图8描绘了 0IP5蛋白经由它与Rafl蛋白的相互作用而稳定化。在A部分中，描绘了肺癌细胞中外源0IP5与内源Rafl蛋白的相互作用。使用M2-Flag琼脂糖和来自经pCAGGSn3FC-0IP5-Flag转染且表达内源Rafl的C0S-7细胞的提取物进行免疫沉淀。使用抗Rafl多克隆抗体对免疫沉淀物进行Western印迹分析以检测内源Rafl。IB指免疫印迹；IP指免疫沉淀。在B部分中，描绘了肺癌细胞系中的0IP5和Rafl蛋白表达。0IP5的表达样式显示较好地符合Rafl蛋白的表达样式。在C部分中，描绘了 Rafl表达对0IP5蛋白水平的影响。在左边小图中，描绘了 Rafl敲低对0IP5蛋白水平的影响。通过经Si-Rafl 转染的SBC-5细胞中的半定量RT-PCR分析和Wfestern印迹分析检测内源Rafl和0IP5转录物以及它们的编码蛋白的表达。在右边小图中，描绘了 Rafl过表达对0IP5蛋白水平的影响。通过经Rafl表达载体转染的SBC-5细胞中的半定量RT-PCR分析和Wfestern印迹分析检测Rafl和0IP5转录物和蛋白的表达水平。图9，图9描绘了增补图。在A部分中，描绘了用于检查抗体对0IP5的特异性的抗原阻断测定法。将抗0IP5抗体与重组0IP5蛋白一起温育，之后进行免疫组织化学染色 (抗0IP5+rh0IP5)。与rh0IP5 —起预温育减少了肺癌组织中由抗0IP5抗体获得的阳性信号(Anti-0IP5)。在B部分中，描绘了 0IP5增强C0S-7的细胞侵袭性。通过^festern印迹分析检查C0S-7细胞中的0IP5表达(左边顶部小图)。Matrigel基质中的测定证明了用 pCAGGSn3FC-0IP5-Flag转染后C0S-7细胞的侵袭性质。显示了吉姆萨染色(底部小图；放大100倍)和迁移穿过基质胶包被的滤膜的细胞相对数目(右边顶部小图)。在C部分中， 描绘了 0IP5与Rafl蛋白的直接相互作用。使用抗His抗体和带His标签的0IP5与GST 融合的重组Rafl蛋白的混合物进行0IP5蛋白的下拉。然后使用针对Rafl的多克隆抗体 (Cell Signaling Technology)进行Western印迹来检测结合0IP5的Rafl蛋白。在D部分中，描绘了通过半定量RT-PCR检测的肺癌细胞系中的Rafl表达。实施方案的描述尽管与本文描述相似或等价的任何方法和材料可用于实践或测试本发明实施方式，在此仍描述了优选方法、装置、与材料。然而，在描述本发明的材料与方法之前，应理解本发明并不限于本文中的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案等，因其可根据常规实验与优化而有变化。亦应理解本描述所用的命名法仅以描述特定版本或实施例为目的，并非意欲限定本发明的范围，所述范围仅由权利要求所限定。通过本文中的述及而具体收录本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的整个公开内容。然而，本文中无一处要解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开。当存在冲突时，应以本说明书所述为准，包括定义在内。另外，材料、方法、和实施例仅仅是例示性的，而非意图是限制性的。^X除非另有具体指明，如本文中使用的词语“一个”、“一种”、和“该”意思是“至少一个”。如本文中使用的，术语“生物样品”指整个生物体或其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不仅限于，血液、血清、血浆、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、脐带血 (amniotic cord blood)、尿液、阴道液和精液)的子集(subset)。术语“生物样品”进一步指从整个生物体或其细胞、组织或组成部分的子集制备的勻浆物、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物样品”指含有细胞组分(诸如蛋白质或多核苷酸)的培养基，诸如生物体已在其中繁殖的营养汤或凝胶。术语“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、和“核酸分子”在本文中可互换使用，指核酸残基的多聚物，而且，除非另有具体指明，用其通常为人接受的单字母代码进行指代。所述术语适用于其中一个或更多核酸通过酯键连接的核酸(核苷酸)多聚体。所述核酸多聚体可包括DNA、RNA或其组合，而且涵盖天然出现的和非天然出现的核酸多聚体。术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的多聚体。 这些术语指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物的氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是修饰残基，或非天然存在的残基，诸如对应天然存在残基的人工化学模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码子编码的氨基酸，以及在细胞内翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸)。词组“氨基酸类似物”是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(α碳与一个氢、一个羧基、一个氨基和一个R基团连接)，但具有经过修饰的R基团或经过修饰的骨架的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。词组“氨基酸模拟物”是指这样的化合物，其具有与一般氨基酸不同的结构，但具有与一般氨基酸相似的功能。在这里，氨基酸可以用它们公知的三字母符号表示，或者用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表不。除非另有定义，术语“癌症”指过表达0ΙΡ5基因的癌症。过表达0ΙΡ5的癌症的例子包括但不限于肺癌和食道癌。基因或蛋白本发明的感兴趣基因的核酸和多肽序列示于下列数字，但不限于它们；0ΙΡ5 :SEQ ID NO :13 和 14Rafl :SEQ ID NO 17 和 18另外，序列数据亦可通过下述登录号获取0IP5 :NM_007280 ；Rafl :NM_002880 ；依照本发明的一个方面，功能等同物亦被认为是上述“多肽”。在本文中，蛋白的 “功能等同物”为具有与该蛋白等同的生物学活性的多肽。也就是，任何保留初始参照肽的生物学能力的肽均可用作本发明中的此类功能等同物。此类功能等同物包括那些对蛋白的天然存在氨基酸序列替代、删除、添加、或插入一个或多个氨基酸的功能等同物。或者，多肽可包含与相应蛋白的序列具有至少约80%同源性(也称作序列同一性)，更优选与参照序列具有至少约90%至95%同一性，甚至更优选96%至99%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，多肽可以由在严格条件下与基因的天然存在核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。本发明的多肽可在其氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、或形式等方面有变化，这取决于用于产生它的细胞或宿主，或使用的纯化方法。无论如何，只要它具有与本发明的人类蛋白的功能等同的功能，它就在本发明的范围内。短语“严格(杂交)条件”指这样的条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交，通常在复杂的核酸混合物中，而没有与其它序列的可检测的杂交。严格条件取决于
10序列，而且在不同情况中会有所变化。较长的序列在更高的温度下发生特异性杂交。对于核酸杂交详尽指导可见于 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridizaion and the strategy of nucleic acid assays，，(1993)。 一1 ^/eH-^t 件选择为在限定的离子强度PH下，比特定序列的热熔点(Tm)低大约5-10°C。1是如下的温度(在限定的离子强度、PH和核酸浓度下)，在该温度下，50%的与靶互补的探针在平衡时与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm，在平衡时50%的探针被占据)。严格条件还可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选背景杂交的10倍。例示性的严格杂交条件包括如下50%甲酰胺、 5xSSC、和 1% SDS，在 42°C温育，或 ^cSSCU % SDS、在 65°C温育，用 0. 2xSSC 和 0. SDS 在 50°C清洗。在本发明的语境中，用于分离编码与上述人类蛋白功能等同的多肽的DNA的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，可用下述步骤进行杂交在68摄氏度用 "Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)进行30分钟或更长的预杂交，添加经过标记的探针，并在68摄氏度温育一小时或更长。下面的清洗步骤可在例如低严格度条件中进行。一种例示性的低严格度条件可包括42°C、2xSSC与0. 1 % SDS，优选50°C、2xSSC与0. 1 % SDS。经常优选使用高严格条件。一种例示性的高严格条件可包括在室温在hSSC、0. SDS中清洗3次各20分钟，然后在lxSSC、0. 1 % SDS中在37摄氏度清洗3次各20分钟，并在lxSSC、0. 1% SDS中在50摄氏度清洗2次各20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度，可影响杂交的严格度，而且本领域技术人员可选择合适的因素以达到所需的严格度。一般地说，蛋白中一个、两个或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能。事实上，已知突变的或经过修饰的蛋白(即由如下氨基酸序列构成的肽，其中通过替代、删除、 插入和/或添加而修饰了一个、两个或几个氨基酸残基)可保留原始的生物学活性(Mark et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6(1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79 6409-13(1982))。因而，本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别添加、删除、插入、或替代，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰，其中蛋白的改变产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明的语境中可接受的。如此，在一个实施方案中，本发明的肽可具有如下的氨基酸序列，其中添加、插入、删除、和/或替代参照序列中的一个、两个或更多个氨基酸。只要保持蛋白的活性，氨基酸突变的数目不受特别限制。然而，一般优选改变氨基酸序列的5%或更少。因而，在一个优选的实施方案中，在此类突变体中要突变的氨基酸数目一般为30个氨基酸或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选 5或6个氨基酸或更少，甚至更优选3或4个氨基酸或更少。要突变的氨基酸残基优选突变为氨基酸侧链特性保持的另一种氨基酸(称为保守性氨基酸替代的过程)。氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y， V)、亲水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S, T)、和具有下列共同官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基基团的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含有碱的侧链(R，K，H)；和含有芳香族的侧链(H，F，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本领域是公知的。例如，下列8个组各种包含彼此构成保守性替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。此类保守性修饰多肽包括在本发明的蛋白中。然而，本发明并不仅限于此，而且包括非保守性修饰，只要蛋白的至少一种生物学活性得以保留即可。另外，经过修饰的蛋白并不排除多态变体、种间同源物、和那些由这些蛋白的等位基因编码的。此外，本发明的基因涵盖编码蛋白的此类功能等同物的多核苷酸。除了杂交之外， 还可以利用基因扩增方法来分离编码与蛋白功能等同的多肽的多核苷酸，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，通过使用基于上述信息的序列合成的引物。分别构成人类基因和蛋白的功能等同物的多核苷酸和多肽通常与其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常指40 %或更高的同源性，优选60 %或更高，更优选80 %或更高，甚至更优选90 % 至95%或更高，甚至更优选96%至99%或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循 "Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80 :7洸_30 (1983) ” 中的算法来确定。双链分平本文中使用的术语“分离的双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括，例如，小干扰RNA(siRNA，例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))与小干扰DNA/ RNA(siD/R-NA,例如DNA与RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA与RNA的小发夹嵌合体 (shD/R-NA))。本文中使用的术语“siRNA “指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA 导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括0IP5有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、0IP5反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列和与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火而形成了双链RNA分子。所述两条链的核苷酸序列可不仅包含选自靶基因序列中蛋白质编码序列的“有义”或“反义” RNA，亦可包括具有选自所述靶基因非编码区域的核苷酸序列的RNA分子。在本说明书中使用的术语“shRNA”是指具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”
在本说明书中使用的术语“siD/R-NA”是指由RNA和DNA 二者组成的双链多核苷酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。在本说明书中，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的多核苷酸和由RNA组成的多核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞的常规技术。所述siD/R-NA包括0IP5有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、0IP5反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。siD/R-NA可以这样构建， 使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/ R-NA 可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包含具有选自靶基因的非编码区的核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA 的两个分子中的一个或两个均由RNA和DNA 二者组成(嵌合体分子)，或者一个分子由RNA 组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。在本文中使用的术语“shD/R-NA”是指具有茎-环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使它们之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。本说明书中使用的“分离的核酸”是指从本来的环境(例如，若是天然存在的，则为自然环境)中被取出，从而与其自然状态相比发生了合成性的改变的核酸。在本发明的语境中，分离的核酸的实例包括DNA、RNA和它们的衍生物。与靶mRNA杂交的针对0IP5的双链分子通过与正常单链mRNA基因转录物结合，干扰其翻译，抑制蛋白质表达，来降低或抑制由0IP5基因编码的0IP5蛋白的产生。如本文中证明的，在肺癌和/或食道癌细胞系中0IP5的表达被dsRNA抑制(图3A)。因而，本发明提供了有能力在导入表达0IP5基因的细胞后抑制该基因表达的分离双链分子。所述双链分子的靶序列可通过siRNA设计算法来设计，例如下述的。0IP5靶序列的例子包括例如核苷酸诸如SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO :13 的 79_97nt)SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO :13 的 557_575nt)本发明中特别感兴趣的是下文所列双链分子[1]至[18][1] 一种分离的双链分子，它当被导入细胞后，抑制0IP5的体内表达及细胞增殖， 所述分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子；[2] [1]中所述的双链分子，其中所述双链分子对mRNA起作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO :13 的 79_97nt)，SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 557_575nt)；[3] [2]中所述的双链分子，其中所述有义链包括对应于选自下组的靶序列的序列=SEQ ID NO :11 和 12 ；[4] [3]中所述的双链分子，具有少于约100个核苷酸的长度；
