专利名称：生产2-脱氧蟹肌醇(doi)的细菌及使用其生产2-脱氧蟹肌醇(doi)的方法
技术领域：
本发明涉及一种由蔗糖生产2-脱氧蟹肌醇Q-deoxy-scyllo-inosose ；D0I)的细菌和使用其生产DOI的方法。
背景技术：
2-脱氧蟹肌醇(以下也称作D0I)为可用作药物原料和化学工业资源的有用物质。 例如，根据日本特开2000-236881号公报可知，2-脱氧蟹肌醇可以使用重组DOI合成酶由葡糖-6-磷酸(G-6-P)通过短工序生产，其中，所述重组DOI合成酶是使用大肠杆菌得到的。 进而，例如如国际公开2006/109479号说明书所述，也已经开发了使用表达DOI合成酶的大肠杆菌由葡萄糖以一步法生产DOI的方法。由此，可以由来自植物的资源得到葡萄糖，再由该葡萄糖来生产DOI。但是，根据Journal of Biotechnology,Vol. 129,pp. 502-509(2007)可知，国际公开2006/109479号说明书中记载的生产DOI的方法中，在使用葡萄糖作为原料的同时，为了菌体的增殖/生长，还需要甘露糖醇，而甘露糖醇是一种稀少且昂贵的糖。根据Journal of Biotechnology, Vol. 129，pp. 502-509 (2007)，可知在野生型大肠杆菌中表达DOI合成酶时 DOI的生产率仅为1.5g/L，为了达到高生产率5g/L)，需要同时破坏大肠杆菌所具有的下述3个酶的基因，即磷酸葡糖异构酶(pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶(ZWf)及葡糖磷酸变位酶(Pgm)。由此可以得到下述结论葡萄糖进入糖酵解系统的代谢途径被完全阻断，因此为了菌体的增殖/生长，还需要可用于糖酵解系统的糖(例如甘露糖醇)。另外，还可知为了得到同样高的DOI生产率，虽然也可以仅同时破坏pgi基因和zwf基因2个基因，但由于此时如果以葡萄糖作为唯一的碳源则菌体也不能增殖，所以用于菌体增殖/生长的甘露糖醇也是必需的。另一方面，已知蔗糖为比葡萄糖还廉价的糖原料。蔗糖为废糖蜜的主成分，人们期待同化蔗糖生产DOI的大肠杆菌在生产可用于工业的廉价的DOI方面是有用的。但是，同化蔗糖生产DOI的细菌到目前为止还完全不存在。例如，根据日本特开2001-346578号公报，微生物同化蔗糖的机制大致分为蔗糖 PTS (Phosphoenolpyruvate :Carbohydrate Phosphotransferase System)禾口蔴糖非 PTS 两种。经由蔗糖非PTS的情况下，微生物直接摄入蔗糖，然后分解成葡萄糖和果糖。另一方面， 经由蔗糖PTS的情况下，微生物摄入蔗糖时将蔗糖磷酸化，转化为蔗糖-6-磷酸。然后在微生物内部分解成葡糖-6-磷酸和果糖。S卩，即使经由任意机制，来自蔗糖的果糖也首先以未被磷酸化的形式出现在微生物内部。并且为了使上述未被磷酸化的果糖(以下称作非磷酸化果糖)进入糖酵解系统，需要将果糖异构化为葡萄糖或将其磷酸化。但是，FEMS Yeast Res, Vol.5, pp.1055-1062 (2005)、PNAS, Vol. 98(26)，pp.15257-15259(2001)、及 J Bacteriology, Vol. 184(19)，pp. 5307-5316(2002)指出，该微生物为大肠杆菌时，将非磷酸化果糖异构化为葡萄糖的活性、将果糖磷酸化的活性均非常低。因此，即使成功地使大肠杆菌内部出现非磷酸化果糖，但只要不采用特别的方法，则不能期待该大肠杆菌同化非磷酸化果糖。Can. J. Microbiol.，Vol. 45，pp. 418-422 (1999)公开了通过在大肠杆菌中只导入蔗糖水解酶基因(cscA)而能够使大肠杆菌以蔗糖为原料进行增殖。另一方面，以蔗糖为原料由大肠杆菌生产DOI中重要的一点是利用来自蔗糖的果糖实现菌体的增殖/生长。因此上述文献中自始至终只公开了蔗糖和葡萄糖被摄入菌体内的信息，完全没有公开来自蔗糖的果糖以何种程度被同化的数据。
发明内容
如上所述，由于需要葡萄糖来生产D0I，另外还需要作为高价糖的甘露糖醇等来使菌体增殖，所以现有已知的生产DOI的大肠杆菌在工业生产DOI方面存在问题。因此，本发明的目的在于提供一种生产DOI的大肠杆菌及使用其生产DOI的方法， 所述生产DOI的大肠杆菌能够由作为廉价糖的蔗糖有效地生产D0I。本发明是鉴于上述情况完成的，本发明的生产DOI的大肠杆菌及生产DOI的方法如下。[1] 一种生产DOI的大肠杆菌，所述大肠杆菌在蔗糖非PTS基因组中，至少具有编码蔗糖水解酶(CscA)的基因，同时被赋予2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统或具有被增强的 2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统。[2]如[1]所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述大肠杆菌在蔗糖非PTS基因组中只具有编码蔗糖水解酶(CscA)的基因。[3]如[1]或[2]所述的生产DOI的大肠杆菌，所述生产DOI的大肠杆菌具有糖摄入能力增强系统。[4]如[3]所述的生产DOI的大肠杆菌，所述生产DOI的大肠杆菌中，选自由该大肠杆菌本身具有的磷酸葡糖异构酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)、葡糖磷酸变位酶(Pgm)及负责稳定期中蛋白质合成修饰的核糖体修饰因子(Rmf)组成的组中的至少1种活性失活或活性降低。[5]如[1] [4]中任一项所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述生产DOI的系统来自DOI合成酶(BtrC)活性。[6]如[3] [5]中任一项所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述糖摄入能力增强系统为葡萄糖转运促进蛋白质(glucose facilitator, Glf)活性的增强。[7]如[1] W]中任一项所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述编码蔗糖水解酶(CscA)的基因来自大肠杆菌细菌。[8]如[7]所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述大肠杆菌细菌是大肠杆菌 0-157细菌。