本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种通过流加混合氮源提高腺苷产量的方法。
背景方法
腺嘌呤核苷(Adenosine)，也称为腺苷，商品名为AR，化学名称为9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤(9-β-D-ribofuranosyl adenine)，分子式为C10H13N5O4、分子量为267.24。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷还对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用，是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，在医药市场上具有广阔的开发前景。腺苷的主要生产方法有化学合成法、酶法和发酵法等。前两种方法由于成本高，污染大，大规模应用受到一定程度的限制。而发酵法自1968年，日本小西真八等人开始，经历很多研究学者的努力，如今已进入大规模工业化生产阶段。国内腺苷发酵起步稍晚，与国外相比，仍然存在产量较低等问题。随着发酵过程的进行，发酵培养基中氮源浓度降低，尤其是核苷类氮源和氨基酸类氮源，菌种缺乏合成产物的必要物质，代谢流发生改变。
技术实现要素：
本发明目的在于解决发酵法生产腺苷转化率较低的问题，提供一种通过流加混合氮源提高腺苷产量和转化率的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种通过流加混合氮源提高腺苷产量的方法，包括菌种斜面培养、种子培养和发酵培养的过程，所述的发酵培养包括菌体吸光度OD值达到0.5～0.6时(650nm，稀释50倍)，开始匀速流加酵母膏和玉米浆粉混合氮源的过程，两种氮源以1:(2±0.5)的重量比例混合。该方法通过在发酵中后期匀速补入氮源，为菌体生长和发酵产苷提供了营养物质，保持了发酵中后期的活力和稳定性，增加了发酵产量，最终提高了糖苷转化率。
进一步:在上述通过流加混合氮源提高腺苷产量的方法中，所述的菌种斜面培养是指将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)SL03接种至活化斜面，28～32℃，培养20～28h。
所述的种子培养包括一级种子培养和二级种子培养；所述的一级种子培养是指用接种环取一环斜面菌种，接种至种子培养基，28～32℃，培养8～12h，作为一级种子液。
所述的二级种子培养是指将一级种子液按体积百分比以0.05％的接种量接入二级种子培养基，培养6～7h，得二级种子液。
所述发酵培养是指将二级种子液按体积百分比10～15％的移种量移种至装有灭菌发酵培养基的发酵罐中，发酵温度为36～37℃，发酵过程通过流加氨水维持pH6.6～6.8，溶氧维持在30％以上，培养时间36～42h。
再进一步：在上述通过流加混合氮源提高腺苷产量的方法中，所述种子培养用的斜面培养基成分以g/L计：葡萄糖2～3，蛋白胨8～10，牛肉膏8～10，酵母粉3～5，NaCl 1.5～2.5，琼脂20～30，pH 7.0～7.2；
所述一级种子培养基成分以g/L计：葡萄糖20～30，酵母粉5～8，KH2PO4 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.5～0.8，鸟嘌呤0.01～0.015，味精3～8，尿素1～2，玉米浆10～20mL/L，pH 7.0～7.2；
所述二级种子培养基成分以g/L计：葡萄糖20～30，KH2PO4 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.5～0.8，鸟嘌呤0.002～0.005，玉米浆10～20mL/L，pH 6.6～6.8；
所述发酵培养基成分以g/L计：葡萄糖130～150，酵母粉20～30，K2HPO4 2～3，(NH4)2SO4 10～15，MgSO4·7H2O 1～2，0.01～0.015，MnSO4 0.003～0.006，玉米浆干粉10～15。
与现有技术相比，本发明以枯草芽胞杆菌为发酵菌株，对原材料配比和过程补料进一步优化，在50L发酵罐上分批流加混合氮源，提供了菌体代谢所需要的氮源物质，同时使得中后期菌种活力提高。本发明的优点和有益效果在于：通过在发酵中后期流加酵母膏、玉米浆混合氮源，提供了菌体所需要的氮源物质，提高了中后期菌种活力和菌体次级代谢的强度，使得腺苷产量提高至37g/L，转化率提高至24％。发酵周期缩短至38h左右。
具体实施方式
