石金钱龟多肽的制备方法以及石金钱龟多肽面膜与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及石金钱龟多肽的制备方法以及石金钱龟多肽面膜。

背景技术：

石金钱龟又名黄喉拟水龟，主要分布在我国广东，海南，广西，福建，湖南等省区。石金钱龟为龟科拟水龟属的爬行动物。根据现在的科学研究表明，石金钱龟的体内除了含有丰富的蛋白质，同时还含有多种易于人体吸收的维生素、骨胶原、肽类、不饱和脂类、多种酶类、角质、脂肪酸、血糖和一些人体必须的钙、钾、磷等营养元素，具有极高的经济价值和药用价值，

石金钱龟多肽在食品工业、医药工业、日用化工和生物工程等许多方面有广泛的应用，最新研究表明石金钱龟多肽属于一种生物活性多肽，具有低毒性和抗氧化等特点，非常有利于作为面膜主要功能性原料的产品开发。

生物活性多肽是指对生物机体的生命活动具有一定的生理功能的氨基酸类聚合物，同时又可以称为生物肽，其分布的分子量范围很大，既可能是二肽，又可以是由几百个氨基酸通过肽键相连而成的大分子多肽。生物活性多肽具有良好的水溶及理化性质，以及低粘度，低发泡率和低凝胶性的特点，故具有较高的应用价值。

由于大规模的提取分离技术工业已经成熟，此后，市场上护肤品成分中慢慢能够找到的天然成份从陆地到海洋，从植物到动物，各种天然成份应有尽有。有些人甚至到人迹罕至的地方，试图寻找到特殊的原料，创造护肤的奇迹，包括热带雨林。当然此时的天然有很多是噱头，可能大部分底料还是沿用矿物油时代的成分，只是偶尔添加些天然成分，因为这里面的成分混合，防腐等仍然有很多难题不易攻克，因此，护肤效果差、毒性较高，伤害消费者的健康。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出石金钱龟多肽的制备方法以及石金钱龟多肽面膜。

本发明所采取的技术方案是，石金钱龟多肽的制备方法，包括如下步骤：取石金钱龟肉糜，按固液比为1：5～1：10的向所述石金钱龟肉糜中加入超纯水，得到肉糜水；在所述肉糜水中加入中性蛋白酶进行酶解，酶解过程中调节体系pH，酶解8h～12h后得到酶解液；对所述酶解液进行灭酶操作，得到石金钱龟多肽溶液；对所述石金钱龟多肽溶液进行离心后去除沉淀，保留滤液并进行冷冻干燥，得到石金钱龟多肽。

进一步地，超纯水的温度为40℃～50℃，超纯水的pH为7～8。

进一步地，酶解过程中使用NaOH调节反应体系的pH值。

进一步地，灭酶操作为：把酶解液放入85℃的环境下灭酶10min。

进一步地，灭酶操作为把酶解液放入85℃的环境下灭酶10min。

进一步地，对石金钱龟多肽溶液进行离心的操作中，离心的转速为8000r/min。

本发明还提供了石金钱龟多肽面膜，配方包括：石金钱龟多肽、去离子水、1,3-丁二醇、透明质酸钠、甘油聚醚-26、淡黑巨海藻提取物、羟乙基纤维素、甘油、聚山梨醇酯-80、甘草酸二钾、黄原胶、丙烯酸羟乙酯、羟苯甲酯。

进一步地，石金钱龟多肽是如上任一方式制备所得。

进一步地，配方按照质量比例，包括：0.05～0.2份的石金钱龟多肽、60-90份的去离子水、1-4份的1,3-丁二醇、0.1-0.3份的透明质酸钠、1-5份的甘油聚醚-26、0.5-2份的淡黑巨海藻提取物、0.05～0.2份的羟乙基纤维素、5～20份的甘油、0.05～0.2份的聚山梨醇酯-80、0.1～1份的甘草酸二钾、0.1～0.3份的黄原胶、0.05～0.2份的羟苯甲酯和2～5份的复合氨基酸。