[5] [4]中所述的双链分子，具有少于约75个核苷酸的长度；[6] [5]中所述的双链分子，具有少于约50个核苷酸的长度；[7] [6]中所述的双链分子，具有少于约25个核苷酸的长度；[8] [7]中所述的双链分子，具有约19到约25个核苷酸的长度；[9] [1]中所述的双链分子，其由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；[10] [9]中所述的双链分子，其具有通式5' _[A]-[B]-[A' ]_3'，其中，[Α]为包含与选自SEQ ID NO 11和12中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含[A]的互补序列的反义链；[11] [1]中所述的双链分子，其由RNA构成；[12] [1]中所述的双链分子，其由DNA和RNA构成；[13] [12]中所述的双链分子，其中所述分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；[14] [13]中所述的双链分子，其中所述有义链与反义链分别由DNA与RNA构成；[15] [12]中所述的双链分子，其中所述分子为DNA与RNA的嵌合体；[16] [15]中所述的双链分子，其中反义链3’端侧翼的区域为RNA，或者有义链5’ 端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均为RNA ；[17] [16]中所述的双链分子，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；[18] [1]中所述的双链分子，其中所述分子包含3’突出端；本发明所述的双链分子将在下面更详细描述。设计具有抑制细胞内靶基因表达能力的双链核酸分子的方法是已知的(见例如， 美国专利No. 6，506，559，本文通过提述并入引用其全部内容)。例如，可以从Ambion网站 (http //www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_f inder. html)获得用于设计 siRNA 的计
算机程序。该计算机程序可以根据如下的方案选择双链核酸分子的靶核苷酸序列。靶点的选择1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描搜寻AA双核苷酸序列。记录每个 AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶点。Tuschl等不建议针对5’和 3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白的结合位点，而UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA 核酸内切酶复合物的结合。2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列显著同源的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST (Altschul SF等，Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17) :3389-402)，其可见于 NCBI 服务器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/o3.选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。使用上述实验方案，设计本发明中分离双链分子的靶序列为下述对0IP5 基因，SEQ ID NO :11 禾口 12。对以上述靶序列为目标的各双链分子，检查其阻抑表达靶基因的细胞的生长的能力。因此，本发明提供以选自下组的任何序列为靶标的双链分子对于0IP5 基因，SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO :13 的 79_97nt)和 12(位于 SEQ ID NO 13 的 557-575nt)。本发明的双链分子可以靶向单个0IP5基因序列，或可以靶向多个0IP5基因。以上述靶序列0IP5基因为靶标的本发明的双链分子包括含有靶序列和/或与靶序列互补的序列的任何核酸序列的分离多核苷酸。以0IP5基因为靶的多核苷酸例子包括那些含有序列SEQ ID NO :11或12和/或这些核苷酸的互补序列的多核苷酸；然而，本发明并不仅限于这些例子，上述核酸序列中的次要修饰是可以接受的，只要所述经修饰分子保留阻抑0IP5基因表达的能力。本文中，短语“次要修饰”当用于和核酸序列时表示对所述序列替换、缺失、添加或插入一个、两个或几个核酸。在本发明的语境下，术语“几个”当用于核酸替换、缺失、添加和/或插入时可意指 3-7个，优选3-5个，较优选3-4个，最优选是3个核苷酸残基。根据本发明，本发明的双链分子可用实施例中使用的方法检测其能力。在后述的实施例中，依照标准方法在体外对包含0IP5基因的mRNA不同部分的有义链或其互补的反义链的双链分子测验其在肺癌和/或食道癌细胞系中降低0IP5基因产物产生的能力。进一步，例如，与在缺乏候选分子情况下培养的细胞相比在与候选双链分子接触的细胞中0IP5 基因产物的减少，可通过例如使用在实施例1 “半定量RT-PCR”项下提到的针对0IP5 mRNA 的引物进行RT-PCR来检测。然后可对在体外基于细胞的分析中减少0IP5基因产物的序列检测其针对细胞生长的抑制作用。然后对在体外基于细胞的分析中抑制细胞生长的序列使用患癌症动物检测其体内的相应能力，以证实0IP5基因产物的产生降低与癌细胞生长降低，所述动物的例子包括裸鼠异种移植模型。当所述分离多核苷酸是RNA及其衍生物时，核苷酸序列中的“t”应替换为“U”。本文中使用的术语“互补”指多核苷酸中核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，且术语结合意指两个多核苷酸间物理的或化学的相互作用。当所述多核苷酸包含修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯酶连结时，这些多核苷酸亦可以同样地发生相互结合。一般而言，互补多核苷酸序列在合适条件下杂交以形成包含很少或没有错配的稳定双链体。进一步，本发明中所述分离多核苷酸的有义链与反义链可通过杂交形成双链分子或发夹环结构。在优选实施方案中，上述双链体在每10个匹配中包含不超过一个错配。在特别优选的实施方案中，其双链体的链完全互补，该双链体不包含错配。对0IP5所述多核苷酸长度优选少于1249个核苷酸。举例而言，对所述的所有基因，多核苷酸长度小于500、200、100、75、50或25个核苷酸。本发明中所述的分离多核苷酸可用于形成针对0IP5基因的双链分子，或制备编码双链分子的模板DNA。当所述多核苷酸用于形成双链分子时，所述多核苷酸可长于19个核苷酸，优选长于21个核苷酸，且更加优选长度在约19与25个核苷酸之间。因而，本发明提供了包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链包括与靶序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为 19至25个核苷酸对的双链分子。本发明中所述双链分子可包含一个或更多修饰核苷酸和/或非磷酸二酯联接。本领域众所周知的化学修饰具有增加所述双链分子稳定性、可用性和/或细胞摄入
15的能力。一般技术人员知道本发明分子可以包含的其它类型的化学修饰(W003/070744 ； W02005/045037)。在一个实施方案中，可使用修饰以提供改善的抗降解性或改善的摄入。 上述修饰的例子包括但不仅限于，硫代磷酸酯联接、2’-0_甲基核糖核苷酸(特别在双链分子的有义链上)、2’ -脱氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、 5’ -C-甲基核苷酸以及倒转脱氧脱碱基(deoxykisic)残基的掺入(US20060122137)。另一个实施方案中，可以使用修饰来增强双链分子的稳定性或增加寻靶效率。这样的修饰的例子包括但不限于双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子一条链的3’ 或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和 2’-脱氧核糖核苷酸(W02004/(^92U)。在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子链中的互补核苷酸的亲和力(W02005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl) 嘧啶取代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一个实施方案中，当双链分子是具有3’突出端的双链核酸分子时，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM等，Genes Dev 2001 Jan 15,15(2) 188-200)。关于进一步的细节，可以利用公开文献如US20060234970。本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链核酸分子，只要所得的分子保留抑制靶基因表达的能力。此外，本发明的双链核酸分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/ R-NA。具体而言，由DNA链与RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸)组成的杂合型双链核酸分子、或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸) 上同时包含DNA和RNA的嵌合型双链核酸分子，诸如此类，来增强所述双链核酸分子的稳定性。DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是 RNA,或者相反，只要它在导入表达靶基因的细胞中后能够抑制靶基因表达。优选地，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链核酸分子可以是其中的有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要所述双链核酸分子在导入表达靶基因的细胞中时具有抑制该基因表达的活性即可。为了提高双链核酸分子的稳定性，分子中优选包含尽可能多的DNA ；而为了诱导靶基因的表达抑制， 要求分子在一定范围内是RNA，以充分地诱导表达抑制。作为嵌合体双链核酸分子的一个优选实例，双链核酸分子的上游部分区域(即位于有义链或反义链内的靶序列或其互补序列之侧翼的区域)为RNA。优选地，所述上游部分区表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。或者，称有义链的5’ -端或反义链的3’ -端侧翼的区域为上游部分区域。就是说，在优选实施方案中，反义链3’末端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’末端侧翼的区域和反义链3’末端侧翼的区域均由 RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链核酸分子包含以下组合。有义链5，-[—DNA—]_3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反义链，有义链5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反义链，和有义链5，-(RNA)-[DNA]-3，3，_(-—RNA-—)_5，反义链。上游部分区优选是由9-13个核苷酸组成的域，从双链核酸分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链分子的优选实例包括这样的实例链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时强得多(US20050004064)。在本发明的语境中，双链核酸分子可以形成发夹结构，例如短发夹RNA(ShRNA)以及由DNA与RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转弯，可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA 在单一链上包含有义靶标序列和反义靶标序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA进一步与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述 dsRNA或dsD/R-NA的靶标序列匹配的mRNA。为了形成发夹环结构，可以在有义序列与反义序列之间设置由任意核苷酸序列构成的环序列。因此，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的双链核酸分子。式中， [A]为有义链，包含与靶序列对应的序列；[B]为间插单链；[A']为反义链，包含[A]的互补序列。对0IP5基因，靶序列例如可以选自以下的组SEQ ID N0:11和12。本发明不限于这些实例，在双链核酸分子保持抑制作为靶标的0IP5基因的表达的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在这些实例的基础上修饰而得到的序列。区域[A] 与[A']杂交而形成由区域[B]构成的环。间插单链部分[B]、即环序列，长度优选可以为 3 23个核苷酸。例如，环序列可以选自由以下的序列组成的组(http //www. ambion. com/ techlib/tb/tb_506. html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al·，Nature 2002Jul 25,418(6896) :435-8，Epub 2002 Jun 26)CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8，Epub 2002 Jun 26 ；UUCG :Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May,20(5) :500-5 ；Fruscoloni Pet al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) 1639-44，Epub 2003 FeblO ；UUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun,4(6) 457-67。优选的具有本发明的发夹环结构的双链核酸分子实例如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 组成的组；但本发明不限于此CGGCAUCGCUCACGUU⑶G - [B]-CACAAC⑶GAGCGAUGCCG (对靶序列 SEQ ID NO 11)；GUGACAAAAUG⑶⑶GCUA - [B]-UAGCACACCAUUUU⑶CAC (对靶序列 SEQ ID NO 12)；此外，为了增强双链核酸分子的抑制活性，可以将数个核苷酸添加到靶序列的有义链和/或反义链的3’末端，作为3’突出端。添加的核苷酸的数目为至少2个，通常为 2-10个，优选为2-5个。添加的核苷酸在双链分子的有义链和/或反义链的3’末端形成单链。要添加的核苷酸的优选例子包括但不限于“t”和“U”。在双链分子由单一多核苷酸组成以形成发夹环结构的场合，可将3'突出序列添加至该单一多核苷酸的3'端。对于双链核酸分子的制备方法没有特殊限制，但优选采用本技术领域公知的化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后采用适当的方法使它们退火到一起，来获得双链分子。退火的具体例子包括将合成的单链多核苷酸以优选至少约3 7、更优选约4 6、最优选基本上等摩尔量(即约5 5的摩尔比)的摩尔比混合。然后，将混合物加热到双链核酸分子解离的温度，再缓慢冷却。经退火的双链多核苷酸可以采用本技术领域公知的常用方法来纯化。纯化方法的例子包括利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者其中任选地除去剩余的单链多核苷酸(例如利用适当的酶进行降解)的方法。所述位于0IP5序列侧翼的各调控序列可为相同或不同的，以使得它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。所述双链分子可通过将0IP5基因模板克隆入载体(例如含有来自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III转录单元或人类HlRNA启动子的载体)以在胞内进行转录。含有本发明双链分子的载体本发明还包括含有一种或多种本文所述的双链核酸分子的载体、以及包含该载体的细胞。本发明特别感兴趣的是下文所列载体[1]至[10]。[1] 一种载体，它编码当被导入细胞后抑制0IP5的体内表达及细胞增殖的双链分子，所述分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子。[2] [1]中所述的载体，它编码对mRNA起作用的双链分子，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配:SEQ ID NO 11(位于 SEQ ID NO 13 的 79_97nt)，SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 557-575nt)；
[3][1]中所述的载体，其中有义链包含对应于选自下组的靶序列的序列SEQ ID NO 11 禾口 12 ；[4] [3]中所述的载体，它编码长度小于约100个核苷酸的双链分子；[5] [4]中所述的载体，它编码长度小于约75个核苷酸的双链分子；[6] [5]中所述的载体，它编码长度小于约50个核苷酸的双链分子；[7] [6]中所述的载体，它编码长度小于约25个核苷酸的双链分子；[8] [7]中所述的载体，它编码长度为约19个至约25个核苷酸的双链分子；[9] [1]中所述的载体，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸具有通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；[10] [9]中所述的载体，它编码具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'的双链分子，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO 11和12中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含[A]的互补序列的反义链；本发明的载体优选编码处于可表达的形式的本发明的双链分子。在本说明书中， 术语“处于可表达的形式”，是指该载体当被导入细胞中时，将表达该分子。在优选的实施方案中，载体包含双链核酸分子表达所必需的调节元件。本发明的这种载体可以用于产生本发明的双链分子，也可以直接用作癌症治疗的活性成分。本发明的载体可通过下述方法生成例如，将0IP5序列克隆入表达载体中，使调控序列可操作性地连接于0IP5序列，以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)(Lee NS et al. , Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，与 mRNA 反义的 RNA 分子由第一启动子(例如位于被克隆DNA的3’末端侧翼的启动子序列)转录，对mRNA而言为有义链的RNA分子由第二启动子(例如位于被克隆DNA的5’末端侧翼的启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默该基因的双链分子构建体。或者，使用分别编码双链分子之有义链和反义链的两个载体构建体来分别表达有义链和反义链，随后形成双链分子构建体。而且，被克隆的序列可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，即，载体的单一转录物同时包含靶基因的有义序列和互补反义序列二者。本发明涉及这样的载体，其包括含有有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸的组合中的任一个或二者，其中所述反义链包含与所述有义链互补的核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交形成所述双链分子，并且其中所述载体在被引入到表达 0IP5基因的细胞内时抑制所述基因表达。也可以配置本发明的载体使得其实现在靶细胞的基因组中的稳定插入(关于同源重组盒载体的说明，参见Thomas KR & Capecchi MR5Cell 1987,51 :503-12)。可以参考例如Wolff 降，Science 1990,247 :1465-8 ；美国专利第 5，580，859 号、第 5，589，466 号、 第 5，804，566 号、第 5，739，118 号、第 5，736，524 号、第 5，679，647 号和 WO 98/04720。基于DNA的输送技术的例子包括“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导型)输送、阳离子脂质复合体、和粒子介导型投递(“基因枪”)或压力介导型输送(例如参照美国专利第5，922，687号)。本发明的载体包括，例如，病毒性载体或细菌性载体。表达载体的例子包括牛痘或鸡痘等减毒病毒宿主(参照美国专利第4，722，848号)。该策略涉及例如使用牛痘病毒作为载体来表达编码双链分子的核苷酸序列。重组牛痘病毒在被导入表达靶基因的细胞时即表达该分子并由此抑制细胞的增殖。可使用的载体的另一个例子包括卡介苗(BCG)。BCG 载体在Mover等，Naturel991，351 :456-60中有记载。其它多种多样的载体可用于双链核酸分子的治疗性施用与生产，例子包括腺病毒载体和腺随伴病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。可以参照例如Siata等， Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock 等，J Leukoc Biol2000，68 :793-806 ；以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571_85。#用本发日月双链分子抑泡丨或降低癌细朐,牛长的方法某些siRNA抑制NSCLC的能力之前已描述于W02005/89735，以引用的方式将其包含于本文中。在本发明中，测试了针对0IP5的两种不同的dsRNA抑制细胞生长的能力。所述两种针对0IP5的dsRNA(图3A)有效地敲低(knockdown) 了肺癌和食道癌细胞系中基因的表达，同时亦发生了细胞增殖的阻抑。