[9]如[6] [8]中任一项所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述葡萄糖转运促进蛋白质(Glf)来自发酵单胞菌属细菌。[10]如[9]所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述发酵单胞菌属细菌为运动发酵单胞菌细菌。[11]如[1] [10]中任一项所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述生产DOI的大肠杆菌是本身不具有蔗糖同化能力的种类的大肠杆菌。[12]如[11]所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，上述生产DOI的大肠杆菌是B株或其衍生株。[13] 一种生产DOI的方法，包括使用[1] [12]中任一项所述的生产DOI的大肠杆菌由含有蔗糖的来自植物的原料生产D0I。根据本发明，能够提供一种以蔗糖作为唯一碳源有效地生产DOI的生产DOI的大肠杆菌及使用其生产DOI的方法。
[图1]为表示本发明的实施例11中所得的细菌株的DOI生产率的图。[图2]为表示本发明的实施例12中所得的细菌株的DOI生产率的图。
具体实施例方式本发明的生产DOI的大肠杆菌是在蔗糖非PTS基因组中至少具有编码蔗糖水解酶 (CscA)的基因、并且被赋予2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统或具有被增强的2-脱氧蟹肌醇 (DOI)生产系统的生产DOI的大肠杆菌。本发明发现利用下述生产DOI的大肠杆菌，能够同化来自蔗糖的果糖，以蔗糖为唯一的碳源且以极高的生产效率生产DOI，所述生产DOI的大肠杆菌在蔗糖非PTS基因组中至少具有编码蔗糖水解酶(CscA)的基因、同时被赋予2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统或具有被增强的2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统。其结果，能够由来自植物、廉价且工业上经常使用的蔗糖有效地获得DOI。即，本发明的生产DOI的大肠杆菌能够将来自蔗糖的果糖磷酸化并摄入菌体内， 同时能够使用糖酵解系统将该果糖转化为用于菌体增殖/生长的能量。如上所述，还没有将来自蔗糖的果糖用作菌体增殖的营养源、同时利用大肠杆菌生产DOI的报告例。如果进一步对其进行说明，蔗糖水解酶(CscA)被认为是在大肠杆菌的细胞膜上几乎不存在的酶(参见 Can. J. Microbiol.，Vol. 45，pp. 418-422 (1999))，另一方面，生产 DOI的大肠杆菌作为不能将非磷酸化果糖摄取进入糖酵解系统、仅能利用磷酸化果糖用于其生长的生产DOI的大肠杆菌而被构建(参见W02006/109479号说明书)。在上述生产 DOI的大肠杆菌中，在蔗糖非PTS基因组中至少导入编码蔗糖水解酶(CscA)的基因，赋予了 CscA活性，结果与预想大大相反，能够得到可将果糖用作营养源的生产DOI的大肠杆菌。 结果所得到的本发明的生产DOI的大肠杆菌，尽管在作为对大肠杆菌而言是最易利用的糖的葡萄糖的存在下，也能有效地同化蔗糖或作为其分解产物的果糖来生产D0I，因此可以不需要使葡萄糖减少或枯竭而生产DOI，是更有效的。已知蔗糖被分解时生成等量的葡萄糖和果糖，但一般来说大肠杆菌通常与果糖相比优先摄入葡萄糖，在葡萄糖的存在下果糖不能被充分代谢。因此，令人惊讶的是，例如通过调节菌体培养时的PH，可以不受由葡萄糖引起的代谢抑制(分解代谢物阻抑)的影响，在大肠杆菌的生长中有效地利用果糖。以下详细说明本发明。本说明书中用“ ”表示的数值范围，表示包括分别以“ ”前后记载的数值作为最小值及最大值的范围。
本发明中所谓“蔗糖的同化”，是指将蔗糖直接、低分子化或高分子化后、优选低分子化后引入生物体内的能力，或者代谢性地转化为其他物质的能力。另外，本发明中，所谓同化包括将蔗糖进一步低分子化的分解。具体而言，包括将蔗糖分解为D-葡萄糖和D-果糖。本发明中所谓“蔗糖非PTS基因组”，是指微生物的蔗糖同化途径中与非PTS系统有关的基因组。具体而言，是由编码阻抑蛋白(CscR)的基因(cscR)、编码蔗糖水解酶 (CscA)的基因(cscA)、编码果糖激酶(CscK)的基因(cscK)、编码蔗糖透过酶(CscB)的基因(cscB)组成的基因组。本发明中，只要至少含有其中的cscA即可，例如可以举出仅有 cscA、cscA 与 cscK 的组合、cscA 与 cscB 的组合、cscA 与 cscR 的组合、cscA 与 cscB 与 cscR 的组合、cscA与cscK与cscR的组合、cscA与cscK与cscB的组合、cscA与cscK与cscB 与cscR的组合。其中，从更有效地生产DOI的观点考虑，优选只含有cscA，不含其它的基因。本发明中所谓“蔗糖水解酶(CscA) ”，是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号3. 2. 1.沈、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反应的酶的总称。需要说明的是，K-12株及B株等大肠杆菌本身不具有该酶。本发明中，通过在大肠杆菌中至少导入蔗糖非PTS基因组中的cscA而赋予CscA 活性，特别是通过在大肠杆菌中仅导入蔗糖非PTS基因组中的cscA而仅赋予CscA活性，由此将存在于菌体外的蔗糖在细胞膜上分解为葡萄糖和果糖并向细胞外释放，通过大肠杆菌本身具有的葡萄糖PTS及果糖PTS将其一边进行磷酸化一边摄入细胞质内。其结果，存在于细胞外的果糖以果糖-1-磷酸的形式出现在菌体内，然后，利用菌体内存在的果糖-1-磷酸激酶(FruK)转化为果糖-1，6-磷酸，进入糖酵解系统。作为本发明的导入宿主细菌的蔗糖水解酶(CscA)的基因(cscA)，可以利用从具有该酶的生物中得到的、具有编码蔗糖水解酶(CscA)的基因的碱基序列的DNA， 或者利用基于其公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(ftOteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌 (Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。另外优选在cscA中添加用于使CscA向菌体的外周胞质转移的信号序列。