本发明提取的石金钱龟多肽的平均分子质量范围为2000～3000，属于小分子生物活性多肽，具有抗氧化作用，可以抵抗活性氧(ROS)，可以保护细胞免受过多的活性氧的氧化损伤，将石金钱龟多肽应用于面膜中，可使面部皮肤吸收石金钱龟多肽的抗氧化成分，减少自由基的产生，护肤效果显著，产生的毒性低。

附图说明

图1是石金钱龟多肽体外抗氧化过氧化氢自由基清除能力PSC实验结果数据图；

图2是石金钱龟多肽体外抗氧化氧自由基吸收能力ORAC实验结果数据图；

图3是石金钱龟多肽对H2pG2细胞的毒性实验结果数据图；

图4是石金钱龟多肽采取用PBS清洗的体内抗CAA结果数据图；

图5是石金钱龟多肽不使用PBS清洗的体内抗CAA结果数据图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所采取的技术方案是，一种石金钱龟多肽的制备方法，包括如下步骤：取石金钱龟肉糜，按固液比为1：5～1：10的向石金钱龟肉糜中加入超纯水，得到肉糜水；在肉糜水中加入中性蛋白酶进行酶解，酶解过程中调节体系pH，酶解8h～12h后得到酶解液；对酶解液进行灭酶操作，得到石金钱龟多肽溶液；对石金钱龟多肽溶液进行离心后去除沉淀，保留滤液并进行冷冻干燥，得到石金钱龟多肽。

超纯水的温度为40℃～50℃，超纯水的pH为7～8。

酶解过程中使用NaOH调节反应体系的pH值。

灭酶操作为：把酶解液放入85℃的环境下灭酶10min。

对石金钱龟多肽溶液进行离心的操作中，离心的转速为8000r/min。

用此方式所提取的石金钱龟多肽，平均分子质量范围为2000～3000，具有抗氧化功能，可以抵抗活性氧(ROS)，活性氧(ROS)是生物有氧代谢过程中的一种副产品，包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等。这些粒子相当微小，由于存在未配对的自由电子，而十分活跃。过高的活性氧水平会对细胞和基因结构造成损坏。活性氧，为含氧的，具有化学活性的分子。包括氧离子(oxygen ion)及过氧化氢(peroxide)。因为核外的未配对电子的存在，具有很强的化学反应活性。ROS是正常氧代谢的副产物，并且在细胞信号传导以及保持机体恒常性起很大作用。然而，在时间以及外界环境影响下(例暴露于紫外线(UV exposure)或热源(heat exposure)下等)，ROS的量会急剧增多，引起这种改变的原因有可能是由于明显的细胞结构的损坏。这种现象被称为氧化应激。ROS也可能由外界的因素生成，如致电离辐射。抗氧化作用是抵抗集体氧化作用的过程。人体的抗氧化物质有自身合成的，也有由食物供给的。酶和非酶抗氧化物质在保护由于运动引起的过氧化损伤中起至关重要的作用。补充抗氧化物质有利于运动机体减少自由基的产生或加速其清除，以对抗自由基的副作用，因而对一般人的健康都有益，可能延缓运动性疲劳发生和衰老。氧化是肌肤衰老的最大威胁，日晒、压力、环境污染等都能让肌肤自由基泛滥，从而产生面色黯淡、缺水等氧化现象。抗氧化作用的护肤品可以防止皮肤松驰及皱纹产生，改善紫外线引起的皮肤色素沉淀，淡化老年斑及其它色素斑。我们每天都生活在氧气中，离不开氧气。但是吸入过多的氧气，接触过多的氧气，会使皮肤加速衰老，损坏身内的细胞组织。所以现在都在使用一些抗氧化的护肤品，蕴含丰富的保湿精华，重塑肌肤天然修复机能，解救日间受压的肌肤。

本发明还提供了一种石金钱龟多肽面膜，配方包括：石金钱龟多肽、去离子水、1,3-丁二醇、透明质酸钠、甘油聚醚-26、淡黑巨海藻提取物、羟乙基纤维素、甘油、聚山梨醇酯-80、甘草酸二钾、黄原胶、羟苯甲酯和复合氨基酸。本石金钱龟多肽面膜将石金钱龟多肽作为主要功能性原料，并将各成分按常规方法制成面膜。

