本发明涉及的是制备米糠蛋白ACE抑制肽的方法，具体涉及高压电场与酶法复合制备米糠蛋白ACE抑制肽的方法。
二、
背景技术：
米糠是稻谷的副产品之一，是一种量大面广的可再生资源，我国对于米糠的深度开发利用及相应理论研究尚处于低水平阶段，大部分作为畜禽饲料被浪费掉，仅有少量用来榨油或提取植酸钙、肌醇、谷维素等较高价值的再生产品。米糠重量虽只占稻米重量的6%-8%，但却含有90%以上人体必需元素，米糠还含有抗癌及其他促进人体健康的功能性物质，如膳食纤维，维生素、矿物质、谷维素、植酸、蛋白酶抑制剂等；同时还可以从廉价的米糠资源中获得高价值的营养物质或生物活性物质，如蛋白质、蛋白活性肽、生育酚、二十八碳烷醇、角鲨烯、神经酰胺等，对人体健康和现代文明病的预防及治疗具有重要作用。
米糠蛋白肽易于被人体吸收利用，同时兼具低过敏性、溶解性好等特点，并且米糠蛋白肽在抗氧化、降血压血脂、血管紧张素转换酶抑制活性、阿片样拮抗活性、免疫调节等生物功能活性方面都已有相关报道，是一种非常有实用前途的功能活性肽。ACE抑制肽是对现代常见病高血压具有良好生理调节功效的一类生物活性肽。与化学合成ACE抑制剂或药物相比，从天然食源性物质中获取的ACE抑制剂虽见效较慢，但易被人体吸收利用，同时调节血压时效更长，相对温和持久，对人体肾脏、肝脏等器官无毒副作用。
三、
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供了高压电场与酶法复合制备米糠蛋白ACE抑制肽的方法，这种高压电场与酶法复合制备米糠蛋白ACE抑制肽的方法缩短酶解时间，提高米糠蛋白ACE抑制肽活性。
为了实现上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：这种高压电场与酶法复合制备米糠蛋白ACE抑制肽的方法：
一、以米糠为原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸馏水配制成悬浮液，控制底物质量百分比浓度为2-6%，将温度升温至90℃，加热预处理10min；加入1mol/L氢氧化钠溶液调pH值，恒温恒pH下搅拌15min，待pH稳定后加入蛋白酶水解40-90min，水解过程中进行高压电场处理，电场强度500-1000v/cm、酶解温度55-63℃、pH 7.8-8.5；反应结束后迅速加热10 min，对蛋白酶进行充分的灭活处理；离心分离酶解液，收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、将米糠蛋白水解液冷冻干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽。
上述方案中蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase2.4 L，碱性蛋白酶Alcalase2.4 L的酶用量为2000U/g。
上述方案中步骤二中离心分离酶解液的转速为4000r/min，离心时间15min。
上述方案中步骤二中酶解时间90min、底物浓度3.6%、电场强度750v/cm、酶解温度62℃、pH8.5。
上述方案步骤三得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率为78.30%。
有益效果：
1、本发明与常规酶解方法相比，可缩短酶解时间60mim，提高米糠蛋白ACE抑制肽活性12%。
2、在一定范围内，高压电场作用下可促进蛋白酶的活力，本发明利用高压电场在一定范围内活化酶,激发了酶更多的活性位点或是增大了酶现存活性位点起催化作用的范围, 因此提高了反应速率，缩短了酶解时间。
四、具体实施方式
下面对本发明做进一步的说明：
实施例1：
一、以米糠为原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸馏水配制成悬浮液，控制底物质量百分比浓度为2%，将温度升温至90℃，加热预处理10min；加入1mol/L氢氧化钠溶液调pH值，恒温恒pH下搅拌15min，待pH稳定后加入蛋白酶水解40min，水解过程中进行高压电场处理，电场强度500v/cm、酶解温度55℃、pH7.8，蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase2.4L，碱性蛋白酶Alcalase2.4L的酶用量为2000U/g；反应结束后迅速加热10min，对蛋白酶进行充分的灭活处理；离心分离酶解液，离心分离酶解液的转速为4000r/min，离心时间15min，然后收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、将米糠蛋白水解液冷冻干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽，得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率为78.30%。
米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率测得方法如下：将ACE底物HHL溶于0.1mol/L的含0.3mol/L NaCl的硼酸盐缓冲液中（pH8.3），配制成5.0mol/L的浓度。取50µL 5mol/L HHL溶液与20µL ACE抑制剂混合，在37℃恒温水浴中预热5min。随后加入10.0µL 的0.1U/mL ACE溶液，37℃反应30min。迅速加入100µL 的1 mol/L HCl溶液终止反应，并加入蒸馏水至0.5mL。在避光条件下加入0.6mL喹啉，旋涡器上混合10s后加入0.2mL苯磺酰氯（BSC），立即盖紧离心管管塞在旋涡混合器上混合20s，反应液在30℃恒温水浴锅中避光放置30min。随后向管中加入3.7mL无水乙醇，混匀，继续避光放置30min 。用紫外可见分光光度计测定波长492nm的吸光值，计算ACE抑制程度。
式中：Aa：ACE及ACE抑制剂都存在的条件下的吸光度；
Ab：ACE抑制剂不参与反应的条件下测得的吸光度；
Ac：ACE不参与反应的条件下的吸光度。
实施例2：
一、以米糠为原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸馏水配制成悬浮液，控制底物质量百分比浓度为3.6%，将温度升温至90℃，加热预处理10min；加入1mol/L氢氧化钠溶液调pH值，恒温恒pH下搅拌15min，待pH稳定后加入蛋白酶水解90min，水解过程中进行高压电场处理，电场强度750v/cm、酶解温度62℃、pH8.5，蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase2.4L，碱性蛋白酶Alcalase2.4L的酶用量为2000U/g；反应结束后迅速加热10min，对蛋白酶进行充分的灭活处理；离心分离酶解液，离心分离酶解液的转速为4000r/min，离心时间15min，然后收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、将米糠蛋白水解液冷冻干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽，得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率为78.30%。
实施例3：
一、以米糠为原料提取米糠蛋白；
二、向米糠蛋白中加入蒸馏水配制成悬浮液，控制底物质量百分比浓度为6%，将温度升温至90℃，加热预处理10min；加入1mol/L氢氧化钠溶液调pH值，恒温恒pH下搅拌15min，待pH稳定后加入蛋白酶水解60min，水解过程中进行高压电场处理，电场强度1000v/cm、酶解温度60℃、pH8，蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase2.4L，碱性蛋白酶Alcalase2.4L的酶用量为2000U/g；反应结束后迅速加热10min，对蛋白酶进行充分的灭活处理；离心分离酶解液，离心分离酶解液的转速为4000r/min，离心时间15min，然后收集上清液，即得米糠蛋白水解液；
三、将米糠蛋白水解液冷冻干燥，得到米糠蛋白ACE抑制肽，得到的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率为78.30%。
随着环境电场的变化, 生物体内物质的电荷分布、排列、运动方式将随之改变, 从而影响酶的生物活性。蛋白酶活性高会加快蛋白质的分解, 促进水解产物多肽的生成速度。酶活发生变化的机制可能是电场处理引发酶关键部位发生氧化反应, 也可能是酶的静电性质和构象发生改变。
本发明应用碱性蛋白酶Alcalase2.4 L结合高压电场强度处理后, ACE抑制率提高，说明高压电场作用下可促进蛋白酶的活力。高压电场在一定范围内活化酶, 其机理可能是电场激发了酶更多的活性位点或是增大了酶现存活性位点起催化作用的范围, 因此提高了反应速率。