作为本发明的能够被导入宿主细菌的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用从具有该酶的生物中得到的、具有编码阻抑蛋白(CscR)的基因的碱基序列的DNA，或者利用基于其公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、 变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌 (Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。作为本发明的能够被导入宿主细菌的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用从具有该酶的生物中得到的、具有编码果糖激酶(CscK)的基因的碱基序列的DNA，或者利用基于其公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、 变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌 (Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。作为本发明的能够被导入宿主细菌的蔗糖透过酶(CscB)的基因，可以利用从具有该酶的生物中得到的、具有编码蔗糖透过酶(CscB)的基因的碱基序列的DNA， 或者利用基于其公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(ftOteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌 (Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌0-157株的基因的碱基序列的DNA。需要说明的是，本发明中所谓“宿主细菌”，是指接收从菌体外导入的一个以上的基因，结果成为本发明的生产DOI的大肠杆菌的该大肠杆菌。本发明中所谓“D0I生产系统”，是指用于赋予DOI生产能力的结构，所述结构是通过基因重组被导入或改变而得到的。上述的DOI生产系统可以为使用作对象的大肠杆菌中 DOI生产量增加的系统中的任意系统。可以优选举出与DOI生产有关的酶活性的赋予或增强或它们的组合。如上所述， 与上述的CscA活性组合，即使为本身不具有蔗糖同化能力的大肠杆菌，也能有效地由蔗糖生产DOI。本发明中所谓“赋予”或“增强”，是指除了将编码酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌体内之外，还包括通过将宿主细菌基因组上具有的酶基因的启动子活性增强或者将其取代为其他启动子而增强酶基因的表达。本发明中“利用基因重组”的用语，包括全部通过在原有基因的碱基序列中插入其他DNA、或基因的某部分的取代、缺失或它们的组合而产生的碱基序列上的改变，该改变例如可以是通过突变产生的。本发明中的DOI生产系统，从DOI的生产效率的观点考虑，优选为来自DOI合成酶 (BtrC)活性的系统，可以通过导入DOI合成酶基因(btrC)而赋予大肠杆菌上述DOI合成酶。已知DOI合成酶(BtrC)为催化由葡糖_6_磷酸生成2_脱氧蟹肌醇(DOI)的反应的酶，是42kDa和23kDa的二聚体肽，在钴离子的存在下酶活性被促进，在锌、铜离子的存在下酶活性被抑制，以NAD+为辅酶进行反应(例如参见日本特开2000-236881号、 W02006/109479号)。btrC基因可以使用来自具有该基因的生物的基因中的任意基因，例如可以举出来自杆菌属细菌的btrC基因。作为btrC基因，其中，从DOI的生产效率的观点考虑，可以优选使用来自环状芽胞杆菌(环状芽胞杆菌)的编码42kDa亚单位的基因 (GenBank 检索号 AB066276)。本发明中的生产DOI的大肠杆菌，优选为具有糖摄入能力增强系统的大肠杆菌。本发明中所谓糖摄入能力，是指通过生物体膜的糖输送能力，该能力也包括对从生物体膜的外侧向内侧的糖输送或从生物体膜的内侧向外侧的糖输送的作用。作为糖输送中的糖，包括五碳糖或六碳糖。具体而言，可以举出葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖等，可以优选举出葡萄糖。本发明中所谓“具有糖摄入能力增强系统”，是指上述糖从菌体外到菌体内的摄入增加的状态。本发明中所谓“糖摄入能力增强系统”，优选指用于使葡萄糖的摄入能力提高的结构。更优选为，该糖摄入能力增强系统与PTS系统或非PTS系统不同，例如为将菌体外的葡萄糖以其原形摄入菌体内的系统。被摄入的葡萄糖之后被菌体具有的葡糖激酶(Glk) 等磷酸化酶磷酸化，成为可用作物质生产的基质。如上所述，大肠杆菌除了具有本身具有的 PTS系统或非PTS系统的糖摄入系统之外，还变得具有新的糖摄入系统。本发明中的糖摄入能力增强系统，从DOI的生产率的观点考虑，优选为葡萄糖转运促进蛋白质(Glf)活性增强的系统。本发明中所谓葡萄糖转运促进蛋白质(Glf)，是指具有将D-葡萄糖或D-果糖等从生物体膜的外侧输送到内侧的作用的蛋白质的总称。已知导入了 glf基因的大肠杆菌中甘露糖醇的生产率提高的技术(例如参见日本特表2006-503559号)、或L-苯基丙氨酸或莽草酸的生产率提高(日本特表2002-512802号公报、Applied Microbiology and Biotechnology (2004)，64，333-339)，但是完全不知道葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf) 的导入在生产DOI的大肠杆菌中是否也显示出生产率提高的效果。需要说明的是，如下所述，导入glf基因对提高乳酸的生产率没有效果。因此，导入glf基因在以糖为原料的物质生产中并不是有效的通用技术，本发明中能够通过导入glf基因有效地生产DOI是出乎意料之外的。作为本发明的导入至宿主细菌中的葡萄糖转运促进蛋白质的基因(glf)，可以利用来自具有该蛋白质的生物的具有编码葡萄糖转运促进蛋白质(Glf)的基因的碱基序列的DNA或基于其公知的碱基序列合成的合成DNA序列。可以优选举出来自酵母或发酵单胞菌属细菌的基因，较优选为来自发酵单胞菌属细菌的基因，例如可以举出具有来自运动发酵单胞菌的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自运动发酵单胞菌的基因的碱基序列的DNA。