用于生产核黄素的方法

专利名称：用于生产核黄素的方法
用于生产核黄素的方法本发明涉及生物技术发酵生产核黄素(下文中也称作维生素B2)的方法和手段， 和实施所述方法的手段，特别是具有提高的核黄素产率的经修饰的微生物宿主细胞。本发明因此提供了调节参与宿主细胞核黄素生产的酶活性的表达的新颖方法和手段。核黄素是黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体分子。它们是生物细胞和生物体中大量酶促氧化还原反应的必需辅助因子。因此，核黄素是食物和动物饲料工业中重要的添加剂。在微生物和植物中，核黄素通常从三磷酸鸟苷(GTP)(来自嘌呤代谢)和5-磷酸核酮糖(来自磷酸戊糖途径)通过七个酶促反应合成。每年约有4000吨核黄素在多种微生物中被以生物技术方式生产。最重要的宿主生物是杆菌(bacilli)，特别是Bacillus subtilis。除此之外也使用其他微生物细胞，包括 {1 , ^° 歹lliiL Eremothecium ashbyii>Ashbya gossypii 禾口 Candida f已mata。用于核黄素合成的已知生物技术方法需要改进，最重要的是改进核黄素的产率和生产。因此需要提供经改进的生产方法和经改进的宿主细胞，特别是以微生物Bacillus subtilis为基础来改进。这特别涉及下述手段的提供，所述手段使得能够特别简单和有效地控制宿主细胞中的代谢活性，特别是与核黄素合成相关的酶活性。另外，这涉及提供经修饰的宿主细胞，所述经修饰的宿主细胞特别是与野生型相比具有提高的核黄素合成。本发明人惊讶地发现，转录因子CcpC对核黄素生产率(production rate)具有积极影响。CcpC属于LysR转录因子家族，已知其能调节编码三羧酸循环(TCA)酶活性的基因，最重要的是citB和citZ。惊讶地发现核黄素产率直接依赖于转录因子CcpC的活性和 /或细胞内浓度。降低的CcpC活性导致产率的提高。该效应是令人惊讶的，并且从现有技术不可预测，因为已知受CcpC调节的TCA中的酶活性与核黄素合成的代谢途径并无直接关联。还令人惊讶的是生物量生产，特别是根据本发明被修饰的细胞(特别是CcpC-缺失的细胞，例如的ccpC敲除转化体)的生长率保持基本不变。本发明因此涉及经修饰的生产核黄素的细胞或细胞系，原核细胞或真核细胞，特别是微生物细胞，其特征在于CcpC型转录因子和/或在细胞中存在和/或表达的其同系物或直系同源物的活性或浓度被修饰，特别是被降低。通过所述修饰，细胞或细胞壁能够进行提高的核黄素生产。特别地，要求保护下述经修饰的生产核黄素的微生物，其中与未经修饰的微生物或野生型微生物相比，CcpC型转录因子的表达和/或活性被降低，优选地降低至少25%。优选地，上述细胞或细胞系被修饰，使得编码CcpC的基因完全不表达(表达的阻抑)或至少显示降低的表达(低表达(underexpression))，这导致所述细胞/细胞系中缺失或减少/降低的CcpC蛋白质活性。细胞/细胞系优选地是CcpC缺失的(CcpC-cbpleted) 突变体或转化体，特别是编码CcpC的至少一个基因和/或其同系物和/或直系同源物的敲除突变体。在该关联中，“降低的”被理解为表示在作为转录因子的功能方面，CcpC蛋白质或其同系物或直系同源物的减少的、特别是缺失的活性，以及ccpC基因或其同系物或直系同源物的减少的、特别是缺失的表达，结果，这使得细胞(特别是CcpC缺失的细胞)中基因产物CcpC拷贝数低或浓度低。降低的表达被理解为表示以未经修饰的(CcpC野生型)细胞 /细胞系中ccpC基因的表达为基础至少25 %的减少，优选地至少50 %、75 %、80 %、90 %、 95%、98%或100%的减少。所述降低既涉及基因活性又涉及相应的基因产物。因此，在根据本发明的细胞或根据本发明被修饰的细胞中，最重要地，当所述基因例如在杆菌中、优选地在生物Bacillus subtilis中表达时，ccpC基因和/或其基因产物被阻抑、“敲除”或其功能(活性)受损，特别是与CcpC野生型相比。用于测量基因或蛋白质活性的多种方法是本领域技术人员已知的。合适的方法例如是Northern印迹，或用于测量ccpC基因活性的用途的“基因芯片，，方法，和借助于针对 CcpC的特异性抗体的Western印迹，或用于测定细胞中蛋白质浓度的定量“2_D SDS-PAGE 凝胶”。转录因子(特别是CcpC)的活性也可以通过“凝胶迁移(gel shift)”实验来间接测定，其中测量在要被调节的基因(例如CitB或citZ)的相应结合位点处结合的CcpC的量。通过减少ccpC的基因表达，结合的CcpC量也会降低，这可通过聚丙烯酰胺凝胶上信号的定量测量来分析。这些测量方法和其他测量方法是本领域技术人员已知的，并且可用于测定本发明意义上的CcpC活性。