一种一步酶解制备鱼皮抗冻肽的工艺的制作方法

本发明属于水产加工技术领域，具体涉及一种一步酶解制备鱼皮抗冻肽的工艺。

背景技术：

马鲛鱼（Scomberomorus niphonius）属鲈形目、鲅科、鲅属，体长而侧扁，鳞甚细小，外形酷似鲐鱼。其广泛分布于我国黄海、渤海、东海、南海及台湾海峡，以黄、渤海产量最高。渔业资源相当丰富，为我国重要的海洋经济鱼类之一。且其皮中富含胶原蛋白，为酶解制备抗冻肽提供了良好的原料。

抗冻剂是一类在加入到其他溶液中后，可降低溶液冰点，进而提高抗冻效果的物质。传统使用的商业抗冻剂为4%蔗糖和4%山梨糖醇的混合物，这种抗冻剂虽然具有一定的抗冻效果，但是由于其甜度与热量较高，不符合“低甜”和“低热”的消费趋势。抗冻肽是一类能够吸附在冰晶表面，抑制冰晶的生长和重结晶的活性肽。它可以降低溶液的冰点，而对熔点影响甚微，使得冰点与熔点之间产生差值，这称为热滞活性。通过热滞活性，抗冻肽可以保护生物在低温下免受冻害。相比商业抗冻剂，抗冻肽不仅更符合消费趋势，且其抗冻效果优于商业抗冻剂。但当下天然抗冻剂的生产工艺较为复杂且活性低，耗时耗资，而本专利的一步酶解技术制备抗冻肽能够很好解决生产中的此类问题。目前国内外制备抗冻肽的方法，包括传统的研磨加搅拌的方法，以及近年来的渗透-离心法和先制明胶，再酶解制备抗冻肽的方法。如有的专利利用酸性蛋白酶水解鱼皮胶原蛋白制备的抗冻多肽，以鱼皮胶原蛋白为原料，通过酸性蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性抗冻多肽；有的专利以鲨鱼皮胶原蛋白为原料，通过对酸性蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性抗氧化多肽。一步酶解技术为直接以鱼皮为原料，通过搅碎、匀浆、调节体系pH后直接酶解，经双效浓缩和冷冻干燥后获得具良好抗冻活性的抗冻肽粉末。方法步骤简单，能很好减少制备抗冻肽步骤，降低抗冻肽的制备成本，且得到的抗冻肽活性和纯度较高。

在工艺流程中，酶解可将大分子蛋白分解成小分子多肽，通过控制酶解的条件，能够得到较为理想的多肽溶液。膜过滤采用膜为过滤的介质，在一定压力下，小分子溶质和溶液会透过膜，而相对较大的溶质分子则会被截留下来。通过膜过滤，可滤去较多的杂质，得到相对纯的抗冻肽溶液。双效真空浓缩为在真空条件下，采用二效同时蒸发，能有效利用二次蒸汽，节约能耗。其蒸发速度快，无污染，浓缩效果好，在提高浓缩抗冻肽溶液效率的同时，又节约成本。冷冻干燥能够在低温、真空的环境中将冰升华而除去，可很好保持抗冻肽溶液原有的物理和化学性质，而冻干制成的粉末也便于利用。在制备抗冻肽中，相比有的专利采用超声波处理、使用风味蛋白酶酶解后超滤冻干，再和乳糖混合进行糖基化反应的方法获得抗冻肽；有的将超声波处理后的鱼皮浆液经复合蛋白酶酶解，再经浓缩冻干获得抗冻肽，本专利采用碱性蛋白酶酶解鱼皮，同时采用双效浓缩后冻干的方法获得抗冻肽的方法，能够在较短时间内制得活性和纯度相对较高的抗冻肽，大大提高了制备高活性抗冻肽的效率。

目前抗冻肽的应用相对较少，其中制备环节十分关键，而一步酶解技术制备抗冻肽，耗时耗资少，可为抗冻肽的制备提供一种新的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种一步酶解制备鱼皮抗冻肽的工艺。本发明的工艺提供了一种低成本、简便快捷、抗冻肽得率高的鱼皮抗冻肽的制备方法，所制得的鱼皮抗冻肽添加到鱼糜制品中，解决了鱼糜制品在冻藏、运输和销售过程中反复冻融导致冻裂、析水等关键共性技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种一步酶解制备鱼皮抗冻肽的工艺，包括选料、清洗、匀浆、酶解、膜过滤、双效真空浓缩和冻干步骤；具体步骤如下：