作为本发明的较优选方案的生产DOI的大肠杆菌，从蔗糖的分解能力的观点考虑，蔗糖水解酶(CscA)活性可以通过导入对来自埃希氏菌属细菌的各蛋白质进行编码的基因而得到，从提高DOI的生产率的观点考虑，葡萄糖转运促进蛋白质(Glf)活性可以通过导入对来自发酵单胞菌属细菌的各蛋白质进行编码的基因而得到。较优选为，上述蔗糖水解酶(CscA)可以通过导入对来自大肠杆菌0-157细菌的各蛋白质进行编码的基因而得到， 葡萄糖转运促进蛋白质(Glf)可以通过导入对来自运动发酵单胞菌细菌的各蛋白质进行编码的基因而得到。通过使用来自上述细菌的基因，可以确实地表达上述基因的功能。作为本发明中用于使各种基因表达的启动子，只要为可以控制上述任意基因表达的启动子即可，但通常为在微生物内发挥作用的强启动子，并且优选为即使在葡萄糖存在下表达也不易受到抑制的启动子，具体而言可以举出甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下有时称作GAPDH)的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。本发明中所谓赋予各活性的大肠杆菌，是指利用从菌体外到菌体内的任何方法基于酶或蛋白质赋予了活性的大肠杆菌。上述大肠杆菌可以使用下述方法制备例如使用基因重组技术将编码该酶及蛋白质的基因从菌体外导入菌体内等方法。从菌体外向菌体内导入基因时所需要的基因组DNA的制备、DNA的切断及连接、转化、PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等方法，可以利用本领域技术人员所熟知的一般方法进行。上述方法记载在 Sambrook, J. , et. al. ,"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等中。为了以尽可能高的收率生产DOI，本发明的优选方案中，选自由宿主细菌具有的与葡糖-6-磷酸的代谢有关的以下的酶和与控制稳定期中蛋白合成有关的核糖体修饰因子 (Rmf)组成的组中的至少1种的活性失活或降低，所述与葡糖-6-磷酸的代谢有关的酶为磷酸葡糖异构酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)及葡糖磷酸变位酶(Pgm)。上述方案中，或者分别单独对分别编码上述各酶的基因(分别为Pgi基因、zwf基因及Pgm基因)进行基因破坏、或者同时对2种基因(pgi基因和zwf基因、pgi基因和pgm基因)进行基因破坏、或者同时对3种基因进行基因破坏，并且，或者单独对编码与稳定期中的蛋白合成的控制有关的RMF蛋白质的基因(rmf基因)进行基因破坏，或者对上述与葡糖-6-磷酸的代谢有关的酶进行编码的基因被破坏了的各种基因破坏株进行rmf基因的破坏。如上所述，能够抑制因菌而引起的作为用于生产DOI的直接基质的葡糖-6-磷酸的分解代谢，另外通过稳定期中的蛋白质合成能够提高生产DOI的能力。上述生产DOI的细菌，例如记载于国际公开2006/109479号说明书中。作为本发明中生产DOI的大肠杆菌，更优选为磷酸葡糖异构酶(Pgi)及葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)的活性同时失活或降低的大肠杆菌。最优选为磷酸葡糖异构酶O^gi)及葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)及葡糖磷酸变位酶(Pgm)的活性同时失活或降低的大肠杆菌。作为用于使各种酶失活的方法，只要为出于上述目的通常使用的方法即可，可以没有特殊限制地使用，例如可以举出通过编码酶的基因的同源重组等引起的基因破坏。上述基因的破坏可以为染色体上的基因的破坏，也可以为质粒基因的破坏。另外，本发明中的大肠杆菌，考虑到DOI的合成，可以使用破坏各种染色体/质粒基因所得到的破坏株。本发明中所谓“失活”，是指利用现有的测定系统测定的该酶的活性在检测限以下的状态。本发明中所谓“降低”，是指通过编码该酶的基因的基因重组，与进行上述处理前的状态相比，该酶的活性显著下降的状态。本发明中的酶的活性，可以为利用现有的测定系统中的任一种测定得到的活性。本发明中所谓“基因破坏”，是指为了使某基因的功能不能发挥而在该基因的碱基序列中引入突变、插入其他的DNA或者使基因的某部分缺失。基因破坏的结果为该基因不能转录为mRNA，而使结构基因不被翻译；或者被转录的mRNA不完全，而使被翻译的结构蛋白质的氨基酸序列中产生突变或缺失，不能发挥原有的功能。基因破坏株的制备可以使用任意方法，只要能得到该酶或蛋白质不表达的破坏株即可。已经报道了多种基因破坏的方法(自然育种、突变剂添加、紫外线照射、放射线照射、随机突变、转座子、部位特异性基因破坏)，但从能够仅破坏某种特定基因的方面考虑，优选利用同源重组进行基因破坏。利用同源重组的方法记载于J. Bacteriol.，161，1219-1221 (1985)或 J. Bacteriol.，177，1511-1519 (1995)或 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97,6640-6645(2000)中，本领域技术人员可以利用上述方法及其应用容易地实施。本发明中使用的大肠杆菌，可以为能导入及改变上述各基因的任意大肠杆菌。较优选为本身不具有蔗糖同化能力的种类的大肠杆菌，作为上述大肠杆菌，可以举出埃希氏菌属Escherichia)细菌等，特别优选使用便利性高、工业上使用的实际成果丰富的大肠杆菌(Escherichia coli 大肠杆菌)。例如可以举出K-12株、B株、C株及其衍生株等。如上所述，可以扩大本身不具有蔗糖同化能力的种类的大肠杆菌的用途。本发明的生产DOI的大肠杆菌，优选使用本身不具有蔗糖同化能力的种类的大肠杆菌中的B株及其衍生株。通过使用B株及其衍生株构筑本发明的生产DOI的大肠杆菌， 可以使用作为常用工业培养基的玉米浆而得到高DOI生产率。大肠杆菌通常被分类为Κ-12 株、B株、C株。广泛使用Κ-12衍生株和B衍生株作为工业上物质生产的宿主，两者均能通过基因重组表达异源蛋白质，但是，到目前为止，有关B株在DOI的生产中为优选的宿主方面的知识完全属于未知。因此，在DOI的生产中B衍生株与Κ-12衍生株相比显示出明显高的生产率是无法预料的特异现象。本发明的生产DOI的方法包括使用上述生产DOI的大肠杆菌、由含有蔗糖的来自植物的原料生产2-脱氧蟹肌醇，即，包括使上述生产DOI的大肠杆菌与含有蔗糖的来自植物的原料接触的工序、和对通过接触所得到的DOI进行回收的回收工序。