具体配方按照其质量比例，为：0.05～0.2份的石金钱龟多肽、60-90份的去离子水、1-4份的1,3-丁二醇、0.1-0.3份的透明质酸钠、1-5份的甘油聚醚-26、0.5-2份的淡黑巨海藻提取物、0.05～0.2份的羟乙基纤维素、5～20份的甘油、0.05～0.2份的聚山梨醇酯-80、0.1～1份的甘草酸二钾、0.1～0.3份的黄原胶、0.05～0.2份的羟苯甲酯、2～5份的复合氨基酸。

1,3-丁二醇是多元醇的一种，在化妆品中常做保湿剂和溶剂使用，在保湿方面，由于丁二醇是小分子保湿成份，所以抓水比例很小，同时也有一定的抑菌作用。

透明质酸钠(SODIUM HYALURONATE)为从鸡冠中提取的物质，也可通过乳酸球菌发酵制得，为白色或类白色颗粒或粉末，无臭味，干燥时，氮含量为2.8％-4.0％，葡糖醛酸含量为37.0％-51.0％。在化妆品领域中使用较多，有保湿作用。

甘油聚醚-26是由甘油和环氧乙烷聚合而得，属于非离子表面活性剂-多元醇聚氧乙烯醚，作为化妆品的保湿剂、散播剂，属于国际上化妆品原料的一种。

淡黑巨海藻提取物，淡黑巨海藻是褐藻纲、海带目的藻类，淡黑巨海藻中含有美白、淡化黑头的成分。是国家食品药品监督管理总局11号文件发布的已使用化妆品原料。

羟乙基纤维素，羟乙基纤维素(HEC)是一种白色或淡黄色，无味、无毒的纤维状或粉末状固体，由碱性纤维素和环氧乙烷(或氯乙醇)经醚化反应制备，属非离子型可溶纤维素醚类。由于HEC具有良好的增稠、悬浮、分散、乳化、粘合、成膜、保护水分和提供保护胶体等特性，被广泛用于化妆品中。

聚山梨醇酯-80，为非离子型表面活性剂，药用辅料，增溶剂和乳化剂等。

甘草酸二钾，为白色或类白色细粉末，纯度达98％，有特殊甜味，水溶好、口感纯。甘草酸二钾具有抑菌、消炎、解毒、抗敏、除臭等多种功效。在医药、化妆品日化、食品等行业有广泛的应用。

黄原胶，是由糖类经黄单胞杆菌发醉，产生的胞外微生物多塘。由于它的大分子特殊结构和胶体特性，而具有多种功能，可作为乳化剂、稳定剂、凝胶增稠剂、浸润剂、膜成型剂等。

羟苯甲酯，又称对羟基苯甲酸甲酯。Methylparaben。羟苯甲酯，白色结晶粉末或无色结晶，易溶于醇，醚和丙酮，极微溶于水，沸点270-280℃。主要用作有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂。

复合氨基酸为：含甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等多种氨基酸混合，可根据需求调节各成分的比例或者删除其中的一种或者多种。

为了增加面膜的粘稠度，可适度增加丙烯酸羟乙酯，质量比例范围为0.01～6份；为了增加面膜的香气，可适量添加香精，质量比例范围为0.01～0.2份。

实施例1：

取10g石金钱龟肉糜，加入温度为40℃、pH为7的超纯水50ml，加入中性蛋白酶，在酶解过程中用NaOH调节反应体系的pH值，水解8h后，置于85℃的环境下灭酶10min，再使用8000r/min转速离心30min，再除去沉淀，冷冻干燥得到石金钱龟多肽。

实施例2

取10g石金钱龟肉糜，加入温度为50℃、pH为8的超纯水100ml，加入中性蛋白酶，在酶解过程中用NaOH调节反应体系的pH值，水解10h后，置于85℃环境下灭酶10min，使用8000r/min转速离心30min，除去沉淀，冷冻干燥得到石金钱龟多肽。