用于实施本发明的合适细胞或细胞系(概括为宿主细胞)是所有已知的下述生产核黄素的细胞，其中ccpC基因或其同系物或直系同源物的表达可以被降低。例子是原核细胞或真核细胞，优选地是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，特别是微生物细胞例如 Bacillus、Corynebacterium 或 Pseudomonas0 优选的是 BaciIlus 属的细胞，例如 Bacillus anthracis> Bacillus cereus、Bacillus stearothermophilus> Bacillus halodurans> Bacillus amyloliquifaciens 或 Bacillus subtilis,Bacillus subtilis 是特别优选的， 例如 B. subtilis 168。适用于本发明的一种特别优选的宿主细胞是B. subtilis RB50::[pRF69]n，其包含多个拷贝(例如约5到约20个拷贝)的质粒pRF69，所述质粒pRF69编码经修饰的核黄素(rib)操纵子，其中修饰在于强启动子Psp。15的插入，这导致核黄素基因转录的强化(菌株的构建和用于提高核黄素合成的培养条件见例如EP 405370和Perkins et al.，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，22 :8-18,1999)。B. subtilis RB50 和质粒 pRF69 根据布达佩斯条约的规定，分别以编号(“保藏号”)B 18502保藏在“Agricultural Research Culture Collection”(NRRL)，Peoria, IL, USA, Culture Collection Division 和以编号(“保藏号，，)ATCC 68338 保藏于“American Type Culture Collection”(ATCC)，P. 0. Box 1549， Manassas, VA 20108 USA。在本发明的一个优选的方面，在Bacillus属的菌株(特别是Bacillus subtilis) 中实现ccpC基因中的修饰。本文特别优选的是核黄素操纵子中脱调节的作为宿主细胞的 Bacillus菌株，特别是subtilis菌株。脱调节的核黄素操纵子的例子是已知的，并且包括所谓的“ribO”和“ribC”突变。脱调节引起rib基因的强化的基因表达。特别优选的是下述宿主细胞，特别是Bacillus subtilis，其中编码转录调节子SpoOA的基因被(过)表达。 因此在一个最优选的实施方案中，本发明在下述B. subtilis RB50中实现，所述B. subtilis RB50被突变，使得spoOA基因的活性形式被表达。公众可通过例如以下的保藏位点获得适用于本发明的其他微生物=GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) , Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Brunswick,德国，“NITE Biological Resource Center，，,2-5-8,Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, H ^ ( III ^ {^"Institute for Fermentation", Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686,日本)或 "Bacillus Genetic Stock Center，，(BGSC),The Ohio State University,Columbus,Ohio 43210 USA。就本发明而言，前述微生物还包括International Code of Nomenclature of Prokaryotes”规定的具有相同生理特性的同物异名(synonyms)和基原异名 (basonyms)。本发明中微生物的命名法是在优先权申请时被“International Committee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Union of Microbiological Societies，，官方接 S ^f1 1 I=T Tj Jf Τ" “ International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology”(IJSEM)中的命名法。