需要说明的是，本说明书中所说的用语“工序”，不仅指独立的工序，即使在不能与其他工序明确区分的情况下，只要能实现该工序所期望的作用，也在该用语的范围内。上述DOI生产方法中使用的来自植物的原料，只要为从植物得到的碳源并且经大肠杆菌代谢能够转化为DOI的原料即可，没有特殊限制。本发明中，指根、茎、干、枝、叶、花、 种子等器官、含有它们的植物体、上述植物器官的分解产物，进而在由植物体、植物器官、或它们的分解产物得到的碳源中，能在微生物的培养中用作碳源的物质也包含在来自植物的原料中。作为上述包含在来自植物的原料中的碳源，除蔗糖之外，作为一般物质可以举出淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类，或大量含有上述成分的草木质分解产物或纤维素水解物等。进而来自植物油的甘油或脂肪酸也属于本发明中的碳源。本发明中作为来自植物的原料，可以优选举出粮食等农作物，例如玉米、米、小麦、 大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、或它们的组合，作为该原料的使用形式，可以为未加工品、榨汁、 粉碎物等，没有特别限定。另外，也可以为只为上述碳源的形式。接触工序中生产DOI的大肠杆菌和来自植物的原料的接触通常通过在含有来自植物的原料的培养基中培养生产DOI的大肠杆菌而进行。来自植物的原料和生产DOI的大肠杆菌的接触密度根据生产DOI的大肠杆菌的活性的不同而不同，通常情况下，作为培养基中的来自植物的原料的浓度，相对于混合物的总质量，以换算为葡萄糖的量计，可以使初始的糖浓度为20质量％以下，从大肠杆菌的耐糖性的观点考虑，优选使初始的糖浓度为15质量％以下。其他的各成分只要以微生物的培养基中通常添加的量添加即可，没有特殊限制。另外作为培养基中的生产DOI的大肠杆菌的含量，根据大肠杆菌的种类及活性的不同而不同，但通常情况下可以使初始菌浓度相对于培养液为0. 1质量％ 30质量％，从控制培养条件的观点考虑，优选为1质量％ 10质量％。本发明中的生产DOI的方法包括下述方法通过在含有生产DOI的大肠杆菌和来自植物的原料的混合物中培养生产DOI的大肠杆菌来同化来自植物的原料，一定时间后使用蒸馏、膜分离、提取等公知技术对培养液中分泌的DOI进行精制。生产DOI的方法中的混合物只要以细菌类的培养中通常使用的基本培养基为主体即可，可以使用根据生产DOI的大肠杆菌的种类而通常使用的培养基中的任一种。上述基本培养基只要是含有碳源、氮源、 无机离子及根据需要使用的其他微量成分的培养基即可，没有特殊限制。作为碳源，只为上述蔗糖就已足够，但从DOI的生产效率的观点考虑，进而可以适当追加使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类；富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸；甲醇、乙醇、甘油等醇类及其它。作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、氨气、氨水等无机态氮源、及蛋白质水解物等有机态氮源及其它。作为无机离子，根据需要可以适当使用镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子、锰离子及其它。作为有机微量成分，可以适当使用维生素、氨基酸等及含有它们的酵母提取物、 胨、玉米浆、酪蛋白分解物及其它。需要说明的是，作为本发明中使用的培养基，如果考虑供应于工业生产，则优选液体培养基。作为培养条件，根据制成的菌体、培养装置而改变，但通常情况下培养温度为 20°C 40°C，从DOI的生产效率的观点考虑，较优选在25°C 35°C下进行培养。另外，可以使PH为pH4 pH9，优选为pH5. 0 ρΗ7· 5，较优选为pH6. 0 ρΗ7· 0，可以用NaOH、NH3等进行调节。培养时间为菌体充分增殖、且DOI生成所需要的时间，没有特殊限制。培养时通常使用能控制温度、ρΗ、通气条件、搅拌速度的培养槽，但本发明培养时不限于使用培养槽。使用培养槽进行培养时，根据需要也可以预先进行作为预培养的种培养，将其必要量接种到预先配制的培养槽内的培养基中。培养本发明中得到的微生物生产DOI时，可以完全不进行通气，但为了得到较理想结果，优选进行通气。此处所谓的通气条件下，未必是必须将空气通过培养液中，也包括根据培养槽的形状一边适度地搅拌培养液一边将培养液上的空气层进行换气之类的上部通气，是指使含有氧的气体流入培养槽的内部。通气到液体中时，由于根据内压、搅拌桨位置、搅拌桨形状、搅拌速度的组合使得溶存的氧浓度发生变化，所以可以以DOI的生产率及除DOI之外的有机酸量等为指标如下求出最适条件。例如，使用500g的培养液利用ABLE公司制培养装置BMJ-Ol等较小型的培养槽进行培养时，通过能够达到使空气在常压下0. 005L/分钟 2L/分钟、搅拌速度50rpm 2000rpm，较优选能够达到使空气在常压下0. 05L/分钟 IL/分钟、搅拌速度 IOOrpm IOOOrpm的通气条件，可以得到理想结果。上述的通气条件不需要从培养初期到结束一直进行，即使在培养工序的一部分中进行也能得到理想结果。回收工序是回收通过该接触而获得的DOI的工序，通常情况下从利用上述培养所得的培养物中回收DOI。本发明中所谓的培养物，是指利用上述方法生产的菌体、培养液及它们的处理物。作为从培养物中回收DOI的方法，例如从培养液中回收时，可以利用通常已知的方法。例如，利用离心分离等除去菌体后，将培养上清液添加到离子交换树脂中，用蒸馏水进行洗脱。可以一边测定折射率、PH、传导率一边分离得到不含杂质的部分，除去其水溶液回收D0I。另外，由于利用本发明的方法生产的菌体生产了适合DOI生产的酶组，所以利用菌体进一步生产、回收DOI也被认为是从培养物回收DOI的方法的一部分。利用本发明，能够以廉价的来自植物的糖为原料以极高的水平生产D0I。本发明对碳中和(carbon neutral)的DOI的普及极为有用。[实施例]以下记载本发明的实施例，但本发明并不受这些实施例的限制。另外，只要没有特殊说明，实施例中的“ ％，，为质量基准。[实施例1]<大肠杆菌pgi基因附近区域的克隆>大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBank检索号U00096)，编码大肠杆菌的磷酸葡糖异构酶(以下有时称作pgi)的基因的碱基序列也已被报道了。