（1）选料：选择马鲛鱼的鱼皮作为抗冻肽提取原料；

（2）清洗：将所取的马鲛鱼皮内外用水清洗，控制水温为4~10℃，去除鱼皮内侧黏附的多余杂物；

（3）匀浆：将鱼皮与水按W/V为1:5混合，置入打浆机匀浆；

（4）酶解：采用碱性蛋白酶对步骤（3）得到的鱼皮匀浆液进行酶解，控制酶与底物比为1:15~1:30，酶解pH 8~9，酶解温度40~50℃，酶解时间90~120min，酶解后得到抗冻肽粗溶液；

（5）膜过滤：将步骤（4）得到的抗冻肽粗溶液离心后取上清液，随后选用截留分子量分别为20kDa、10kDa和5kDa的超滤膜对上清液进行三次超滤，得到抗冻肽溶液；

（6）双效真空浓缩：将步骤（5）得到的抗冻肽溶液置入双效真空浓缩器进行浓缩，除去溶液内过多的水分；

（7）冻干：将步骤（6）浓缩后的抗冻肽溶液放入冷冻干燥机冷冻干燥，得到抗冻肽粉末，在低于30℃的室温下进行保藏。

步骤（5）中三次超滤的条件为：压力0.10MPa，温度4℃。

步骤（5）中，经三次超滤后所得到的抗冻肽溶液的分子量为1426~1810Da。

步骤（6）中所述双效真空浓缩器进行浓缩的工艺参数为：一效浓缩真空度0.02~0.06Mpa、抗冻肽溶液温度72~78℃；二效浓缩真空度0.08Mpa、抗冻肽溶液温度60℃。

步骤（7）中所述冷冻干燥时间为20~24h。

本发明的显著优点为：

（1）本发明因采用一步酶解技术，因此涉及的操作步骤少，耗材耗资相对较低，对设备仪器要求也较低；

（2）一步酶解技术减少了获得抗冻肽的中间步骤，减少了中间步骤造成的抗冻肽的损失，抗冻肽得率较高，具抗冻活性的抗冻肽分子量区间为426~1810Da之间；

（3）通过控制酶解过程，获得了热滞活性较高的的抗冻肽，其热滞活性显著高于猪皮和鸡皮。

附图说明

图1为抗冻肽与牛血清蛋白（BSA）的升降温曲线；

图2为鱼皮抗冻肽的DSC热流曲线图；

具体实施方式

以下是本发明的几个具体实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此实施。

实施例1

（1）选料：选择沿海附近产量较多的马鲛鱼的鱼皮作为抗冻肽提取原料；

（2）清洗：将所取的马鲛鱼皮内外用水清洗，控制水温为4℃，去除鱼皮内侧黏附的多余杂物；

（3）匀浆：将鱼皮与水按W/V为1:5混合，置入打浆机匀浆；

（4）酶解：采用碱性蛋白酶对鱼皮匀浆液酶解，控制酶与底物比为1:15，酶解pH 8，酶解温度40℃，酶解时间90min，酶解后得到抗冻肽粗溶液；

（5）膜过滤：将抗冻肽粗溶液离心后取上清液，在压力0.10MPa、4℃条件下选用截留分子量分别为20kDa、10kDa和5kDa的超滤膜对上清液进行三次超滤，得分子量为1426Da的抗冻肽溶液；

（6）双效真空浓缩：膜过滤后的抗冻肽溶液置入双效真空浓缩器进行浓缩，一效浓缩真空度0.02Mpa、抗冻肽溶液温度78℃；二效浓缩真空度0.08Mpa、抗冻肽溶液温度60℃，除去溶液内过多的水分；