本发明涉及经突变的、特别是非功能性的基因。本发明涉及来自所述基因的经突变的、特别是非功能性的转录本。本发明还涉及来自所述基因的经突变的、特别是非功能性的多肽。此类经突变的结构在本发明的意义上特别合适用于提供经遗传修饰的宿主细胞， 其中CcpC野生型或其同系物或直系同源物的功能被降低或抑制。因此，根据本发明的教导的一个要素是降低细胞中ccpC基因、CcpC转录本或所翻译的转录因子的有效(有活性)浓度，从而提高宿主细胞中的核黄素生物合成。CcpC或其同系物或直系同源物的活性和/或细胞内浓度的降低可以通过本身已知的方式实现。本领域技术人员已知适用于获得所谓的CcpC缺失或ccpC敲除突变体或转化体的生物技术方法和手段。本发明因此不限于本文中更详细描述的优选的变体和实施方案。根据本发明，术语“突变”被理解为表示核酸分子的任何遗传修饰，特别是在分子水平上的修饰，所述修饰导致非功能性的“经突变的”基因产物。其特别被理解为表示微生物基因组中的改变，所述改变干扰基因产物的合成，在本文中感染CcpC型转录因子的合成和/或导致“经突变的”或经修饰的多肽的表达，所述多肽具有被改变的“经突变的”氨基酸序列并且与CcpC野生型相比其功能已部分或完全丧失。基因或基因产物中根据本发明的突变在选自转录、翻译和(如果适用的话)翻译后修饰的表达中的至少一个步骤中导致改变。所述突变优选地选自基因序列中至少一个核苷酸的点突变、缺失、取代、插入和倒位。 然而，遗传突变的手段不限于这些优选的实施方案。本领域技术人员已知用于在基因中放置突变的其他可能性。根据本发明的突变的目的是阻抑编码CcpC的至少一个基因的表达。 与之相关的一个目的是与野生型相比展示减小的活性、特别是调节活性的经修饰的转录因子在细胞中的表达。“突变”不仅涉及基因编码序列的直接修饰，而且涉及与表达相关的其他结构或序列的修饰。这些优选地包括基因操纵子的结构，特别是调节结构，优选地选自启动子、调节子、操纵基因(operators)、转录因子结合位点、终止子及其辅因子，不希望仅限于这些。就本发明而言，“功能”，特别是就术语“功能有关的”、“功能类似的”和“功能化”而言，被理解为表示CcpC野生型或其同系物或直系同源物用于调节操纵子或基因表达的转录因子功能，所述操纵子或基因具有与转录因子结合的操纵基因结构。蛋白质(特别是转录因子例如CcpC)的功能根据本发明也表述为活性，其中CcpC野生型的转录因子功能对应于100%的转录因子活性。用于测定活性的已知合适方法的选择如上文所述。本发明的一个主题是经分离的核酸分子，其表示ccpC基因及其同系物和直系同源物。本发明特别涉及核苷酸序列SEQ ID No. :1中所示并且例如存在于生物Bacillus subtilis中的该基因。本发明还涉及其基因产物(CcpC蛋白质)，例如由氨基酸序列SEQ ID No. :2所示。基因ccpC特别是上述合适的宿主细胞之一、优选地Bacillus subtilis中操纵子的部分。寻找同源/直系同源CcpC序列的方法是本领域技术人员已知的，例如在合适的数据库如例如EMBL、Genbank、SwissProt等中进行“BLAST”搜索。这些序列发挥CcpC 野生型的作用，所述CcpC野生型随后根据本发明被修饰，这在适当的宿主生物中导致核黄素生物合成的提高。就本发明而言，含有野生型序列的微生物被称作野生型微生物。本发明因此涉及——优选地经分离的——经突变的(经修饰的)核酸分子，其编码“经突变的”转录因子，所述转录因子特别源自CcpC型或其同系物或直系同源物，其中未经突变的(野生型)核酸分子选自由以下组成的组a)包含核苷酸序列SEQ ID No. :1或由核苷酸序列SEQ ID No. :1组成的核酸分子；b)编码下述多聚氨基酸分子(蛋白质)的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No. 2或由氨基酸序列SEQ ID No. 2组成；C)与a)或b)的核酸分子具有至少70%同源性的核酸分子；d)在严格条件下与a)或b)的核酸分子之一杂交的核酸分子；和c)根据a)或b)的核酸分子的片段和/或类似物，其编码具有CcpC型转录因子功能/活性的蛋白质，其中经突变的核酸分子显示至少一个遗传突变，所述遗传突变导致与CcpC野生型的活性相比降低的CcpC蛋白质活性。如上文所述，在一个优选的实施方案中，ccpC基因被完全敲除(所谓的敲除突变)。本发明的又一主题是多聚氨基酸分子(蛋白质或多肽)，优选地是以经分离形式存在的分子，其选自由以下组成的组a)包含氨基酸序列SEQ ID No. :2或由氨基酸序列SEQ ID No. :2组成的多聚氨基酸分子；b)由上文表征的核酸分子编码的多聚氨基酸分子；c)与a)或b)的分子具有至少70%同源性的多聚氨基酸分子；和d)a)或b)的多聚氨基酸分子至少之一的片段和/或类似物，其具有CcpC型转录因子的功能，其中a)到d)的蛋白质是如上文所述被修饰的野生型CcpC，这导致作为转录因子的活性的降低。