因而，本发明提供了通过经抑制0IP5的表达来诱导0IP5基因的功能障碍以抑制细胞生长，即肺癌和/或食道癌细胞生长的方法。0IP5基因表达可通过任何特异性地靶定 0IP5基因的前述本发明双链分子或可表达任何所述双链分子的本发明载体来抑制。上述本发明双链分子及载体抑制癌细胞细胞生长的能力提示其可用于治疗癌症的方法。因此，本发明提供通过施用针对0IP5基因的双链分子或表达所述分子的载体无不良作用的治疗罹患癌症患者的方法，因为所述基因在正常器官中几乎检测不到(图1A、B和 D，图6)，其中所述癌症是肺癌和/或食道癌。本发明特别感兴趣的是下文所列[1]至[36]的方法[1] 一种用于抑制癌细胞生长和治疗癌症的方法，其中所述癌细胞或所述癌症表达0IP5基因，该方法包括施用至少一种在过表达0IP5基因的癌细胞中抑制该基因表达及细胞增殖的分离的双链分子的步骤，其中所述双链分子包含有义链和与其互补的反义链， 所述链彼此杂交以形成双链分子，其中有义链包含与来自SEQ ID NO :13的连续序列对应的核苷酸序列；[2] [1]的方法，其中所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO 13 的 79_97nt)禾口 SEQ IDNO 12 (位于 SEQ ID NO: 13 的 557-575nt)；[3] [2]的方法，其中有义链包含与选自SEQ ID NO 11和12的靶序列对应的序列；[4] [1]的方法，其中要治疗的癌症是肺癌和/或食道癌；[5] [4]的方法，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[6] [1]的方法，其中施用多种双链分子；[7] [3]的方法，其中所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；[8] [7]的方法，其中所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；[9] [8]的方法，其中所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；[10] [9]的方法，其中所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；[11] [10]的方法，其中所述双链分子长度在大约19个与大约25个核苷酸之间；[12] [1]的方法，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；[13] [12]的方法，其中所述双链分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]为包含与选自SEQ ID NO :11和12中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含[A]的互补序列的反义链；[14] [1]的方法，其中所述双链分子是RNA ；[15] [1]的方法，其中所述双链分子包含DNA和RNA ；[16] [15]的方法，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；[17] [16]的方法，其中所述有义与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA构成；[18] [15]的方法，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体；[19] [18]的方法，其中反义链3’端侧翼的区域为RNA，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均为RNA ；[20] [19]的方法，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；
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[21] [1]的方法，其中所述双链分子包含3’突出端；[22] [1]的方法，其中所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和药学上可接受的载体。[23] [1]的方法，其中所述双链分子由载体编码；[24] [23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA 与选自下组的靶序列匹配:SEQ ID NO 11(位于SEQ ID NO 13的79_97nt)和SEQ ID NO 12 (位于 SEQ ID NO :13 的 557-575nt)；[25] [24]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与选自SEQ ID NO :11和12的靶序列对应的序列；[26] [23]的方法，其中治疗的癌症是肺癌和/或食道癌；[27] [26]的方法，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[28] [23]的方法，其中施用多种双链分子；[29] [25]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；[30] [29]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；[31] [30]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；[32] [31]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；[33] [32]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子长度在大约19个与大约 25个核苷酸之间；[34] [23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；[35] [34]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子具有通式 5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO :11和12中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含[A]的互补序列的反义链；和[36] [23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和药学上可接受的载体。本发明的方法将在下面更加详细的加以描述。可通过将细胞与针对0IP5基因的双链分子、表达该分子的载体或包含所述分子的组合物接触来抑制表达0IP5基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞，以较低速率增殖或具有降低的存活率。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用MTT细胞增殖分析。任何细胞的生长均可根据本方法进行阻抑，只要所述细胞表达或过表达本发明所述双链分子的靶基因。可作为例子的细胞包括肺癌和/或食道癌细胞，特别是NSCLC、SCLC 禾口 ESCC0于正罹患或有危险患上涉及0IP5的疾病的患者，可通过施用至少一种本发明双链分子、表达至少一种所述分子的载体或包含至少一种所述分子的组合物进行治疗。举例而言，罹患肺癌和/或食道癌的患者可根据本发明的方法进行治疗。癌症类型可通过根据所诊断的特定类型肿瘤的标准方法进行鉴定。肺癌和/或食道癌可通过，例如，癌胚抗原(CEA)、CYFRA、pro-GRP等等作为肺癌和/或食道癌标志，或通过胸部X光和/或痰细胞学进行诊断。更优选地，用本发明所述方法治疗的患者是用这样的方法选出的在来自患者的活检物中通过RT-PCR或免疫测定法检测0IP5的表达。优选地，在本发明的治疗之前， 对于来自患者的所述活检样通过本领域所知的方法，例如，免疫组织化学分析或RT-PCR，证实0IP5基因过表达。根据本发明的方法，通过施用多种所述双链分子(或表达同样分子的载体或含有同样分子的组合物)来抑制癌细胞生长并治疗癌症，每个所述分子可具有不同结构，但作用于与0IP5的相同靶序列匹配的mRNA。或者，多种双链分子可作用于与相同基因内的不同靶序列匹配的mRNA。举例而言，所述方法可使用针对0IP5的双链分子。为抑制细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应mRNA转录物结合的形式导入细胞。或者，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂，例如FuGENE(Roche diagnostics)、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Oligofectamine (Invitrogen)与 Nucleofector (Wako pure Chemical)。当治疗导致临床效益，诸如受试者中0IP5基因表达的减少、癌症的尺寸、患病率 (prevalence)、转移潜力的降低等，可以判定该治疗是“有效”的。当预防性地适用治疗时， “有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。就本发明的方法和组合物用于“预防”和“防范”的语境而言，这些术语在本文中可互换使用，指降低源自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可包括旨在减轻特定病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移等)的广泛的预防性治疗。治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情稳定。应理解，本发明的所述双链分子降解亚化学计量的0IP5mRNA。虽不愿拘于任何理论，认为本发明的所述双链分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，与常规的癌症疗法相比，本发明为发挥治疗效应而需要输送到癌症的位置或其附近的双链分子要少得多。本领域技术人员在考虑了受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状及其它条件、 施用途径、以及是局部施用还是全身施用等因素的基础上，能够容易地确定本发明的双链核酸分子的有效量。一般而言，本发明双链分子的有效量是在癌症部位或其附近胞内浓度为大约1纳摩尔(nM)到约ΙΟΟηΜ，优选大约2nM到大约50nM，更优选大约2. 5nM到大约 ΙΟηΜ。考虑可使用更多或更少量的双链分子。本领域一般技术人员可方便地及常规地确定特定情况下所需的确切剂量。 本发明的方法可用于抑制表达至少一种0IP5的癌症，例如肺癌和/或食道癌，尤其是NSCLC、SCLC或ESCC，的生长或转移。具体而言，含有0IP5 (即SEQ ID NO :11或12) 靶序列的双链分子特别优选用来治疗肺癌和/或食道癌。 为了治疗癌症，还可以将本发明的双链核酸分子与不同于所述双链核酸分子的药剂组合来施用于受试者。或者，本发明的双链核酸分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于患者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂，如顺钼、卡钼、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治疗) 组合施用。在本发明的方法中，双链分子可以以与投递试剂相组合的裸双链核酸分子的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。用于与本发明的双链核酸分子组合施用的合适的投递试剂包括Mirus Transit TKO脂溶性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、 或脂质体。一种优选的投递试剂是脂质体。脂质体能够帮助将双链核酸分子投递至特定的组织如肺和/或食道肿瘤组织中， 还能够增加双链核酸分子的血中半衰期。适合在本发明的语境中使用的脂质体可以是由常规的囊泡形成性脂质(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及留醇，诸如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。有多种制备脂质体的方法是公知的，例如 Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ；美国专利第 4，235，871 号; 第4，501，728号；第4，837，028号；第5，019，369号；它们全部援引并入本说明书。优选地，包被本发明的双链核酸分子的脂质体包含能够将脂质体输送至癌症部位的配体分子。优选的配体是与肿瘤或血管内皮细胞中常见的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体特别优选地，包被本发明的双链核酸分子的脂质体经过了修饰以免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如，其结构的表面结合有调理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，其显著地减少单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(”RES”)对脂质体的摄入； 在例如美国专利第4，920，016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。 因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，这样的脂质体有时也被称为“隐形”(stealth)脂质体。
已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因此， 在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。 参见 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，RES 的摄入的减少可防止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链分子输送至肿瘤细胞。适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选为分子量约500 约40，000道尔顿、更优选约2，000 约20，000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalcohol)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、 聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。优选地，调理作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶剂，如60°C的四氢呋喃与水的30 12比例混合物。上文讨论了表达本发明的双链核酸分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链核酸分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递试剂包括 Mirus Transit LTl 亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子 (例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的双链分子的重组病毒载体输送到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、与鼻内递送。合适的非消化道施用途径包括膀胱内或血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。