为了克隆编码Pgi的基因(l，650bp)的碱基序列的附近区域，合成了四种具有下述碱基序列的寡核苷酸引物CAGGAATTCG CTATATCTGG CTCTGCACG (序列号 1)、CAGTCTAGAG CAATACTCTT CTGATTTTGAG(序列号 2)、CAGTCTAGAT CATCGTCGAT ATGTAGGCC(序列号；3)及 GACCTGCAGA TCATCCGTCA GCTGTACGC(序列号4)。序列号1的引物在5，末端侧具有EcoRI识别位点，序列号2及3的引物在5’末端侧具有^CbaI识别位点，序列号4的引物在5’末端侧具有I^stI 识别位点。利用 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)记载的方法制备大肠杆菌MG1655株的基因组DNA，使用所得的基因组DNA Iyg和下述引物的DNA 各lOOpmol，在通常的条件下进行PCR，由此分别扩增约1. 01Λ (以下有时称作pgi_L片段及 Pgi-R片段)的DNA片段，所述引物为具有序列号1的碱基序列的引物和具有序列号2的碱基序列的引物的组合、具有序列号3的碱基序列的引物和具有序列号4的碱基序列的引物的组合。利用琼脂糖电泳分离上述DNA片段并回收，分别用EcoRI及^CbaI消化pgi-L片段， 用^CbaI及I^stI消化pgi-R片段。将上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18csl (GenBank 检索号AB019610)的EcoRI及I^stI消化物混合，利用T4DNA连接酶反应后，转化到大肠杆菌DH5ci感受态细胞(TAKARA BIO公司制)中，得到含有编码pgi的基因的5’上游附近片段和3’上游附近片段这2个片段的质粒，将其命名为pTHApgi。[实施例2]<大肠杆菌MG1655 Δ pgi株的制备>将实施例1中得到的质粒ρΤΗ Δ pgi转化到大肠杆菌MG1655株中，将其于使细胞能够保持温度感受性质粒的30°C下、在含有10 μ g/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养一夜，得到转化体。将所得的转化体于30°C下在LB培养基中培养3小时至一夜后，用LB液体培养基或生理盐水稀释，涂布到含有10 μ g/ml氯霉素的LB琼脂平板上。在不能保持温度感受性质粒的42°C下对该LB琼脂平板进行培养，得到作为通过基因组外-基因组间的同源重组将质粒整体参入到大肠杆菌基因组中的菌株的生长的转化体。从该菌株获得基因组DNA，实施以其作为模板的PCR，确认了该菌株具有下述性质pTH18Csl具有的氯霉素耐性基因存在于基因组上，与编码pgi的基因的5’端附近区域及3’端附近区域分别相同的区域存在于基因组上，从而确认了质粒整体被参入到大肠杆菌基因组中。将质粒整体被参入到大肠杆菌基因组中的菌株接种到IOOml装有20ml不含氯霉素的LB液体培养基的带挡板的烧瓶中，将其于30°C下振荡培养4小时。用不含氯霉素的 LB液体培养基稀释该培养液，涂布到不含氯霉素的LB琼脂培养基上。于42°C下对其培养， 任意挑选96个生长的菌落，使它们分别在不含氯霉素的LB琼脂培养基上和含有氯霉素的 LB琼脂培养基上生长，挑选氯霉素感受性的菌株。进而从挑选的菌株中获得基因组DNA，实施以其为模板的PCR，挑选编码pgi的基因缺失的菌株，将其命名为MG1655 Δ pgi株。[实施例3]<大肠杆菌zwf基因的附近区域的克隆>编码大肠杆菌的葡糖-6-磷酸脱氢酶(以下有时称作zwf)的基因的碱基序列也被报道。为了克隆编码ZWf的基因(l，476bp)的碱基序列附近区域，合成了 4种具有下述碱基序列的寡核苷酸引物CAGGAATTCA TGCGTTGCAG CACGATATC(序列号 5)、CAGTCTAGAT AACCCGGTAC TTAAGCCAG (序列号 6)、CAGTCTAGAC TGCGCTTATC CTTTATGGT (序列号 7)及 GACCTGCAGT TACCGGTCAT GCGTGTAAC (序列号8)。序列号5的引物在5，末端侧具有EcoRI 识别位点，序列号6及7的引物在5’末端侧具有^CbaI识别位点，序列号8的引物在5’末端侧具有PstI识别位点。使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA 1 μ g和下述引物的DNA各IOOpmol，在通常条件下进行PCR，由此分别扩增约0. 85kb (以下有时称作zwf-L片段)的DNA片段和约 1. Okb (以下有时称作zwf-R片段)的DNA片段，所述引物为具有序列号5的碱基序列的引物和具有序列号6的碱基序列的引物的组合、具有序列号7的碱基序列的引物和具有序列号8的碱基序列的引物的组合。利用琼脂糖电泳分离上述DNA片段并回收，分别用EcoRI 及^CbaI消化zwf-L片段，用^CbaI及I^stI消化zwf-R片段。将上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18csl的EcoRI及I^stI消化物混合，利用T4DNA连接酶反应后，转化到大肠杆菌DH5ci感受态细胞(TAKARA BIO公司制)中，得到含有编码zwf的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段这2个片段的质粒，命名为ρΤΗΔ zwf。[实施例4]<大肠杆菌MG1655 Δ pgi Δ zwf株的制备>将实施例3中得到的质粒pTHAzwf转化到实施例2中得到的大肠杆菌 MG1655Apgi株中，将其于使细胞能够保持温度感受性质粒的30°C下、在含有10 μ g/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养一夜，得到转化体。将所得的转化体于30°C下在LB培养基中培养3小时至一夜后，用LB液体培养基或生理盐水稀释，涂布到含有10 μ g/ml氯霉素的LB 琼脂平板上。在不能保持温度感受性质粒的42°C下对该LB琼脂平板进行培养，得到作为通过基因组外-基因组间的同源重组将质粒整体参入到大肠杆菌基因组中的菌株的生长的转化体。从该菌株获得基因组DNA，实施以其作为模板的PCR，确认了该菌株具有下述性质具有pTH18csl的氯霉素耐性基因存在于基因组上，与编码zwf的基因的5’端附近区域及3’端附近区域分别相同的区域存在于基因组上，从而确认了质粒整体被参入到大肠杆菌基因组中。将质粒整体被参入到大肠杆菌基因组中的菌株接种到IOOml装有20ml不含氯霉素的LB液体培养基的带挡板的烧瓶中，将其于30°C下振荡培养4小时。