实施例3

取10g石金钱龟肉糜，加入温度为45℃、pH为7.5的超纯水80ml，加入中性蛋白酶，在酶解过程中用NaOH调节反应体系的pH值，水解9h后，置于85℃环境下灭酶10min，使用8000r/min转速离心30min，除去沉淀，冷冻干燥得到石金钱龟多肽。

实施例4

石金钱龟多肽的抗氧化效果研究。

将所得石金钱龟多肽用纯水配置为1mg/mL的水溶液，于-20℃保存备用。

将石金钱龟多肽稀释成不同浓度(起始浓度为1g/ml)。

将中石金钱龟多肽稀释成不同浓度(起始浓度为4.8mg/ml)，采用过氧化氢自由基清除能力PSC的方法测体外抗氧化能力。

石金钱龟多肽的过氧化氢自由基清除能力的测定方法是在Adom等提出的方案(Wang,H.；Cao,G.H.；Prior,R.L.,Oxygen radical absorbing 395 capacity of anthocyanins.Journal of Agricultural and Food Chemistry 1997,45,304-309.)的基础上做出了适当的改进。实验反应体系除说明外，均采用75mmol/L的KH₂PO₄-K₂HPO₄(pH＝7.4)的缓冲液。实验中所用的DCFH-DA、抗坏血酸、ABAP溶液均为现配现用。石金钱龟多肽样品用上述的磷酸缓冲液进行稀释后使用96孔板进行测定，每孔加入100μL石金钱龟多肽稀释液和100μL DCFH-DA后加入50μL 200mmol/L ABAP。DCFH-DA工作液在测定前配制，具体方法是1340μL 2.48mM DCFH-DA加入160μL 1mM KOH充分混合，并在暗处反应5min，然后用75mM的磷酸盐缓冲液定容到12mL。反应过程在预热至37℃的荧光酶标仪内进行，设定酶标仪激发波长在485nm处，吸收波长在538nm处，反应在40min内完成。

抗氧化能力计算方程如下：

PSC unit＝1-(SA/CA)

方程式中CA为空白对照的荧光积累量，SA是样品或是标准品的荧光积累量。以PSC值表示样品的抗氧化值，单位用每克样品干重等同于抗坏血酸当量的微摩尔数来表示(μmol vit.C equi./g,DW).

过氧化氢自由基清除能力PSC的方法测体外抗氧化能力的结果见图1。

由图1可以看出，石金钱龟多肽对于过氧化氢自由基清除能力有显著的作用。

实施例5

将石金钱龟多肽稀释成不同浓度(起始浓度为1000μg/mL)，采用氧自由基吸收能力ORAC测体外抗氧化能力。样品用修改后的ORAC法(Adom,K.K.；Liu,R.H.,Rapid peroxyl radical scavenging capacity(PSC)assay for assessing both hydrophilic and lipophilic antioxidants.Journal of agricultural and food chemistry 2005,53,6572-80)进行测定。反应体系采用75mmol/L的KH2PO4-K2HPO4(pH＝7.4)的缓冲液，实验所用到的标准品Trolox，ABAP以及fluorescein(荧光素底物)均为现配现用。样品提前用缓冲液配制到适当的浓度，相应的每个孔中加入20μL样品或是Trolox标准品(浓度梯度在6.25-50μM之间)，在荧光酶标仪中37℃孵育10min后，各孔使用多轨道移液器加入200μL、0.96μM的荧光素，在相同条件下孵育20min后，除荧光对照孔外，各孔迅速加入119mM的ABAP 20μL,并在荧光酶标仪中监测反应。酶标仪设定参数为：37℃；激发波长485nm，测定波长520nm；每5min记录一次，共计35次。所用样品共进行三次平行试验。ORAC值以每克样品(干重)所含的Trolox当量的微摩尔数表示(μmol Trolox equiv./g,DW)，石金钱龟多肽体外抗氧化氧自由基吸收ORAC的结果测试如图2所示。