本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选的是将药剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。为了对给定受试者施用本发明的双链分子，本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量方案。例如，双链分子可以一次性施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，双链分子可以在约3 约观日、更优选约7 约10日的期间内每日一次或二次地施用给受试者。在优选的剂量方案中，双链分子在7日期间内一日一次地注射到癌症部位或其附近。当剂量方案包括多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量，可以包含在整个剂量方案中施用的该双链分子的总量。包含本发明双链分子的组合物除上述外，本发明亦提供了包含至少一种本发明的双链分子或编码该分子载体的药物组合物。本发明特别感兴趣的是下述[1]至[36]的组合物[1] 一种用于抑制癌细胞生长并治疗癌症的组合物，其中所述癌症与癌细胞表达至少一种0IP5基因，所述组合物包括至少一种分离的抑制0IP5表达以及细胞增殖的双链分子，且其中该分子包括有义链和与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链分子；[2][1]中的组合物，其中所述双链分子作用于mRNA，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO 13 的 79_97nt)和 SEQID NO :12(位于 SEQ ID NO: 13 的 557-575nt)；[3] [2]的组合物，其中所述双链分子，其有义链包含与选自下组的靶序列相应的序列SEQ ID NO :11 和 12 ；[4] [1]的组合物，其中需治疗的癌症是肺癌和/或食道癌；[5] [4]的组合物，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[6] [1]的组合物，其中所述组合物包含多种所述双链分子；[7] [3]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约100个核苷酸；[8] [7]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；[9] [8]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约50个核苷酸；[10] [9]的组合物，其中所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；[11] [10]的组合物，其中所述双链分子长度在大约19个与大约25个核苷酸之间；[12] [1]的组合物，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链；[13] [12]的组合物，其中所述双链分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]为包含与选自SEQ ID NO :11和12中的靶序列对应的序列的有义链序列，[B]为由3 个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含[A]的互补序列的反义链；[14] [1]的组合物，其中所述双链分子是RNA ；[15] [1]的组合物，其中所述双链分子是DNA和/或RNA ；[16] [15]的组合物，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体；
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[17] [16]的组合物，其中所述有义链多核苷酸与反义链多核苷酸分别由DNA与 RNA组成；[18] [15]的组合物，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体；[19] [18]的组合物，其中反义链3’端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均由RNA组成；[20] [19]的组合物，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成；[21] [1]的组合物，其中所述双链分子包含3’突出端；[22] [1]的组合物，其中所述组合物包括转染增强剂和药学上可接受的载体。[23] [1]的组合物，其中所述双链分子由载体编码并包含于组合物中；[24] [23]中的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子作用于mRNA，所述 mRNA与选自下组的靶序列匹配=SEQ ID NO :11(位于SEQ IDNO 13的79_97nt)和SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO :13 的 557_575nt)；[25] [24]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与选自下组的靶序列相应的序列=SEQ ID NO :11和12 ；[26] [23]的组合物，其中需治疗的癌症是肺癌和/或食道癌；[27] [26]的组合物，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[28] [23]的组合物，其中施用多种所述双链分子；[29] [25]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约100个核
苷酸；[30] [29]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约75个核苷酸；[31] [30]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约50个核
苷酸；[32] [31]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度小于大约25个核苷酸；[33] [32]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子长度在大约19个与大约25个核苷酸之间；[34] [23]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成， 所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链二者；[35] [23]的组合物，其中所述双链分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]为包含与选自SEQ ID NO :11和12中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含[A]的互补序列的反义链；知[36] [23]的组合物，其中所述组合物包括转染增强剂和药学上可接受的载体。本发明合适的组合物将在下面更加详述地加以描述。本发明的所述双链分子优选在施用于患者之前根据本领域众所周知的技术配制为药物组合物。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。本文中所使用的“药物配制剂”包括适用于人类与动物的配制剂。制备本发明药物配制剂的方法属于本领域一般技术，例如，描述于Remington' sPharmaceutical Science, 17th ed. ,Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)，其全部公开内容通过引用包含于本文中。
本发明的药物配制剂包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如， 以重量计为0. 到90% )，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。生理学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0. 4%盐水、0. 3%甘氨酸、 透明质酸及类似物。根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一个均可针对0IP5的相同或不同的靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对0IP5的双链分子。或者，例如，所述组合物可包含针对选自0IP5的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。而且，本组合物可以包含编码1个或多个双链核酸分子的载体。例如，所述载体可以编码1种、2种或数种本双链核酸分子。或者，本组合物可以包含多种载体，而各载体编码不同的双链核酸分子。而且，本双链核酸分子可以作为脂质体的形式包含在本组合物中。脂质体的具体情况可以参照“使用双链分子治疗癌症的方法”项。此外，本发明的药物组合物中还可以包含常规的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和PH调节剂。合适的添加剂包括生理学生物相容性的缓冲液(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或 DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地， 补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体。例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95%，优选25-75%的一种或多种本发明的双链核酸分子。用于气雾剂(吸入) 施用的药物组合物可以包含0. 01-20重量％、优选1-10重量％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链核酸分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。除上述之外，本组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本发明双链核酸分子的体内功能。例如，上述组合物中可以包含常规用于癌症治疗的化疗药物。在其它实施方案中，本发明提供本发明的双链核酸分子在制备用于治疗以表达 0IP5为特征的肺癌和/或食道癌的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制备用于治疗表达0IP5的肺癌和/或食道癌的药物组合物中的用途该分子在细胞内抑制0IP5基因的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以选自SEQ ID NO 11和12的序列为靶标。本发明还提供生产用于治疗以表达0IP5为特征的肺癌和/或食道癌的药物组合物的方法或工艺。该方法或工艺包括将药学或者生理学可接受的载体与作为活性成分的下述双链核酸分子一起配制的步骤其在过表达0IP5的细胞中抑制所述基因的表达，该分子包含有义链与与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链核酸分子，并以选自SEQ ID NO 11和12的序列为靶标。在另一个实施方案中，本发明提供生产用于治疗以表达0IP5为特征的肺癌和/ 或食道癌的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将活性成分与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分是这样的双链核酸分子，其在过表达 0IP5的细胞中抑制所述基因的表达，该分子包含有义链与与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链核酸分子，并以选自SEQ ID NO 11和12的序列为靶标。诊断肺癌和/或食道癌的方法发现0IP5的表达在肺癌和/或食道癌细胞中特异性的提高(图IA和B)。因而， 本文鉴定出的基因及其转录与翻译产物可以作为肺癌和/或食道癌标志用于诊断，且通过测量细胞样品中0IP5的表达可诊断肺癌和/或食道癌。具体而言，本发明提供了通过确定受试者中0IP5表达水平检测、诊断和/或确定肺癌和/或食道癌的存在或其形成倾向性的方法。可用本方法诊断的肺癌和/或食道癌包括NSCLC、SCLC与ESCC。进一步地，NSCLC, 包括肺和/或食道腺癌与肺和/或食道鳞状细胞癌(SCC)，亦可通过本发明诊断或检测出来。根据本发明，可提供用于检查受试者状况的中间结果。所述中间结果可与其它信息结合起来以协助医生、护士或其它从业人员确定患者罹患所述疾病。就是说，本发明提供用于检查癌症的诊断标志0IP5。或者，本发明提供了一种用于检测或鉴定源自受试者的肺或食道组织样品中癌细胞的方法，所述方法包括测定源自受试者的生物样品中0IP5基因表达水平的步骤，其中所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示组织中存在或怀疑存在癌细胞。此类结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它保健从业人员诊断受试者患有疾病。换言之，本发明可以给医生提供有用信息来诊断受试者患有疾病。例如，依照本发明，当关于自受试者获得的组织中癌细胞的存在有疑问时，通过考虑0IP5基因的表达水平，加上疾病的不同方面，包括组织病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等，能做出临床决策。例如，一些公知的血液中的诊断性肺肿瘤标志物为IAP， ACT, BFP，CA19-9，CA50, CA72-4，CA130，CEA，KMO-1，NSE，SCC，SPl，Span-I，TPA，CSLEX，SLX， STN和CYFRA。或者，血液中的诊断性食道肿瘤标志物诸如CEA，DUPAN-2, IAP, NSE, SCC, SLX 和Span-I也是公知的。就是说，在本发明的这个具体实施方案中，基因表达分析的结果作为中间结果，用于进一步诊断受试者的疾病状态。本发明特别感兴趣的是下述[1]到[10]的方法[1] 一种诊断肺癌和/或食道癌的方法，所述方法包括下述步骤(a)检测生物样品中编码0IP5的氨基酸序列的基因的表达水平；(b)将检测出的表达水平较之基因通常正照水平的提高与疾病的存在相关联。[2] [1]的方法，其中所述表达水平比正常对照水平高至少10%。[3] [1]的方法，其中所述表达水平通过选自下组的方法检测。(a)检测包含0IP5的序列的mRNA ；(b)检测包含0IP5的氨基酸序列的蛋白质；和(c)检测包含0IP5的氨基酸序列的蛋白质的活性。[4] [1]的方法，其中所述肺癌为NSCLC或SCLC，而所述食道癌为ESCC。[5] [3]的方法，其中所述表达水平是通过检测探针与基因的基因转录物的杂交而确定的。[6] [3]的方法，其中确定所述表达水平是通过检测抗体与基因编码的蛋白的结合
28作为所述基因的表达水平而确定的。[7] [1]的方法，其中所述生物样品包括活检物、痰或血液。[8] [1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含上皮细胞。[9] [1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌细胞。[10] [1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌性上皮细胞。诊断肺癌和/或食道癌的方法将在下面更加详细的加以叙述。用本方法诊断的受试者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如， 人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。为实施诊断，优选从要诊断的受试者采集生物样品。任何生物学材料均可作为生物样品用于测定，只要其包括目标的0IP5转录或翻译产物。所述生物样品包括，但不仅限于，想要诊断或怀疑患有癌症的身体组织与体液，例如活检物，血液，痰，胸腔积液与尿液。 生物样品优选含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，更优选癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其用为生物样品。根据本发明，测定在所述源自患者的生物样品中0IP5的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，0IP5的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测多个基因(例如，多种癌症特异性基因)，包括0IP5，的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用0IP5(SEQ ID NO 13 ；GenBank登录号匪_007观0)的序列信息制备上述探针。举例而言，0IP5的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标志物来标记物， 例如染料、荧光和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生杂交的标记物的强度来加以检测。进一步，0IP5的转录产物可通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制备。举例而言，用于实施例的引物对 (SEQ ID NO :1和2，或者5和6)可用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但本发明并不仅限于此。具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与0IP5的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的， 在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地， 严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和PH下的熔点(Tm)低大约5°C。Tm 是(在限定的离子强度、PH和核酸浓度下)平衡状态下有50%的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50%的探针被占据。典型地，严格条件是这样的其中盐浓度小于大约1. OM钠离子，典型地大约0. 01-1. OM钠离子 (或其它盐)，pH7. 0-8. 3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约 30°C，用于较长的探针或引物是至少大约60°C。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。或者，本发明的诊断可以通过检测翻译产物来进行。例如，可以测定0IP5蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、 scFv,Fab,F(ab' ) 2、Fv等)均可用于检测，只要该片段保留对0IP5蛋白的结合能力即可。 制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。作为另一种基于0IP5的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对0IP5蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。即，观察到强染色表明所述蛋白质的存在增加，且同时表明0IP5的高表达水平。另外，除0IP5基因的表达水平外，亦可确定其它癌相关基因，例如已知在肺癌和/ 或食道癌中有差异表达的基因的表达水平，以提高所述诊断的准确性。对于包括0IP5基因在内的癌症标志基因而言，如果其较之相应的癌症标志基因的对照水平增加了例如10%，25%或50%的话，或增加到超过1. 1倍，超过1. 5倍，超过2. 0 倍，超过5. 0倍，超过10倍或者更多，则可认为其在生物样品中的表达水平是增加的。对照水平可以与测试生物样品同时确定，通过使用先前从疾病状态(癌性或非癌性)已知的受试者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的0IP5基因表达水平获得的结果加以确定。 进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中0IP5基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中0IP5基因表达水平的标准值。 标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围可以用作标准值。在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌性对照水平”。