以下各实施例中发酵产物腺苷含量所采用的分析方法如下：发酵液中腺苷含量采用纸层析法分离测定。发酵液经离心机离心4000rpm，15min，所得上清液用纸层析分离后在260nm处测紫外吸收值(A260)。所述纸层析的层析液配比为，硫酸铵：氨水：水等于(1～1.5):2～(3:7～8)。所述硫酸铵浓度≥99％，氨水的浓度为28％～29％。精确称取腺苷的标准品，用去离子水配置成质量浓度为1g/L的标准品溶液；将待测发酵上清液样品用去离子水稀释至适当的浓度，同标准品一起进行纸层析检测。
实施例1
斜面培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖2.5，蛋白胨8，牛肉膏8，酵母粉4，NaCl 2，琼脂25，pH 7.0～7.2；。
一级种子培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖2.5，酵母粉5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.8，鸟嘌呤0.03，味精3，尿素1，pH 7.0～7.2；
二级种子培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖30，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.8，鸟嘌呤0.003，玉米浆20mL/L，pH 6.6～6.8；
发酵培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖145，酵母粉20，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 2，鸟嘌呤0.015，MnSO4 0.005，玉米浆干粉12。
以枯草芽胞杆菌为出发菌株，接种至斜面进行活化，32℃培养24h，用接种环刮取斜面菌种接种至一级种子培养基，31.5℃，200rpm培养11h；按0.05％的接种量接至30L罐二级种子培养基31.5℃，PH 6.6～6.7，培养7.5h，以10％的接种量移入50L发酵罐中，36℃，溶氧维持在30％以上，发酵过程通过流加氨水维持pH6.6，发酵至OD 0.6时，开始匀速流加15g/L混合氮源溶液，其中酵母膏5g/L,玉米浆干粉10g/L，维持到发酵结束，发酵40h，腺苷产量达到37g/L，转化率达到24％。
实施例2
斜面培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖2.5，蛋白胨8，牛肉膏8，酵母粉4，NaCl 2，琼脂25，pH 7.0～7.2；。
一级种子培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖2.5，酵母粉5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.8，鸟嘌呤0.03，味精3，尿素1，pH 7.0～7.2；
二级种子培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖30，KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.8，鸟嘌呤0.003，玉米浆20mL/L，pH 6.6～6.8；
发酵培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖145，酵母粉20，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 2，鸟嘌呤0.015，MnSO4 0.005，玉米浆干粉12。
以枯草芽胞杆菌为出发菌株，接种至斜面进行活化，32℃培养24h，用接种环刮取斜面菌种接种至一级种子培养基，31.5℃，200rpm培养11h；按0.05％的接种量接至30L罐二级种子培养基31.5℃，PH 6.6～6.7，培养7.5h，以10％的接种量移入50L发酵罐中，36℃，溶氧维持在30％以上，发酵过程通过流加氨水维持pH6.6，发酵至OD 0.6时，开始匀速流加15g/L混合氮源溶液，其中酵母膏10g/L,玉米浆干粉5g/L，维持到发酵结束，发酵40h，产苷34.1g/L，糖酸转化率24％。
由实施例1和实施例2可看出：流加氮源比例的不同，影响菌种生成次级代谢产物的能力，影响产量和转化率。酵母类物质主要为速效氮源，为腺苷菌种提供大量核苷类物质，玉米浆粉为迟效氮源，为菌种提供大量氨基酸类物质和微量元素。发酵中后期主要是菌种生成次级代谢产物的时期，此时期玉米浆粉等迟效氮源发挥的作用最大，能更好地促进菌种生产出腺苷，因此实施例当中流加的氮源玉米浆粉比例较高时，其菌种的活力较强，产量较大，转化率较高。