用不含氯霉素的 LB液体培养基稀释该培养液，涂布到不含氯霉素的LB琼脂培养基上。将其在42°C下培养， 任意挑选96个生长的菌落，使它们分别在不含氯霉素的LB琼脂培养基上和含有氯霉素的 LB琼脂培养基上生长，挑选氯霉素感受性菌株。进而从挑选的菌株中获得基因组DNA，实施以其为模板的PCR，挑选编码zwf的基因缺失的菌株，将其命名为MG1655 Δ pgi Δ zwf株。[实施例5]<在GAPDH启动子控制下的DOI合成酶基因(btrC)表达载体的构建>大肠杆菌的GAPDH基因的碱基序列已经被报道。为了获得甘油醛_3_磷酸脱氢酶 (GAPDH)启动子，分别合成了具有下述碱基序列的寡核苷酸引物CGAGCTACAT ATGCAATGAT TGACACGATT CCG (序列号钔、及 CCAAGCTTCT GCAGGTCGAC GGATCCGAGC TCAGCTATTT GTTAGTGAAT AAAAGG(序列号10)。序列号9的引物在其5’末端侧具有NdeI识别位点，序列号10的引物从其5’末端侧依次分别具有HindIII、PstI、MlI、BamHUacI识别位点。使用上述2种引物和大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，在通常条件下进行PCR法，扩增DNA片段。用限制酶NdeI和HindIII消化所得的DNA片段，由此得到约 IOObp的编码GAPDH启动子的片段。然后将上述DNA片段与用Ndel、HindIII消化的大肠杆菌用克隆载体PBR322 (GenBank检索号J01749)混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂平板上生长的转化体。将所得的菌落于30°C下在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。将该质粒命名为PGAP。环状芽胞杆菌((Bacilluscirculans)ATCC 4513)具有的DOI 合成酶基因(btrC) 的碱基序列已经被报道(GenBank检索号AB066276)。为了获得btrC基因，分别合成了具有下述碱基序列的寡核苷酸引物CACTGGAGCT CGCTGGTGGA ATATATGACG ACTAAACAAA TTTG(序列号 11)、及 CAGGATCCTT ACAGCCCTTC CCGGATC(序歹Ij号 12)。序列号 11 的引物从其5’末端侧开始依次具有McI识别位点和13个碱基的GAPDH基因的核糖体结合序列。序列号12的引物在其5’末端侧具有BamHI识别位点。以上述2种引物和环状芽胞杆菌的基因组DNA为模板，在通常条件下进行PCR法， 用限制酶MeI及BamHI消化所得的DNA片段，由此得到约1. Ikbp的DOI合成酶基因(btrC) 片段。将该DNA片段与利用限制酶Mcl及BamHI消化质粒pGAP所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有 50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂平板上生长的转化体。将所得菌落于30°C下在含有50 μ g/mL 氨苄西林的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-btrC，构建DOI合成酶基因(btrC)表达载体。[实施例6]<在GAPDH启动子控制下的DOI合成酶基因(btrC)及蔗糖水解酶基因(cscA)表达载体的构建>大肠杆菌0-157株具有的蔗糖水解酶基因(cscA)的碱基序列已经被报道。即，记载于GenBank检索号AE005174中记载的大肠杆菌0-157株基因组序列的3274383-3275816 中。为了获得cscA基因，分别合成了具有下述碱基序列的寡核苷酸引物GCGGATCCGC TGGTGGAATA TATGACGCAA TCTCGATTGC (序列号 13)、及 GACGCGTCGA CTTAACCCAG TTGCCAGAGT GC(序列号14)。序列号13的引物从其5’末端侧开始依次具有BamHI识别位点和13个碱基的GAPDH基因的核糖体结合序列。序列号14的引物在其5’末端侧具有MlI识别位点。以上述2种引物和大肠杆菌0-157株的基因组DNA(SIGMA-ALDRICH:IRMM449)为模板，在通常条件下进行PCR法，利用限制酶BamHI及MlI消化所得的DNA片段，由此得到约1. 4kbp的蔗糖水解酶基因(cscA)片段。将该DNA片段与利用限制酶BamHI及McI消化质粒pGAP-btrC所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂平板上生长的转化体。将所得的菌落于30°C下在含有氨苄西林50 μ g/mL的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-btrC-cscA，构建DOI合成酶基因(btrC)及蔗糖水解酶基因 (cscA)表达载体。[实施例7]〈在GAPDH启动子控制下的DOI合成酶基因(btrC)、蔗糖水解酶基因(cscA)及葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf)表达载体的构建〉运动发酵单胞菌((Zymomonas mobilis)ATCC 29191)具有的葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf)的碱基序列已经被报道(GenBank检索号M60615)。为了获得glf基因，分别合成了具有下述碱基序列的寡核苷酸引物CCTGTCGACG CTGGTGGMT ATATGAGTTC TGMAGTAGT CAGG(序列号 15)、及 CTACTGCAGC TACTTCTGGG AGCGCCACA(序列号 16)。序列号 15 的引物从其5’末端侧开始依次具有MlI识别位点和13个碱基的GAPDH基因的核糖体结合序列。 序列号16的引物在其5’末端侧具有I^stI识别位点。以上述2种引物和运动发酵单胞菌的基因组DNA为模板，在通常条件下进行PCR 法，利用限制酶MlI及I3StI消化所得的DNA片段，由此得到约1. 4kbp的葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf)片段。