当0IP5基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似时， 则受试者可诊断为正罹患或有风险发生癌症。进一步，当比较多种癌症相关基因的表达水平时，样品与癌性参照之间的基因表达模式的相似性表明受试者正罹患或有风险发生癌症。测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会因细胞的癌或非癌状态而改变的对照核酸(例如持家基因)的表达水平加以标准化。示例的对照基因包括，但不仅限于，β -肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。评价癌症预后的方法本发明涉及下列新发现，即0ΙΡ5表达与患者的较差预后显著相关。因此，本发明提供确定或评价罹患癌症，尤其是肺癌和/或食道癌患者预后的方法，所述方法在患者生物样品中检测0ΙΡ5表达水平；将测得的表达水平与对照水平比较；并确定与对照水平相比升高的表达水平为不良预后(不良的存活率)的指示。另外，可以根据本发明的方法比较0ΙΡ5基因在治疗之前和之后的表达水平，以评估治疗的效力。具体地，将治疗后来自受试者的生物样品中检测到的表达水平(即治疗后水平)与来自同一受试者的在治疗开始前获得的生物样品中检测到的表达水平(即治疗前水平)进行比较。治疗后水平与治疗前水平相比降低，表明感兴趣的治疗是有效的，而治疗后水平与治疗前水平相比增加或相似则表明临床结果或预后较为不利。如这里所使用的，术语“有效”是指治疗导致受试者体内病理性上调的基因的表达降低、病理性下调的基因的表达增加或者癌的大小、普遍性或转移潜力降低。当预防性地应用感兴趣的治疗时，“有效”是指治疗可延缓或防止肿瘤的形成，或者延缓、防止或减轻该疾病的至少一种临床症状。受试者体内肿瘤状况的评估可以用标准临床规程实施。此外，治疗的有效性可以结合任何已知的用于诊断癌症的方法加以确定。癌症可以通过例如鉴定症状性异常，例如体重减轻、腹痛、背痛、食欲不振、恶心、呕吐和全身性不适、虚弱和黄疸，来加以诊断。在此，术语“预后“指如病例的性质与症状所表明的所述疾病的可能结果以及从疾病恢复的前景。相应的，不利的、负面的、不良的预后定义为较低的治疗后存活期与存活率。 相反，正面的、有利的、或良好的预后定义为治疗后存活期或存活率提高。术语“评价预后”指预测、预告或将给定检测或测量与患者癌症的将来结果(例如，恶性，治愈癌症的可能性、存活率等)相联系。举例而言，确定0IP5经时的表达水平使预测患者结果(例如，恶性的增加或减少，癌症的等级的增加或减少，治愈癌症的可能性、 存活率等)成为可能。在本发明的语境下，短语“评价(或确定)预后”意欲涵盖癌症的预测与可能性分析、进展、特别是癌症复发、转移性扩散与疾病复发。本评价预后的方法意欲用于临床以对治疗模式作出决定，包括治疗介入、诊断标准例如疾病的分期，以及针对肿瘤疾病的转移与复发的疾病监视和监测。本方法所用的源自患者的生物样品可为任何源自要评价的受试者的样品，只要 0IP5基因可在样品中检测出来。所述生物样品优选肺和/或食道细胞(从肺和/或食道获得的细胞)。进一步，所述生物样品可包括体液例如痰、血液、血清或血浆。另外，所述样品可为从组织纯化的细胞。生物样品可在不同的时点自患者获取，包括治疗前，治疗中和/或治疗后。根据本发明，在源自患者的生物样品中测得的0IP5基因的表达水平越高，治疗后病情缓和、恢复和/或存活的预后就越差，且不良临床后果的可能性就越高。因此，根据本方法，用作比较的“对照水平”可为，例如，在治疗后显示良好或积极的癌症预后的个体或个体组成的群体中任何0IP5基因的表达水平，本文中称之为“良好预后对照水平”。或者，所述“对照水平”可为，例如，在治疗后显示不良或消极的癌症预后的个体或个体组成的群体中任何0IP5基因的表达水平，本文中称之为“不良预后对照水平”。所述“对照水平”是源自单一参照群体的单一表达模式，或者是多种表达模式。因此，所述对照水平可以基于在其疾病状态(良好或不良预后)已知的癌症患者或癌症患者群体中，在进行任何种类治疗之前的0IP5基因的表达水平来加以确定。癌症优选为肺癌和/或食道癌。在具有已知疾病状态的患者集合中优先使用0IP5基因的表达水平的标准值。所述标准值可通过任何本领域已知的方法获得。举例而言，平均值+/-2倍标准偏差或平均值+/-3倍标准偏差的范围可用作标准值。所述对照水平可以与所测试的生物样品同时确定，这通过使用先前从已知其疾病状态(良好或不良预后)的患者在接受任何种类的治疗之前采集并储藏的样品来实现。此外，所述对照水平可通过统计学方法基于通过分析之前确定的来自对照组样品
31中0IP5表达水平来确定。进一步，所述对照水平可为源自先前测试的细胞的表达模式数据库。另外，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中0IP5基因的表达水平与从多种参照样品确定的多种对照水平进行比较。优选使用从与源自患者的生物样品类似的组织类型所得的参照样品确定的对照水平。根据本发明，0IP5基因的表达水平与良好预后对照水平的相似性显示所述患者较理想的预后，而表达水平相对于良好预后对照水平的增加显示较不理想的、较不良的治疗后病情缓和、恢复、存活和/或临床后果的预后。另一方面，0IP5基因表达水平相比于不良预后对照水平的减少显示患者较理想的预后，而与不良预后对照水平相似的表达水平显示较不较理想的、较不良的治疗后病情缓和、恢复、存活和/或临床后果的预后。当相对对照水平表达水平变化超过1. 0,1. 5,2. 0,5. 0,10. 0或更多倍时，在生物样品中0IP5基因表达水平可认为是改变了。所试生物样品与对照水平间表达水平的差异可相对于对照，例如持家基因，加以标准化。举例而言，已知其表达水平在癌性与非癌性细胞中不变的多核苷酸，包括那些编码 β -肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶与核糖体蛋白Pl的基因，可用于标准化0ΙΡ5基因表达水平。表达水平可通过在源自患者的生物样品中利用本领域众所周知的技术检测基因转录物来确定。所述通过本方法检测的基因转录物既包括转录产物也包括翻译产物，例如 mRNA与蛋白质。举例而言，0IP5基因的转录产物可通过使用针对基因转录物的0IP5基因探针进行杂交，例如Northern印迹杂交分析来加以检测。所述检测可在芯片或阵列上进行。对检测多种基因包括0IP5的表达水平，优选使用阵列。作为另一个示例，基于扩增的检测方法， 例如使用对0IP5基因特异性的引物基于逆转录的聚合酶链式反应可用于检测(参见实施例)。0IP5基因特异性探针或引物可使用常规技术参照0IP5基因的全序列(SEQ ID NO 13)设计和制备。举例而言，在实施例中使用的引物(SEQ ID NO :1和2)可用于通过RT-PCR 检测，但本方面并不仅限于此。具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与0IP5的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”指探针或载体会与其靶序列，但非其它序列杂交的条件。严格条件依赖于序列，且在不同情况下不同。观察到长序列较之短序列在更高温度下特异性杂交。一般而言，严格条件的温度选为大约比特定序列在给定离子强度与PH值下的热熔点(Tm)低大约5摄氏度。所述Tm是50%的互补于靶序列的探针与靶序列在平衡条件下杂交的温度(在给定离子强度、PH与核酸浓度下)。因为所述靶序列通常过量存在，在Tm下50 %的探针在平衡时被占据。通常，严格条件是在该条件下盐浓度低于大约1. OM钠离子，通常为大约0.01到1.0M钠离子(或其它盐)在pH7.0 到8. 3处，且温度对短探针或引物(例如，10到50核苷酸)为至少30摄氏度，而对较长探针与引物为至少大约60摄氏度。严格条件亦可通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达成。另外，本发明的评价可通过检测翻译产物来进行。举例而言，可确定0IP5的量。确定作为翻译产物的蛋白质的量的方法包括使用特异性识别0IP5的抗体的免疫测定方法。 所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、SCFV、Fab、F(ab，)2、FV等等)可用于检测，只要所述片段保留与0IP5蛋白的结合能力。 制备此类用于检测蛋白的抗体的方法在本领域是众所周知的，本发明中可以使用任何方法制备上述抗体及其等价物。作为另一种基于0IP5翻译产物来检测其基因的表达水平的方法，可通过免疫组织化学分析利用针对0IP5蛋白质的抗体观察其染色的强度。即，观察到强染色表明0IP5 蛋白的存在增加，且同时表明0IP5基因的高表达水平。进一步，已知0IP5蛋白具有细胞增殖活性。因此，0IP5基因的表达水平可使用上述细胞增殖活性作为指标确定。举例而言，在生物样品存在下制备并培养表达0IP5的细胞，随后通过检测增殖速度或评价细胞周期或集落形成能力，可确定所述生物样品的细胞增殖活性。另外，除0IP5基因的表达水平外，亦可确定其它肺癌和/或食道癌相关基因，例如已知在肺癌和/或食道癌中有差异表达的基因，的表达水平，以提高所述评价的准确性。上述其它的肺和/或食道细胞相关基因的实例包括那些于W02004/031413和W02005/090603 中描述的基因，以引用方式将上述文献的内容纳入于本文中。此外，根据本发明，还可提供中间结果，附加其它测试结果以评价受试者的预后。 所述中间结果可协助医生、护士或其它从业人员评价、确定或估计受试者的预后。可与本发明所得中间结果结合考虑的其它信息包括受试者的临床症状和身体状况。需根据本方法评价癌症预后的患者优选为哺乳动物，包括人、非人灵长类、小鼠、 大鼠、犬、猫、马和牛。脑赫、i平輔觀翩/丨丨赫衍去JM撤式撇本发明提供了诊断癌症、评价癌症预后、和/或监测癌症疗法功效的试剂盒。所述癌症优选肺癌和/或食道癌。具体而言，所述试剂盒包含至少一种在源自患者的生物样品中检测0IP5基因表达的试剂，所述试剂可选自下组 (a)检测0IP5基因的mRNA的试剂；(b)检测0IP5的蛋白质的试剂；和(c)检测0IP5的蛋白质的生物学活性的试剂。适于检测0IP5基因mRNA的试剂包括特异性结合或识别0IP5 mRNA的核酸，诸如具有与0IP5 mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对0IP5 mRNA 为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需要，检测0IP5 mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测 0IP5 mRNA的试剂。另一方面，适于检测0IP5蛋白质的试剂包括针对0IP5蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用于检测，只要所述片段保留与0IP5蛋白的结合能力。制备此类用于检测蛋白的抗体的方法在本领域是众所周知的，且在本发明中可使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测0IP5 蛋白质的试剂。
进一步，所述生物学活性可通过，例如，测量所述生物样品中由于表达的0IP5蛋白而导致的细胞增殖活性来确定。举例而言，在源自患者的生物样品的存在下培养所述细胞，然后通过检测增殖的速度，或测量细胞周期或集落形成能力，可确定所述生物样品的生物学活性。如需要，用于检测0IP5mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种用于检测0IP5蛋白质生物学活性的试剂。所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。进一步，所述试剂盒可包括固体基质以及用于结合针对0IP5基因的探针或针对0IP5蛋白的抗体的试剂，用于培养细胞的培养基与容器，阳性与阴性对照试剂，以及用于检测针对0IP5蛋白的抗体的第二抗体。举例而言， 从具有良好预后或不良预后的患者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业和用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤纸、针头、 注射器和带有使用说明书的装箱单(例如，书面的、磁带、⑶-ROM等等)。这些试剂等包含在带标签的容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可用多种材料制成，例如玻璃或塑料。作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对0IP5 mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质例如多孔条上，以形成至少一个检测位点。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位点，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位点。 或者，对照位点可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位点上量较大而在接下来的位点上量较小。在加入样品之后，显示可检测信号的位点的数量提供了样品中存在的0IP5 mRNA量的定量指征。所述检测位点可配置为任何合适可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或0IP5标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集0IP5阳性血液样品，随后分析其0IP5水平来制备。此外，可将纯化的0IP5蛋白或多核苷酸添加到不含0IP5的血清中以形成所述阳性样品或0IP5标准品。抗癌化合物的筛选在本发明的语境中，待通过本筛选方法鉴定的治疗剂包括任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞或蛋白的测试剂可以是单个化合物或多个化合物的组合。当在方法中使用化合物组合时，各化合物可以顺次或同时加以接触。任何测试剂，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体， 例如反义RNA、siRNA、核酶以及适体等等)以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。也可使用本领域熟知的很多组合文库方法中的任何途径来获得本发明的测试剂，包括 (1)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要角军卷禾只(deconvolution)白勺合成文库法，(4) “一珠一化合物”(“one-bead one-compound")文库法，以及(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145-67)。合成分子文库方法的例子可在本领域找到(DeWitt et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 6909-13 ；Erb et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al.，J Med Chem 37 :2678-85,1994；Choet al.，Science 1993,261 :1303-5 ；Carell et al.， Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ；Care 11 et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33 2061 ；Gallop et al.，JMed Chem 1994,37 :1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques 1992,13 :412-21)或珠子上(Lam,Nature 1991,354 :82-4)、 芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、细菌上(美国专利5，223，409)、孢子上(美国专利 5,571,698 ;5，403，484 与 5，223，409)、质粒上(Cull et al. , ProcNatl Acad Sci USA 1992,89 :1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith, Sciencel990, 249 :386-90 ；Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ； Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ；美国专利申请 2002103360)。通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法鉴定的药剂之内。此外，当所筛选的测试剂是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的 DNA。对所得的DNA确认其在制备治疗或预防癌症的候选物测试剂中的有用性。对本文描述的筛选有用的测试样品亦可为特异性结合0IP5蛋白或其缺乏原蛋白的体内生物学活性的部分肽的抗体。尽管测试剂文库的构建是本领域众所周知的，在下文中还是进一步提供了鉴定测试剂和构建用于本筛选方法的这些测试剂的文库的指导。( )分子建模对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对0IP5的分子结构的知识为人们构建测试剂文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的受试药剂的途径之一是利用对受试药剂与其靶标的相互作用进行计算机建模。计算机建模技术为选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于来源于选定分子的χ-射线晶体分析或NMR成像的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以完善结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物之一或二者都发生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, ffaltham, Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、可视化和分析。关于与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模已经发表了多篇文献，例子包括 Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ;Ripka,New Scientist 1988,54-8 ；McKinlay & Rossmann，Annu Rev Pharmacol Toxicioll989，29 :111-22 ；Perry & Davies，Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ;Lewis& Dean，Proc R Soc Lond 1989, 236 :125-40,141-62 ；以及关于核酸组分模型受体的 Askew et al. , JAm Chem Soc 1989，111 :1082-90。其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc.，Pasadena, Calif.，Allelix, Inc &司、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如 DesJarlais et al.