（7）冻干：浓缩后的抗冻肽溶液放入冷冻干燥机冷冻干燥20h，得到抗冻肽粉末，在低于30℃的室温下进行保藏。

实施例2

（1）选料：选择沿海附近产量较多的马鲛鱼的鱼皮作为抗冻肽提取原料；

（2）清洗：将所取的马鲛鱼皮内外用水清洗，控制水温为7℃，去除鱼皮内侧黏附的多余杂物；

（3）匀浆：将鱼皮与水按W/V为1:5混合，置入打浆机匀浆；

（4）酶解：采用碱性蛋白酶对鱼皮匀浆液酶解，控制酶与底物比为1:20，酶解pH 8.5，酶解温度45℃，酶解时间100min，酶解后得到抗冻肽粗溶液；

（5）膜过滤：将抗冻肽粗溶液离心后取上清液，在压力0.10MPa、4℃条件下选用截留分子量分别为20kDa、10kDa和5kDa的超滤膜对上清液进行三次超滤，得分子量为1650Da的抗冻肽溶液；

（6）双效真空浓缩：膜过滤后的抗冻肽溶液置入双效真空浓缩器进行浓缩，一效浓缩真空度0.04Mpa、抗冻肽溶液温度75℃；二效浓缩真空度0.08Mpa、抗冻肽溶液温度60℃，除去溶液内过多的水分；

（7）冻干：浓缩后的抗冻肽溶液放入冷冻干燥机冷冻干燥22h，得到抗冻肽粉末，在低于30℃的室温下进行保藏。

实施例3

（1）选料：选择沿海附近产量较多的马鲛鱼的鱼皮作为抗冻肽提取原料；

（2）清洗：将所取的马鲛鱼皮内外用水清洗，控制水温为10℃，去除鱼皮内侧黏附的多余杂物；

（3）匀浆：将鱼皮与水按W/V为1:5混合，置入打浆机匀浆；

（4）酶解：采用碱性蛋白酶对鱼皮匀浆液酶解，控制酶与底物比为1:30，酶解pH 9，酶解温度50℃，酶解时间120min，酶解后得到抗冻肽粗溶液；

（5）膜过滤：将抗冻肽粗溶液离心后取上清液，在压力0.10MPa、4℃条件下选用截留分子量分别为20kDa、10kDa和5kDa的超滤膜对上清液进行三次超滤，得分子量为1810Da的抗冻肽溶液；

（6）双效真空浓缩：膜过滤后的抗冻肽溶液置入双效真空浓缩器进行浓缩，一效浓缩真空度0.06Mpa、抗冻肽溶液温度72℃；二效浓缩真空度0.08Mpa、抗冻肽溶液温度60℃，除去溶液内过多的水分；

（7）冻干：浓缩后的抗冻肽溶液放入冷冻干燥机冷冻干燥24h，得到抗冻肽粉末，在低于30℃的室温下进行保藏。

性能测试

一、 鱼皮抗冻肽热滞活性分析

采用DSC测定马鲛鱼鱼皮抗冻肽的熔融点及结晶点，以牛血清蛋白（BSA）为空白对照，结果如图1所示。BSA起始熔化温度为-1.5℃，并在12.2℃完全熔化；马鲛鱼鱼皮抗冻肽-1.4 ℃开始熔化，并在12.4℃完全熔化。空白和实验组的熔点十分接近。BSA在-14.0℃开始结晶，在-18.3℃时完全结晶，其结晶峰为4.3℃；而鱼皮抗冻肽溶液在-18.6℃开始结晶，在-24.2℃时完全结晶，相比BSA鱼皮溶液的结晶峰更宽，为5.6℃。与空白相比，马鲛鱼鱼皮抗冻肽不仅有更低的冰点，完全冻结的时间也更长。

鱼皮抗冻肽热滞活性的DSC热流曲线如图2所示，从图中可以看出，其保留温度最佳为-0.1℃，在此保留温度下其起始结晶温度为-1.8℃，由公式1计算可得热滞活性为1.7℃。

公式1如下：

二、鱼皮抗冻肽氨基酸组成测定

本发明制得的鱼皮抗冻肽的氨基酸组成如表1所示。

表1 鱼皮抗冻肽的氨基酸组成

从上表可知，甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸三者含量较其他氨基酸更高，三者之和约占总氨基酸的50%。而马鲛鱼鱼皮抗冻肽中甘氨酸含量最丰富，达29.89%；其次为丙氨酸的 13.47%以及脯氨酸的9.64%。没有检测出胱氨酸，缺乏色氨酸。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。