将该DNA片段与利用限制酶MlI及I^stI消化质粒pGAP-btrC-cscA 所得的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5ci感受态细胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂平板上生长的转化体。将所得的菌落于 30°C下在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒 pGAP-btrC-cscA-glf，构建DOI合成酶基因(btrC)、蔗糖水解酶基因(cscA)及葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf)表达载体。[实施例8]<pGAP-btrC-cscA 及 pGAP-btrC-cscA-glf 向 MG1655 Δ pgi Δ zwf 株的导入 >将上述质粒pGAP-btrC-cscA 及 pGAP-btrC-cscA-glf 分别转化到 MG1655 Δ pgi Δ zwf株中，于37°C下在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂平板上培养一夜，由此得到 MG1655 Δ pgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA 株及 MG1655 Δ pgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA-glf 株。[实施例9]<使用MG1655 Apgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA株的DOI的生产率和由培养pH引起的 DOI的生产率的不同>
作为预培养，将大肠杆菌MG1655 Apgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA株接种到25ml装入锥形瓶的LB Broth, Miller培养液(DifcoM4620)中，以120rpm进行搅拌培养一夜后，全部接种到装有475g下述组成的培养基的IL容量的培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01) 中。培养在大气压下、通气量1. Ovvm、搅拌速度SOOrpm、培养温度30°C下进行。共使用4台培养槽，使用12. 5%氨水和2N盐酸将pH调至ρΗ7· 0、ρΗ6· 5、ρΗ6· 0。另外，通过测定660nm 处的吸光度测定菌体浓度。培养开始时的菌体浓度全部为0. 29。培养62小时后，利用HPLC 按照常规方法测定所得的培养液中的D0I、蔗糖、葡萄糖、果糖的量。另外，通过测定660nm 处的吸光度测定菌体浓度。培养中使用的培养基的组成记载于下述表1。结果示于表2。
权利要求
1.一种生产DOI的大肠杆菌，所述大肠杆菌在蔗糖非PTS基因组中至少具有编码蔗糖水解酶(CscA)的基因，同时被赋予2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统或具有被增强的2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统。
2.如权利要求1所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述大肠杆菌在蔗糖非PTS基因组中只具有编码蔗糖水解酶(CscA)的基因。
3.如权利要求1所述的生产DOI的大肠杆菌，所述生产DOI的大肠杆菌具有糖摄入能力增强系统。
4.如权利要求3所述的生产DOI的大肠杆菌，所述生产DOI的大肠杆菌中，选自由所述大肠杆菌本身具有的磷酸葡糖异构酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)、葡糖磷酸变位酶(Pgm)及负责稳定期中蛋白质合成的修饰的核糖体修饰因子(Rmf)组成的组中的至少 1种的活性失活或活性降低。
5.如权利要求1所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述生产DOI的系统来自DOI合成酶(BtrC)活性。
6.如权利要求3所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述糖摄入能力增强系统为葡萄糖转运促进蛋白质(Glf)活性的增强。
7.如权利要求1所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述编码蔗糖水解酶(CscA)的基因来自大肠杆菌细菌。
8.如权利要求7所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述大肠杆菌细菌是大肠杆菌 0-157细菌。
9.如权利要求6所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述葡萄糖转运促进蛋白质(Glf) 来自发酵单胞菌属细菌。
10.如权利要求9所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述发酵单胞菌属细菌为运动发酵单胞菌细菌。
11.如权利要求1所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述生产DOI的大肠杆菌是本身不具有蔗糖同化能力的种类的大肠杆菌。
12.如权利要求11所述的生产DOI的大肠杆菌，其中，所述生产DOI的大肠杆菌是B株或其衍生株。
13.—种生产DOI的方法，包括使用权利要求1所述的生产DOI的大肠杆菌由含有蔗糖的来自植物的原料生产DOI。
全文摘要
本发明涉及一种生产DOI的大肠杆菌及使用所述大肠杆菌由含有蔗糖的来自植物的原料生产DOI的DOI生产方法，所述生产DOI的大肠杆菌在蔗糖非PTS基因组中至少具有编码蔗糖水解酶(CscA)的基因，同时所述大肠杆菌被赋予2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统或具有被增强的2-脱氧蟹肌醇(DOI)生产系统，优选为进一步具有糖摄入能力增强系统的生产DOI的大肠杆菌。
文档编号C12R1/19GK102197135SQ20098014311
公开日2011年9月21日 申请日期2009年10月30日 优先权日2008年11月5日
发明者和田光史, 夏地智之, 安乐城正, 德田淳子, 森重敬, 高桥克幸, 高桥均 申请人:三井化学株式会社