，J Med Cheml988，31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993,259 1445-50 一旦鉴定出推定的抑制剂，可使用组合化学技术基于鉴定出的推定抑制剂的化学结构构建任何数量的变体，如下所述。所得的推定抑制剂，或“测试剂”文库可使用本发明的方法筛选，以鉴定适合于治疗和/或预防癌症和/或预防癌症术后复发的测试剂，其中所述癌症特别是肺癌和/或食道癌。(ii)组合化学合成测试剂的组合文库可以作为合理药物设计程序的一部分来制备，合理药物设计程序涉及有关已知化合物中存在的核心结构的知识。这种策略使得文库可以保持合理的规模，便于进行高通量筛选。或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，构建简单的、特别短的、聚合物性的分子文库。后一种方法的一个实例是由所有长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含所有6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5，010，175 ；Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al.，Naturel991，354 :84_6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被编码的肽(例如W093/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiaz印ines)(例如美国专利5，观8，514)，diversomer如乙内酰脲、 苯并二氮卓和二肽(DeWittet al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :9217-8)，小化合物文库的模拟有机合成(analogous organic synthese) (Chen etal.，J. Amer Chem Soc 1994,116 :2661)，寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，Sciencel993, 261 :1303)，和 / 或Jft酰膦酸酯(ρ印tidylphosphonates) (Campbell et al.，JOrg Chem 1994，59 :658)，核酸文库(见 Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology 1995 supplement ；Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA)，肽核酸文库(见例如美国专利 5，539，083)， 抗体文库(见例如 Vaughan et al.，Nature Biotechnology 1996，14(3) :309-14 禾口 PCT/ US96/10287)，碳水化合物文库(见例如 Liang et al.，Science 1996,274 :1520-22 ； 美国专利5，593，853)，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Decl ；6 (6) :624-31 ；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利 5，569，588 ； 噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烷(metathiazanone)，美国专利 5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5，525，735和5，519，134 ；吗啉代化合物，美国专利5，506，337 ；苯并二氮卓，5，288，514 ；等)。
用于制备组合文库的设备是可商购的(见例如357MPS，390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多种组合文库本身也是商业可得的(见例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。(iii)其它候诜另一种手段是使用重组细菌噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott & Smith, Science 1990,249 :386-90 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad SciUSA 1990,87 6378-82 ；Devlin et al.，Science 1990，249 :404-6)，可以构建非常大的文库(例如 106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法(Geysen et al. ,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987,102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251 :767-73)。Furka 等(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ；Furka, Int J Peptide Protein Resl991，37 :487-93)，Houghten (美国专利 4，631，211)和 Rutter 等(美国专利5，010，175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。适体是由紧密结合特定分子靶的核酸构成的大分子。Tuerk和GolcKScience. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通过指数式富集进行的配体系统性进化)方法来选择适体。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文库(例如IO15种不同分子)可用于筛选。0IP5结合化合物的筛选在本发明的语境中，在肺癌和/或食道癌中检测出0IP5的过表达，虽然在正常器官中无表达(图1A、B、D与2A)。因而，本发明提供了使用0IP5基因、所述基因编码的蛋白筛选结合0IP5化合物的方法。由于肺癌和/或食道癌中0IP5的表达，与0IP5结合的化合物期待可阻抑癌细胞的增殖，并因此对治疗或预防癌症是有用的，其中所述癌症是肺癌和/ 或食道癌。因此，本发明亦提供了使用0IP5多肽筛选阻抑癌细胞增殖和/或细胞侵袭的化合物的方法，以及筛选治疗或预防癌症的化合物的方法，其中所述癌症特别是肺和/或食道癌。该筛选方法的一个实施方案包括以下步骤(a)将测试化合物与0IP5的多核苷酸所编码的多肽接触；(b)检测所述多肽与所述测试化合物之间的结合活性；和(c)选择结合所述多肽的测试化合物。在本发明的语境中，治疗效果可以与测试剂或化合物同0IP5蛋白的结合水平关联起来。例如，当某种测试剂或化合物结合0IP5蛋白时，可将所述测试剂或化合物鉴定或选择为具有所需治疗效果的候选剂或化合物。或者，当某种测试剂或化合物不结合0IP5蛋白时，可将所述测试剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。本发明的方法将在下面更加详细地加以描述。用于筛选的0IP5多肽可为重组多肽，或者是来自自然界的蛋白质，或其部分肽。 与测试化合物接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式、或者与其它多肽融合的融合蛋白。作为使用0IP5多肽来筛选蛋白质，例如与0IP5多肽结合的蛋白质的方法，可使用本领域技术人员众所周知的许多方法。上述筛选可通过，例如，免疫沉淀方法，尤其是如下述的方式进行。在宿主(例如，动物)细胞等中通过将表达编码0IP5多肽的基因插入外源基因表达载体，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3. 1、pCAGGS与pCD8，来表达编码0IP5多肽的基因。为此表达所用的启动子可为任何通常使用的启动子，包括，例如，SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed. ), Genetic Engineering, vol.3.Academic Press, London, 83-141 (1982))、EF-alpha启动子(Kim et al. ,Gene 91 :217-23 (1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991)), RSV LTR 启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))、SR alpha 启动子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 8 :466 (1988))、CMV 立即早期启动子(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987))、SV40 晚期启动子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385-94(1982))、腺病毒晚期启动子 (Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 :946 (1989))、HSV TK 启动子等等。将所述导入宿主细胞以表达外源基因可根据任何方法来实施，所述方法例如电穿孔方法((Chu et al.，Nucleic Acids Res 15 131H6 (1987))、磷酸钙方法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745-52 (1987))、DEAE 葡聚糖方法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12:5707-17(1984) ；Sussman and MiIman, Mol Cell Biol 4:1641-3(1984))、 Lipofectin 方法(Deri jard B. , Cell 76 1025-37 (1994) ；Lamb et al. , Nature Genetics 5 :22-30(1993) =Rabindran et al.，Science259 :230-4(1993))等等。对于由0IP5基因编码的多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。能够利用其多克隆位点表达与例如半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP) 形成的融合蛋白的载体是可以商购的。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十二个(adozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使融合不会改变0IP5多肽的性质。可以使用例如多组氨酸(His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(Τ7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、Ε_标签(单克隆噬菌体上的表位)等表位，以及识别它们的单克隆抗体作为筛选与0ΙΡ5多肽结合的蛋白质的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13 :85-90(1995))在免疫沉淀中，将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解物内形成免疫复合体。免疫复合体由0IP5多肽、具有与该多肽结合能力的多肽、和抗体组成。除了使用针对上述表位的抗体之外，还可以使用针对0IP5多肽的抗体进行免疫沉淀，这样的抗体可以如下文所述那样制备。免疫复合体可以被沉淀，例如当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过蛋白A s印harose或蛋白Gs印harose将其沉淀。如果将由0IP5基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)的融合蛋白，则可以使用特异结合这些表位的物质，例如谷胱甘肽-S印har0Se4B，按照与使用针对0IP5的抗体的相同的方式来形成免疫复合体。可遵循或根据，例如，文献中的方法来实施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))。普遍使用SDS-PAGE分析经免疫沉淀的蛋白，使用合适浓度的凝胶，可以利用结合蛋白的分子量来分析该蛋白。由于与0IP5多肽结合的蛋白难以通过考马斯兰染色或银染色等普通染色方法检测到，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或mS-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。可以使用West-Western 印迹分析法(Skolnik et al. ,Cell 65 :83-90(1991))作为利用0IP5多肽来筛选结合所述多肽的蛋白的方法。特别地，与0IP5多肽结合的蛋白可以通过如下方法获得，从预期表达与0IP5多肽结合的蛋白的培养细胞利用噬菌体载体(例如ZAP)制备cDNA文库，在LB琼脂糖上表达蛋白，将表达出的蛋白固定在滤膜上，使纯化并且标记的0IP5多肽与上述滤膜反应，并依照标记物来检测表达与0IP5多肽结合的蛋白的噬菌斑。本发明的多肽可以利用生物素与抗生物素蛋白间的结合，或者利用特异结合0IP5 多肽或与0IP5多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗体，来进行标记。也可以使用利用放射性同位素或荧光等的方法。或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在双杂交系统中，使本发明多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，使该文库在被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将该cDNA文库导入到上述酵母细胞中，并从检测到的阳性克隆(当酵母细胞表达可与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合可激活报告基因，使阳性克隆可检测)分离源自该文库的cDNA。通过将上面分离的cDNA导入到大肠杆菌中并表达该蛋白，可制备由该cDNA编码的蛋白。作为报告基因，除了 HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。也可以用亲和色谱来筛选与0IP5基因编码的多肽结合的化合物。例如，可以把本发明多肽固定在亲和柱的载体上，而将含有能够结合本发明多肽的蛋白的测试化合物施加到该柱上。这里的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试化合物之后，冲洗柱子，从而可以制备得到结合于本发明多肽的化合物。当测试化合物是蛋白质时， 对所得蛋白质的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针筛选 cDNA文库，从而获得编码该蛋白的DNA。利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合化合物的装置。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对本发明多肽与测试化合物间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，就有可能评估本发明多肽与测试化合物之间的结合。用于筛选当固定的0IP5多肽暴露于合成化学化合物或天然物质文库或随机噬菌体肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量筛选方法(ffrighton et al.，Science 273 :458-64(1996) ；Verdine, Nature 384:11-13(1996)； Hogan，Nature 384 :17-9 (1996))，不仅分离与0IP5蛋白结合的蛋白质，而且分离与0IP5蛋
39白结合化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法，是本领域技术人员众所周知的。阻抑0IP5牛物学活件的化合物的筛诜在本发明的语境中，0IP5蛋白特征在于具有促进肺癌和/或食道癌细胞的细胞增殖(图3B)和细胞侵袭活性(图9B)的活性。使用这种生物学活性作为指标，本发明提供了筛选可阻抑癌细胞增殖和/或细胞侵袭的化合物的方法，以及筛选用于治疗或预防癌症的化合物的方法，其中所述癌症特别是肺和/或食道癌。因此，本发明提供了筛选用于治疗或预防与0IP5基因相关的癌症的化合物的方法，其包括下列步骤(a)将测试化合物与由0IP5的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测(a)所述多肽的生物学活性；(c)选择与没有测试化合物存在下测得的所述多肽的生物学活性相比，阻抑由 0IP5基因编码的多肽的生物学活性的测试化合物。依照本发明，可评估测试化合物阻抑促进细胞增殖的活性的治疗效果，或者候选化合物治疗或预防与0IP5相关的癌症(例如肺癌和/或食道癌)的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑细胞增殖的候选化合物或者用于治疗或预防与0IP5相关的癌症的候选化合物的方法，其使用0IP5多肽或其片段，包括以下步骤(a)将测试化合物与0IP5多肽或其功能性片段接触；并(b)检测步骤a)的所述多肽或片段的生物学活性；并(c)将(b)的生物学活性与所述测试剂或化合物的治疗效果关联起来。在本发明的语境中，治疗效果可以与0IP5多肽或其功能性片段的生物学活性关联起来。例如，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比，该测试剂或化合物抑制0IP5多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选剂或化合物。或者，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比，该测试剂或化合物不阻抑或抑制0IP5多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。本发明所述方法将在下面更加详细的加以描述。任何多肽均可用于筛选，只要它们阻抑0IP5蛋白的生物学活性即可。这样的生物学活性包括0IP5蛋白的细胞增殖活性。举例而言，可使用0IP5蛋白，亦可使用与这些蛋白功能上等价的多肽。上述多肽可由细胞内源或外源地表达。通过本筛选分离的化合物是0IP5基因编码多肽的拮抗剂的候选物。术语“拮抗剂”是指可以通过结合多肽而抑制多肽功能的分子。此术语还指可降低或抑制编码0IP5的基因的表达的分子。而且，通过本筛选分离的化合物是如下化合物的候选物，所述化合物抑制0IP5多肽与分子(包括DNA和蛋白)的体内相互作用。当本方法中要检测的生物学活性是细胞增殖时，可以通过例如如下方法进行检测制备表达0IP5多肽的细胞，在测试化合物的存在下培养细胞，确定细胞增殖速度，测量细胞周期等，以及通过测量存活细胞或集落形成活性，例如图3所示。选择降低表达0IP5 的细胞的增殖速度的化合物作为治疗或预防肺癌和/或食道癌的候选化合物。更具体而言，该方法包括以下步骤(a)使测试化合物与表达0IP5的细胞接触；(b)测量细胞增殖活性；并