由图2可以看出，Control是石金钱龟多肽体外抗氧化氧自由基吸收能力ORAC的结果，图中表明，石金钱龟多肽对于体外抗氧化氧自由基吸收能力好，持续时间长。

实施例6

采用亚甲基蓝染色的方法(Yang,J.；Liu,R.H.,Synergistic Effect of Apple Extracts and Quercetin 3-beta-D-Glucoside Combination on Antiproliferative Activity in MCF-7 Human Breast Cancer Cells in Vitro.Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009,57,8581-8586.)进行检测石金钱龟多肽的毒性。取对数生长期的HepG2细胞以4×104的密度铺96孔板，每孔10 0μL，待贴壁24h后，取稀释好的一系列浓度的石金钱龟多肽对应加到每个孔中，待药物处理24h后，按照文献的方法，每孔加入亚甲基蓝50μL孵育1h后，用水洗净后，加入Elution solution溶解后，使用酶标仪检测570nm波长下的吸收值，检测石金钱龟多肽的毒性。石金钱龟多肽对HepG2细胞的毒性结果如图3所示。

由图3可以看出，1mg/ml浓度以下的石金钱龟多肽对HepG2细胞并无毒性，超过1mg/ml以上的高浓度则对HepG2细胞有毒性作用。

实施例7

石金钱龟多肽体内抗氧化CAA研究

采用Wolfe等的方法(Wolfe,K.L.；Liu,R.H.,Cellular antioxidant activity(CAA)assay for assessing antioxidants,foods,and dietary supplements.Journal of agricultural and food chemistry 2007,55,8896-907.)进行吸收水平抗氧化效果的检测。取对数生长期的HepG2细胞以4×104的密度铺96孔板，每孔100μL，待贴壁24h后，取含DCFH-DA染料的稀释好的一系列浓度的石金钱龟多肽对应加到每个孔中，放置在37℃培养箱中孵育1h后，去除培养基，根据实验方法采取用PBS清洗和不用PBS清洗后，每孔并迅速加入100μL 600mM ABAP，除空白孔，并在荧光酶标仪中监测反应。酶标仪设定参数为：37℃；激发波长485nm，测定波长520nm；每5min记录一次，共计1h。按照以下公式进行计算细胞水平抗氧化效果。

CAA unit＝100-(∫SA/∫CA)×100

∫SA代表样品对应的荧光值，∫CA代表空白组对应的荧光值。

实验结果如图4和图5所示，图4为使用了PBS清洗的结果，图5为不使用PBS清洗的结果。

由图4和图5可以看出，石金钱龟多肽体内抗氧化CAA具有一定的效果，且经过PBS清洗的效果比不经过PBS清洗的效果好。

实施例8

石金钱龟多肽面膜，按其质量比例，其配方为：0.05份的石金钱龟多肽、1份的1,3-丁二醇、0.1份的透明质酸钠、1份的甘油聚醚-26、0.5的淡黑巨海藻提取物、0.05的羟乙基纤维素、5份的甘油、0.05份的聚山梨醇酯-80、0.1份的甘草酸二钾、0.1份的黄原胶、0.05份的羟苯甲酯、2份的复合氨基酸、1份丙烯酸羟乙酯的和90份的去离子水。

实施例9

石金钱龟多肽面膜，按其质量比例，其配方为：0.2份的石金钱龟多肽、4份的1,3-丁二醇、0.3份的透明质酸钠、5份的甘油聚醚-26、2份的淡黑巨海藻提取物、0.2份的羟乙基纤维素、20份的甘油、0.2份的聚山梨醇酯-80、1份的甘草酸二钾、0.3份的黄原胶、0.2份的羟苯甲酯、5份的复合氨基酸、0.1份的香精、1.5份丙烯酸羟乙酯的60份的去离子水。

实施例10

石金钱龟多肽面膜，按其质量比例，其配方为：0.1份的石金钱龟多肽、60-90份的去离子水、3份的1,3-丁二醇、0.2份的透明质酸钠、3份的甘油聚醚-26、1份的淡黑巨海藻提取物、0.1份的羟乙基纤维素、10份的甘油、0.1份的聚山梨醇酯-80、0.5份的甘草酸二钾、0.2份的黄原胶、0.1份的羟苯甲酯、4份的复合氨基酸、0.2份的香精和77.5份的去离子水。