(c)选择与没有测试化合物存在下的细胞增殖活性相比降低细胞增殖活性的测试化合物。在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括以下步骤(d)选择对不或很少表达0IP5的细胞没有影响的测试化合物。短语“阻抑生物学活性”在此定义为较之不存在所述化合物时，对0IP5的生物学活性优选至少10 %的阻抑，较优选至少25 %、50 %或75 %的阻抑，且最优选至少90 %的阻抑。改变0IP5表汰的化合物的筛诜在本发明中，SiRNA减少0IP5表达导致癌细胞增殖的抑制(图3A)，而且OIP过表达的升高导致促进细胞侵袭。因而，本发明提供了筛选抑制0IP5表达的化合物的方法。抑制0IP5表达的化合物可望能够阻抑癌细胞增殖和/或细胞侵袭，并由此可用于治疗或预防与0IP5相关的癌症，其中所述癌症特别是肺和/或食道癌。因此，本发明亦提供了筛选阻抑癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选治疗或预防与0IP5相关的癌症的化合物的方法， 其中所述癌症是肺和/或食道癌。在本发明的语境下，上述筛选可包括，例如，下列步骤(a)将候选化合物与表达0IP5的细胞接触；并(b)选择与对照相比减少0IP5表达水平的候选化合物。本发明的方法将在下面更加详细的加以描述。表达0IP5的细胞包括，例如，自肺癌和/或食道癌建立的细胞系或经0IP5表达载体转染的细胞系；任何这样的细胞可用于上述本发明的筛选。可用本领域技术人员众所周知的方法，例如，RT-PCR、Northern印迹分析、Western印迹分析、免疫染色与流式细胞分析来估计表达水平。在此定义的“降低表达水平”优选为较之在所述化合物不存在时的表达水平，至少使0IP5表达降低至少10%，更优选降低至少25%、50%或75%，最优选降低至少 95%的水平。在此的化合物包括化学化合物、双链核苷酸等等。在前面描述了双链核苷酸的制备。在筛选方法中，可选择降低0IP5表达水平的化合物作为治疗或预防肺癌和/或食道癌的候选化合物。或者，本发明的所述筛选方法可包括下列步骤(a)将候选化合物与导入了包含0IP5转录调控区域与在该转录调控区域控制下表达的报道基因的载体的细胞接触；(b)测量所述报道基因的表达或活性；并(c)选择降低所述报道基因表达或活性的候选化合物。依照本发明，可评估测试剂或化合物抑制细胞生长或者候选剂或化合物治疗或预防0IP5相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑癌细胞增殖的候选剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防0IP5相关疾病的候选剂或化合物的方法。在本发明的语境中，此类筛选包括例如以下步骤a)使测试剂或化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含0IP5基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因b)检测所述报道基因的表达或活性；并c)将b)的表达水平与所述测试剂或化合物的治疗效果关联起来。在本发明的语境中，治疗效果可以与所述报道基因的表达或活性关联起来。例如，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比该测试剂或化合物降低所述报道基因的表达或活性时，所述测试剂或化合物可鉴定或选择为具有治疗效果的候选剂或化合物。或者，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比该测试剂或化合物不降低所述报道基因的表达或活性时，所述测试剂或化合物可鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。合适的报道基因和宿主细胞在本领域是众所周知的。例示性的报道基因包括但不限于萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白(DsRed)、 氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、Laz与beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶幻，而宿主细胞为C0S7、 HEK293、HeLa等。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与0IP5转录调控区域连接来制备。本文所述的0IP5转录调控区域包括从转录起始位点开始至少500bp上游的区域，优选lOOObp，较优选5000或IOOOObp上游。含有所述转录调控区域的核苷酸片段可从基因组文库中分离出来，或可通过PCR扩增。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与这些基因中任一的转录调控区域连接来制备。识别转录调控区域的方法，以及其测定法规程都是众所周知的(Molecular Cloning，第三版，第17章，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press)。用含有所述报道构建体的载体感染宿主细胞，且用本领域众所周知的方法检测报道基因的表达或活性(例如，使用照度计(luminometer)、吸收光谱仪、流式细胞仪等等)。 在此定义的“降低表达或活性”优选为较之在所述化合物不存在时，报道基因的表达或活性被降低至少10 %，更优选地，至少降低25 %、50 %或75 %，最优选地，降低至少95 %。使用0IP5和Rafl的结合作为指标的筛选在本发明中，通过下拉测定法(图9C)显示了 0IP5与Rafl蛋白的直接相互作用。 0IP5蛋白的下拉是使用抗His抗体和经温育的带His标签的0IP5与GST融合的重组Rafa 蛋白的混合物进行的。结合0IP5的Rafl蛋白通过后续的使用针对Rafl的多克隆抗体的 Western印迹来检测(图9C)。因而，本发明提供了筛选抑制0IP5与Rafl之间结合的化合物的方法。抑制0IP5蛋白与Rafl蛋白之间结合的化合物可通过检测0IP5蛋白与Rafl蛋白之间的结合水平作为指标来筛选。因此，本发明提供了使用0IP5蛋白与Rafl蛋白之间结合水平作为指标，筛选用于抑制0IP5蛋白与Rafl蛋白之间结合的化合物的方法。抑制0IP5 蛋白与Rafl蛋白之间结合的化合物预期通过使0IP5蛋白失稳来阻抑癌细胞增殖和/或细胞侵袭。因而，本发明亦提供筛选用于抑制或降低表达0IP5基因的癌细胞(例如肺癌细胞和/或食道癌细胞)生长的候选化合物和因此用于治疗或预防癌症(例如肺癌和/或食道癌)的候选化合物的方法。另外，通过本筛选方法获得的化合物亦可用于抑制细胞侵袭。本发明特别感兴趣的是下述[1]到[5]的方法[1] 一种筛选破坏0IP5多肽与Rafl多肽之间结合的化合物的方法，所述方法包括下述步骤(a)使0IP5多肽或其功能性等同物与Rafl多肽或其功能性等同物在测试化合物存在下接触；(b)检测所述多肽之间的结合水平；(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在没有测试化合物存在下检测到的结合水平；并(d)选择降低所述结合水平的测试化合物。[2] 一种筛选可用于治疗或预防癌症，或者抑制癌细胞生长和/或细胞侵袭的药剂或化合物的方法，所述方法包括下述步骤(a)使0IP5多肽或其功能性等同物与Rafl多肽或其功能性等同物在测试化合物存在下接触；(b)检测所述多肽之间的结合水平；(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与在没有测试化合物存在下检测到的结合水平；并(d)选择降低所述结合水平的测试化合物。[3] [1]或[2]的方法，其中0IP5的功能性等同物包括Rafl结合域。[4] [1]或[2]的方法，其中Rafl的功能性等同物包括0IP5结合域。[5] [1]的方法，其中所述癌症选自下组肺癌和食道癌。在本发明的语境中，0IP5和Rafl多肽的功能性等同物分别为具有与0IP5多肽 (SEQ ID NO 14) ,Rafl多肽(SEQ ID NO 18)等同的生物学活性的多肽。特别地，0IP5的功能性等同物为含有针对Rafl的结合域的多肽片段，诸如SEQ ID NO :14的氨基酸序列。类似地，Rafl的功能性等同物为SEQ ID NO 17的包括0IP5结合域的多肽片段。作为筛选抑制0IP5与Rafl结合的化合物的方法，可使用本领域技术人员公知的多种方法。用于筛选的多肽可为重组多肽，或者是来自自然来源的蛋白质，或其部分肽。上述任何测试化合物可用于筛选。作为检测0IP5蛋白与Rafl蛋白之间结合的方法，可使用本领域技术人员公知的任何方法。此类检测可使用例如免疫沉淀、Wiest-Western印迹分析(Skolnik et al.，Cell 65 :83-90 (1991))、利用细胞的双杂交系统(〃 MATCHMAKER Two-Hybrid system"，" Mammalian MATCHMAKERTwo-Hybrid Assay Kit"，" MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech) ； " HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene)；参考文 KB" Dalton and Treisman, Cell 68 :597-612(1992) “ ， “ Fields and Sternglanz, Trends Genet 10:286-92(1994)")、亲和层析，以及利用表面等离振子共振现象的生物传感器来进行。在一些实施方案中，本筛选方法可以使用表达0IP5多肽和Rafl多肽二者的细胞以基于细胞的测定法进行。表达0IP5蛋白和Rafl蛋白的细胞包括例如自癌症(例如肺癌和/或食道癌)建立的细胞系。或者，所述细胞可以通过用编码0IP5和Rafl蛋白的核苷酸转化细胞来制备。此类转化可使用编码0IP5和Rafl 二者的表达载体，或者编码0IP5或 Rafl任一的表达载体来进行。本筛选方法可通过在测试化合物存在下温育此类细胞来进行。0IP5蛋白与Rafl蛋白的结合可使用抗0IP5抗体或抗Rafl抗体通过免疫沉淀测定法来检测。依照本发明，可评估测试剂或化合物抑制细胞生长或者候选剂或化合物治疗或预防与0IP5相关的癌症(例如肺癌和食道癌)的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑细胞增殖的候选剂或化合物或者用于治疗或预防癌症(例如肺癌和食道癌)的候选剂
43或化合物的方法，所述方法使用0IP5多肽或其功能性等同物，包括以下步骤(a)使0IP5多肽或其功能性等同物与Rafl多肽或其功能性等同物在测试剂或化合物存在下接触；(b)检测所述多肽之间的结合水平；(c)比较步骤(b)中检测到的结合水平与没有测试剂或化合物存在下检测到的结合水平；并(d)将(C)的结合水平与测试剂或化合物的治疗效果关联起来。在本发明中，治疗效果可以与0IP5蛋白与Rafl蛋白之间的结合水平关联起来。例如，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比，该测试剂或化合物阻抑所述多肽之间的结合水平时，可将所述测试剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选剂或化合物。或者，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比，该测试剂或化合物不阻抑或抑制所述多肽之间的结合水平时，可将所述测试剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。阻抑0IP5磷酸化的化合物的筛诜在本发明中，证明了 Rafl蛋白对0IP5蛋白的磷酸化可促成0IP5多肽的稳定化 (图8C)，而且因此它可能在癌细胞生长中具有至关重要的作用。因而，预期可抑制Rafl蛋白对0IP5蛋白的磷酸化的化合物对于抑制癌细胞生长和/或细胞侵袭是有用的，而且因此可以是用于治疗或预防涉及0IP5过表达的癌症(例如肺癌或食道癌)的候选化合物。因此，本发明还提供使用0IP5磷酸化水平作为指标，筛选用于阻抑细胞增殖和/ 或细胞侵袭的候选化合物或者用于治疗或预防涉及0IP5过表达的癌症候选化合物的方法。在本发明的语境中，此类筛选可包括例如下列步骤(a)使0IP5多肽或其功能性等同物与Rafl多肽或其功能性等同物在测试化合物存在下在适合于0IP5多肽磷酸化的条件下接触；(b)检测0IP5多肽的磷酸化水平；(c)比较步骤(b)中的磷酸化水平与在没有测试化合物存在下检测到的磷酸化水平；并(d)选择降低0IP5多肽磷酸化水平的测试化合物。依照本发明，可评估测试剂或化合物抑制细胞生长或者候选剂或化合物治疗或预防0IP5相关疾病(例如肺癌和食道癌)的治疗效果。因此，本发明亦提供筛选阻抑乳腺癌细胞增殖的候选剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防乳腺癌的候选剂或化合物的方法。更具体而言，该方法包括以下步骤(a)使0IP5蛋白与Rafl蛋白在测试剂或化合物存在下接触；(b)检测0IP5蛋白的磷酸化水平；(c)比较0IP5蛋白的磷酸化水平与没有测试剂或化合物存在下检测到的磷酸化水平；并(d)将C)的磷酸化水平与测试剂或化合物的治疗效果关联起来。在本发明中，治疗效果可以与0IP5蛋白的磷酸化水平关联起来。例如，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比该测试剂或化合物降低0IP5蛋白的磷酸化水平时，可将所述测试剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选剂或化合物。或者，当与没有某种测试剂或化合物存在下检测到的水平相比该测试剂或化合物不降低0IP5蛋白的磷酸化水平时，可将所述测试剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。在本发明的语境中，0IP5或Rafl多肽的功能性等同物分别为具有与0IP5多肽 (SEQ ID NO 14)或Raf 1多肽(SEQ ID NO 18)等同的生物学活性的多肽。如本文中使用的，短语“功能性等同物”与“基因或蛋白”项中描述的含义相同。作为筛选抑制Rafl多肽对0IP5多肽的磷酸化的化合物的方法，可使用本领域已知的任何方法。在本发明的语境中，适合于0IP5多肽磷酸化的条件可通过在磷酸供体(例如ATP)存在下温育分离的0IP5多肽与分离的Rafl多肽来提供。适合于Rafl对0IP5的磷酸化的条件还包括培养表达0IP5多肽和fefl多肽二者的细胞。例如，此类细胞可以是内源表达0IP5和Rafl的细胞，诸如癌细胞(例如肺癌细胞、食道癌细胞)，或携带包含编码 0IP5多肽和/或Rafl多肽的多核苷酸的表达载体的转染细胞。在测试化合物存在下温育分离的多肽或表达多肽的细胞之后，可使用试剂，诸如识别磷酸化0IP5的抗体，来检测0IP5多肽的磷酸化水平。例如，可应用免疫测定法或 Western印迹测定法来检测0IP5多肽的磷酸化状态。在检测磷酸化的0IP5之前，可将0IP5多肽与其它成分分开。例如，凝胶电泳可用于将0IP5多肽与其余组分分开。或者，可通过具有抗LGN/GPSM2抗体的载体来捕捉0IP5多肽。或者，可如下检测0IP5多肽的磷酸化水平，即温育分离的0IP5多肽和Rafl多肽或者表达这些多肽的细胞与经过标记的磷酸供体，然后对标记物示踪。例如，当使用放射性标记的ATP (例如32P-ATP)作为磷酸供体时，将分出的0IP5多肽的放射性与0IP5多肽的磷酸化水平关联起来。在本发明的背景中，可鉴定出具有治疗或预防癌症的潜力的候选化合物。这些候选化合物的治疗潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当结合0IP5蛋白的化合物抑制癌症的上文所述活性时，可得出结论此类化合物具有 0IP5特异性治疗效果。本发明的样态在下述实施例中加以描述，它们并无意对权利要求中描述的本发明范围进行限定。除非另行定义，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域一般技术人员通常理解的意义相同。下面描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。
实施例本发明将于下列实施例中进一步加以描述，其并不对权利要求中描述的本发明范围构成限定。材料和方法细胞系与组织样品此研究中使用的15种人肺癌细胞系包括5种腺癌(ADC) (A549, LC319，PC-14， NCI-H1373，和 NCI-H1781)、5 种鳞状细胞癌(SCC) (SK-MES-1，LU61, NCI-H520，NCI-H1703，和 NCI-H2170)、1 种大细胞癌(LCC) (LXl)、和 4 种小细胞肺癌(SCLC) (DMS114，DMS273， SBCUP SBC-5)。此研究中使用的人食道癌细胞系如下9种SCC细胞系(TEl，TE2，TE3， TE4，TE5，TE6，TE8，TE9JPTE10)和 1 种 ADC 细胞系(TE7) (Nishihira T，et al.，J Cancer Res Clin 0ncoll993 ;119 :441-9)。所有的细胞均于合适的补充有10%胎牛血清(FCS) 的培养基中单层培养，且保持在37摄氏度下含5% CO2的湿润空气中。用作正常对照的人类小气道上皮细胞(SAEC)在经过优化的培养基(SAGM) (Cambrex Bio Science he.)中培养。原代肺癌和ESCC样品是先前获取的。此研究和所述所有临床材料的使用已经得到了相关机构伦理委员会的批准。临床分期根据UICC Μ分级法(Sobin L and Wittekind Ch. 6th ed. New York =Wiley-Liss ；2002)来判断。用于组织微阵列免疫染色的经福尔马林固定的原代肺肿瘤以及邻近的正常肺组织样品已从在Hokkaido University (Sapporo, Japan)接受了根治性手术的279名患者(161名ADC,96名SCCU8名LCC,4名ASC ；96名女性和183名男性患者；中值年龄63. 3，范围26-84岁)获取。总共280份经福尔马林固定的原代ESCC(27份女性和253份男性患者；中值年龄61. 5，范围38-82岁)以及邻近的正常食道组织样品亦已从在Keiyukai Sapporo Hospital (Sapporo, Japan)接受了根治性手术的患者获取。另外，用于组织微阵列免疫染色的总共336例NSCLCd-IIIA期；201例 ADCUOl例SCC,23例LCCUl例ASC ；103名女性禾口 233名男性患者；中值年龄66. 0岁，范围四-85岁)和正常肺组织样品亦已从Saitama Cancer Center (Saitama, Japan)获取。 这些患者接受了他们的原发癌切除，而且他们之中只有具有阳性淋巴结转移的患者在他们的手术后接受了基于钼的辅助化疗治疗。经福尔马林固定的原代221份ESCCd-IVA期；21 名女性和200名男性患者；中值年龄62岁，范围44-79岁)以及邻近的正常食道组织样品已从在Keiyukai Sapporo Hospital (Sapporo, Japan)接受了根治性手术的患者获取。76 份ESCCd-IVB期；13名女性和63名男性患者；中值年龄63，范围38-84岁)以及邻近的正常食道组织样品亦已从在Hokkaido University及其附属医院(Sapporo，Japan)接受了根治性手术的患者获取。此研究和所有临床材料的使用已经各机构伦理委员会批准。半定量RT-PCR使用Trizol 试剂(Life Technologies, Inc.，Gaithersburg, MD)依照制造商的方案从培养细胞与临床组织中抽提总RNA。用DNase I (Nippon Gene, Tokyo, Japan)处理抽提的RNA与正常人类组织多聚(A)RNA，并使用寡聚(dT)引物与SuperScript II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad, CA)进行逆转录。半定量RT-PCR实验通过下列组针对0IP5特异性的引物或作为内部对照的ACTB特异性引物加以实施。0IP5 5' -CTTCAAGAATGGAGGGGAAA-3‘ (SEQ ID NO :1)与5' -GTATTCATAACAACTGCTCCATGC-3‘ (SEQ ID NO 2)；ACTB 5' -GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3‘ (SEQ ID NO 3)与5' -CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3‘ (SEQ ID NO :4)。优化PCR反应的循环数以保证产物的强度在扩增的对数期内。Northern 印迹分析将人类多组织印迹(BDBiosciences Clontech, Palo Alto，CA)与标记的 0IP5PCR产物杂交。0IP5的cDNA探针通过RT-PCR用下述引物制备5' -CCAGTGACAAAATGGTGTGC-3‘ (SEQ ID NO :5)，与
5' -GTATTCATAACAACTGCTCCATGC-3‘ (SEQ ID NO :6)。预杂交、杂交与漂洗遵循生产商的推荐进行。所述印迹在-80°C用增感屏放射自显影1周°Western 印迹肿瘤组织或细胞在裂解缓冲液50mMTris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl,0. 5% NP40，0. 5%脱氧胆酸钠，和蛋白酶抑制剂混合物集III(Calbi0Chem)中裂解。如先前所述 (Kato T, et al.，Cancer Res 2005 ;65 :5638-46)，使用增强型化学发光 Western 印迹分析系统(GE Healthcare Biosciences) 0使用肺癌和食道癌细胞系以及正常气道上皮细胞的溶胞物通过Western印迹分析确认了商品化的针对人0IP5的家兔多克隆抗体(目录号 12142-1-AP, Proteintech group. Inc.)是对内源 0IP5 蛋白特异性的。免疫细胞化学将培养的细胞用4%多聚甲醛固定，并用含有0. I^Triton X-100的PBS于室温透化3分钟。于室温用CASBLOCK(ZYMED)覆盖细胞10分钟以封闭非特异性结合。然后将细胞与在含有BSA的PBS中稀释的一抗一起于室温温育60分钟。用PBS清洗后，将免疫偶联物用缀合有Alexa 488的山羊抗家兔二抗(Invitrogen)染色。每份标本用含有4'， 6' -二脉基-2'-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)的 Vectashield(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)封固，并用 Spectral Confocal Scanning Systems (TSC SP2A0B S :Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)显现。 免疫组织化学和组织微阵列分析如先前公开的，使用福尔马林固定的NSCLC构建肿瘤组织微阵列(ChinSF，et al.，Mol Pathol 2003 ；56 :275-9,Callagy G, et al.，Diagn Mol Pathol2003 ；12 :27-34, Callagy G，et al. J Pathol 2005;205:388-96)。基于与在载玻片上对应的H&E染色切片目视对准，选取用于取样的组织区域。将三个、四个或五个取自供体肿瘤块的组织芯(直径0. 6mm ；高度，3-4mm)用微阵列点样器(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)置入受体石蜡块中。从每个病例中打孔取出正常组织芯。将所得微阵列块的5微米切片用于免疫组织化学分析。三个独立的调查者在事先不知晓临床病理学数据的情况下半定量地评估了 0IP5阳性。只有在评议者都断定为阳性时才可以判定肺癌为阳性。为了调查0IP5过表达在临床NSCLC中的显著性/意义，将组织切片使用 ENVISION+试剂盒 / 辣根过氧化物酶(HRP ;DakoCytomation，Glostrup，Denmark)染色。在封闭内源过氧化物酶和蛋白之后添加0IP5抗体(Proteintech group. Inc.)，并将每个切片与HRP标记的抗家兔IgG(作为二抗)一起温育。添加底物-色原体，并将标本用苏木精复染色。统计分析使用列联表来分析NSCLC患者中0IP5表达与临床病理变量之间的相关性。计算从手术之日到NSCLC相关的死亡之时，或到最后-次随访之时的肿瘤特异生存曲线。对每个相关变量及0IP5表达计算Kaplan-Meier曲线。病人亚组之间存活时间的差异用时序检验(log rank test)进行分析。用Cox相对风险回归模型进行单变量和多变量分析以确定临床病理学变量与癌症相关死亡率之间的联系。首先，分析死亡与可能的预后因素，包括年龄、性别、组织学类型、PT分类以及pN分类之间的关系，每次考虑一个因素。其次，将多变量Cox分析应用于反向(分步的)过程，其中总是将0IP5表达，以及任何及所有满足P值小于0. 05准入水平的变量强制引入该模型。当所述模型继续增加因素时，独立因素未超过 P < 0. 05的退出水平。RNA干扰测定使用30 微升 Lipofectamine 2000 (Invitrogen，Carlsbad，CA)依照制造商的方案将小干扰 RNA(siRNA)双链体(Dharmacon, Inc.，Lafayette, CO) (IOOnM)转染到 NSCLC细胞系A549中。将转染后的细胞培养7日；通过吉姆萨染色对集落数目计数；并在处理后7天用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯四唑溴化物(MTT)测定(细胞计数试剂盒-8溶液；Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)评价细胞的存活力。为验证0IP5mRNA表达的阻抑，用上述的对0IP5具有特异性的合成引物进行半定量RT-PCR 实验。用于RNA干扰的合成寡核苷酸的靶序列如下对照1(萤光素酶/LUC 萤火虫 (Photinus pyralis)萤光素酶基因)5 ‘ -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3 ‘ (SEQ ID NO 7)； 对照 2 (On-Target plus/CNT ；Dharmacon Inc.) 5 ‘ -UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ‘ (SEQ ID NO 8) ；siRNA-0IP5-l 5 ‘ -CGGCAUCGCUCACGUUGUGUU-3 ‘ (SEQ ID N0: 9) ；siRNA-0IP5-2 5 ‘ -GUGACAAAAUGGUGUGCUAUU-3 ‘ (SEQ ID NO 10)； siRNA-Rafl-1 5 ‘ -GCAAAGAACAUCAUCCAUA—3 ‘ (SEQID N0 15)；禾Π siRNA-Rafl-2 5' -GACAUGAAAUCCAACAAUA-3‘ (SEQ IDNO 16)。细胞生长测定将经设计成表达0IP5的质粒(pcAGGSn3FC-0IP5-Flag)或模拟质粒转染的 C0S-7细胞以IxlO6个细胞/IOOmm皿的密度铺板。将细胞在含有0. 4mg/ml遗传霉素 (Invitrogen)的培养基中选择7天，并通过MTT测定法(细胞计数试剂盒_8溶液；Dojindo Laboratories)评估细胞数目。基质胶(Matrigel)侵袭测定用表达0IP5的p3XFLAG-标签质粒(pcAGGSn3FC-0IP5_Flag)或用模拟质粒转染的C0S-7细胞在含10% FCS的DMEM中生长至接近汇合。通过胰蛋白酶消化收集细胞，用未添加血清或蛋白酶抑制剂的DMEM清洗，并以IxlO5细胞/ml的浓度悬浮在DMEM中。在制备细胞悬液之前，将基质胶基质(Becton Dickinson Labware)的干燥层用DMEM在室温下复水2小时。向M孔基质胶侵袭室的每个下部小室中添加含有10% FCS的DMEM(0. 75ml)， 并向每个上部小室插入物中添加0.5ml (5X104细胞/ml)细胞悬液。将插片的板于37°C温育对小时。温育后，处理室；如供应商(Becton Dickinson Labware)所指导地固定侵袭通过基质胶的细胞，并用吉姆萨染色。MM肺癌和食道癌及正常组织中的0IP5表达。为了为肺癌和食道癌鉴定开发新治疗剂的靶分子和/或生物标志物，使用cDNA微阵列实施了肺癌和ESCC的基因组范围表达序型分析(Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53, Kikuchi T, et al. ， Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Kakiuchi S, et al. ， Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99, Kakiuchi S, et al. ， Hum Mol Genet2004 ；13 :3029-43, Kikuchi Τ, et al.， Int J Oncol 2006 ；28 :799-805, Taniwaki M, etal. ， Int J Oncol 2006 ；29 :567-75, YamabukiT, et al.，Int J 0ncol2006 ;28 1375-84)。在所筛选的 27，648 种基因中，在绝
48大多数所检查的肺癌和食道癌样品中鉴定到0IP5转录物的升高的表达(3倍或更高)。它的过表达通过半定量RT-PCR实验在15个肺癌组织中的9个、15个肺癌细胞系中的15个、 10种ESCC组织中的6个、及10个ESCC细胞系中的9个中得到证实(图IA和1B)。肺癌和食道癌细胞系中高水平的0IP5表达使用抗0IP5抗体通过Wfestern印迹分析得到了进一步证实(图5A)。0IP5蛋白通过Western印迹作为双带被检测出，指示0IP5蛋白的可能修饰。因此，将来自过表达内源0IP5的SBC-5细胞和经0IP5表达质粒(pcAGGSn3FC-0IP5-Flag)转染的C0S-7细胞的提取物在蛋白磷酸酶(New England Biolabs)存在或不存在下温育，并通过Wfestern印迹分析来分析0IP5蛋白的分子量。经磷酸酶处理的提取物中内源和外源0IP5蛋白二者大部分的测量分子量比未处理细胞中的要小。数据指示0IP5可能在细胞中被磷酸化(图4)。进行了免疫荧光分析来检查内源0IP5 在肺癌细胞系SBC-5中的亚细胞定位，而且发现0IP5位于核和胞质中(图1C、图5B)。使用0IP5cDNA作为探针的Northern印迹分析只在所检查的16种组织(图1D)或23种组织 (图6A)中的睾丸中鉴定出与1.5-1Λ转录物对应的强信号。另外，使用抗OIP多克隆抗体通过免疫组织化学将六种正常组织(肝、心、肾、肺、食道和睾丸)中的0IP5蛋白表达与肺癌和食道癌中的比较。在睾丸细胞及肺癌和食道癌细胞的核和胞质中检测到丰富的0IP5 ； 然而，它的表达在其余五种正常组织中几乎检测不到(图6B)。在肺癌组织中获得的抗0IP5 抗体阳性信号因抗体与重组人0IP5 —起预温育而减弱，指示它对0IP5蛋白的高度特异性 (图 9A)。NSCLC患者和ESCC中0IP5表达与差预后的关联然后检查手术切除的NSCLC中的0IP5表达与多种临床病理变量的关联。为了检验0IP5的临床病理意义，另外借助含有来自419名接受了根治性手术切除的患者的肺癌组织的组织微阵列来检查0IP5蛋白的表达。在262份ADC肿瘤中的163份(62. 2% )和157 份非ADC肿瘤中的139份(88.5%)中找到了阳性染色(图2A)。然后检查0IP5表达(阳性对阴性)与多种临床病理参数的关联，并发现了它与组织学的显著关联(在非腺癌中较高；P < 0. 0001，卡方检验；表1)。Kaplan-Meier法指示NSCLC中的0IP5状态(阳性对阴性)与肿瘤特异性存活率之间的显著关联(0IP5阳性病例中的存活期较短；P = O. 0099，时序检验；图2B)。通过单变量分析，组织学(腺癌对非腺癌)、肿瘤大小(pTl对pT2-4)、淋巴结转移(pNO对pNl-3)、年龄(< 65岁对z65岁)、性别(女性对男性)、和0IP5阳性(阴性对阳性)都与NSCLC患者的肿瘤特异性存活显著相关(表幻。另外，使用Cox比例风险模型进行的多变量分析指示PT阶段、pN阶段、年龄、和阳性0IP5染色是NSCLC的独立预后因素(表2)。表 1NSCLC组织中的0IP5阳性与患者的特征之间的关联(n = 419)
权利要求
1.一种用于诊断肺癌和/或食道癌的方法，所述方法包括下列步骤(a)通过选自下组的任一方法测定源自受试者的生物样品中0IP5基因的表达水平； ⑴检测0IP5基因的mRNA，(ii)检测由0IP5基因编码的蛋白，和(iii)检测由0IP5基因编码的蛋白的生物学活性；并(b)将步骤(a)中测得的表达水平与基因的正常对照水平相比的升高与肺癌和/或食道癌的存在关联起来。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中测得的表达水平比正常对照水平高至少10%。
3.权利要求1的方法，其中步骤(a)测得的表达水平是通过检测针对0IP5蛋白的抗体的结合来测定的。
4.权利要求1的方法，其中源自受试者的生物样品包括活检物。
5.一种用于评估或确定患有肺癌和/或食道癌的患者的预后的方法，该方法包括下列步骤(a)检测源自患者的生物样品中0IP5基因的表达水平；(b)将检测得到的表达水平与对照水平比较；并(c)基于(b)的比较来确定患者的预后。
6.权利要求5的方法，其中对照水平为良好的预后对照水平，且表达水平与对照水平相比的升高确定为不良的预后。
7.权利要求6的方法，其中所述升高是比对照水平高至少10%。
8.权利要求5的方法，其中表达水平是通过选自下组的任一方法测定的(a)检测0IP5基因的mRNA；(b)检测由0IP5基因编码的蛋白；和(c)检测由0IP5基因编码的蛋白的生物学活性。
9.权利要求5的方法，其中源自患者的生物样品包括活检。
10.一种用于诊断肺癌和/或食道癌或评估或确定患有肺癌和/或食道癌的患者的预后的试剂盒，其包括选自下组的试剂(a)用于检测0IP5基因的mRNA的试剂；(b)用于检测由0IP5基因编码的蛋白的试剂；和(c)用于检测由0IP5基因编码的蛋白的生物学活性的试剂。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述试剂是针对所述基因的基因转录物的探针。
12.权利要求10的试剂盒，其中所述试剂是针对由所述基因编码的蛋白的抗体。
13.—种在导入细胞中时抑制0IP5基因体内表达以及细胞增殖的分离的双链分子，所述分子包含有义链和与其互补的反义链，所述链彼此杂交以形成双链分子，其中有义链包含与来自SEQ ID NO 13的连续序列对应的核苷酸序列。
14.权利要求13的双链分子，其中有义链包含与选自下组的靶序列对应的序列SEQ ID NO :11 和 12。
15.权利要求14的双链分子，其中双链分子是长度为约19个至约25个核苷酸的寡核苷酸。
16.权利要求13的双链分子，其由包含通过居间单链连接的有义及反义链二者的单一多核苷酸组成。
17.权利要求16的双链分子，其具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]_3'，其中[Α]为包含与选自SEQ ID NO 11和12的靶序列对应的序列的有义链，M为由3至23个核苷酸组成的居间单链，而[A']为包含[A]的互补序列的反义链。
18.—种编码权利要求13至17的双链分子的载体。
19.一种用于治疗或预防表达0IP5基因的癌症的方法，其中该方法包括施用至少一种权利要求13-17的分离的双链分子或权利要求18的载体的步骤。
20.权利要求19的方法，其中要治疗的癌症是肺癌和/或食道癌。
21.一种用于治疗或预防表达0IP5基因的癌症的组合物，其中组合物包含至少一种权利要求13-17的分离的双链分子或权利要求18的载体。
22.权利要求21的组合物，其中要治疗的癌症是肺癌和/或食道癌。
23.一种筛选用于治疗或预防与0IP5基因过表达有关的癌症或抑制所述癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使测试化合物与由0IP5基因的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测所述多肽与测试化合物之间的结合活性；并(c)选择结合所述多肽的测试化合物。
24.一种筛选用于治疗或预防与0IP5基因过表达有关的癌症或抑制所述癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使测试化合物与由0IP5基因的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；并(c)选择与在没有该测试化合物存在下检测得到的由0IP5基因的多核苷酸编码的多肽的生物学活性相比，遏制所述多肽的生物学活性的测试化合物。
25.权利要求对的方法，其中所述生物学活性为促进细胞增殖。
26.一种筛选用于治疗或预防与0IP5基因过表达有关的癌症或抑制所述癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与表达0IP5基因的细胞接触；并(b)选择与在没有该测试化合物存在下检测到的0IP5基因表达水平相比降低该基因的表达水平的测试化合物。
27.一种筛选用于治疗或预防与0IP5基因过表达有关的癌症或抑制所述癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使测试化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含0IP5基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；(b)测量所述报道基因的表达或活性；并(c)选择与对照相比降低所述报道基因的表达或活性水平的测试化合物。
28.一种筛选用于治疗或预防与0IP5基因过表达有关的癌症或抑制所述癌症细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使0IP5多肽或其功能等同物与Rafl多肽或其功能等同物在测试化合物存在下接触；(b)检测多肽间的结合水平；(C)比较在步骤(b)检测得到的结合水平与在没有所述测试化合物存在下检测得到的结合水平；并(d)选择与步骤(C)中在没有该测试化合物存在下检测到的结合水平相比降低结合水平的测试化合物。
29.权利要求观的方法，其中所述0IP5的功能等同物包含Rafl结合域。
30.一种筛选用于治疗或预防与OIP基因过表达有关的癌症或抑制所述癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使0IP5多肽或其功能等同物与Rafl多肽或其功能等同物在测试化合物存在下在磷酸化的合适条件下接触；(b)检测0IP5多肽的磷酸化水平；并(c)选择与在没有该测试化合物存在下检测到的0IP5多肽的磷酸化水平相比，降低该多肽的磷酸化水平的测试化合物。
31.权利要求23、24、沈、27、观或四任一项的方法，其中癌症选自肺癌和食道癌。
全文摘要
本发明涉及OIP5基因在肺癌和/或食道癌致癌作用中发挥的作用，提供了一种通过施用针对OIP5基因的双链分子或含有此类双链分子的组合物、载体或细胞和抗体来治疗和/或预防肺癌和/或食道癌的方法。本发明特征还在于通过检测OIP5来检测和/或诊断肺癌和/或食道癌或评估/确定具有肺癌和/或食道癌的患者的预后，和/或监测癌症疗法在肺癌和/或食道癌的患者中的功效的方法。还公开了鉴定用于治疗和预防涉及OIP5的癌症的化合物的方法。
文档编号C12N15/09GK102197134SQ20098014288
公开日2011年9月21日 申请日期2009年8月24日 优先权日2008年8月28日
发明者中村佑辅, 富樫亮, 醍醐弥太郎 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司