本发明还涉及与优选的SEQ ID No. :1或SEQ ID No. :2分别显示可观的序列同一性，特别是可观的“同源性”的此类核酸分子或蛋白质。根据本发明，这被理解为表示至少 70 %、优选地至少75 %、特别优选地至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %和至少98 % 的序列同一性。优选地，序列涉及在整个长度上分别对SEQ ID No. :1或SEQ ID No. :2的同一性。在一个优选的变体中，前述序列同一性排他地涉及SEQ ID No. :1和SEQ ID No. 2的功能相关区域。此类区域的例子是ccpC基因中的DNA结合结构域。本领域技术人员已知鉴定这些基因区域的程序。考虑到核酸分子之间的“同源性”，“严格条件”下的杂交可以被理解为一种标准。对“严格条件”而言，参考例如在 Maniatis et al.，1989 :“Molecular cloning, a laboratory manual，，,2nd Edition, Cold Spring Harbours Laboratory, N. Y 中描述的已知技术内容。“严格条件”依赖于实际序列。通常这被理解为表示比特定序列的解链温度 (melting point)低涨到IOK的杂交温度，在所述解链温度下50%序列相同的互补探针与靶序列杂交。至少50%、60%、70%或特别优选地至少80%、最优选地至少85%到90%、特别是至少95%的核酸序列彼此同源的条件是优选的。在作为例子给出的在严格条件下杂交的一个实施方案中，反应在约45°C下于6x 氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行，随后在50°C、优选地55°C、特别优选地60°C、尤其优选地 65°C下，于 Ix SSC，0. SDS 中洗涤。优选的是“高度严格条件”下的杂交，例如使用经标记的探针例如地高辛(DIG)标记的探针，于42°C下孵育若干天，例如2到4天，之后是室温下在h SSC, 0. 1 % SDS中一次或多次的洗涤步骤，和65到68°C下在0. 5x SSC, 0. 1% SDS或0. Ix SSC, 0. 1% SDS中至少一次的洗涤步骤。特别地，“高度严格条件”例如包括于42°C下，在溶液例如任选地添加 100 μ g/ml 鲑鱼精核酸的"DigEasyHyb 溶液”(Roche Diagnostics GmbH)，或者包含 50 % 甲酰胺、5x SSC,0. 02% SDS,0. 1% N-月桂酰肌氨酸和 2% “封闭试剂” (Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，使用DIG-标记的探针(通过例如“DIG标记系统”制备，Roche Diagnostics GmbH,68298 Mannheim，德国)孵育2小时到4天，之后将滤纸于室温下在h SSC,0. 1% SDS中洗涤两次，每次5到15分钟，然后于65-68°C下在0. 5x SSC，0. 1 % SDS或0. Ix SSC, 0. 1% SDS中洗涤两次，每次15-30分钟。在本申请中，术语“同源性”或“同一性百分比”可互换使用。为了测定两条核酸或氨基酸序列彼此“同源”或“相同”的百分比，将两条序列就最适比较的目的对准(例如为了两条序列的最适比对，向一条序列中引入缺口)。然后比较相应的位置上的核苷酸。当第一核酸序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的核苷酸占据时，则两个分子在该位置上是相同的，这对应于100%的同源性或同一性。两条序列之间同一性的百分比数值(百分比同一性)可以被表示为所述序列共享的大量相同位置的函数(即％同一性=相同位置数/位置总数(即重叠位置)χ100)。优选被比较的序列有相同的长度。为了测定同源性，本领域技术人员可获得多种已知的计算机程序，例如作为GCG软件包组件的程序 “GAP”(可在 http://accelrys. com/ 获得)，所述程序根据 Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48,444-453,1970)的算法运作。就本发明而言，术语“直系同源物”应当被理解为表示不同属的基因，所述基因均从一个共有的原始基因开始产生。通常这些直系同源基因的功能在进化期间是保守的。为了能够在先前未经测序的基因组中进行可靠的基因功能预测，直系同源物的鉴定是重要的。与之相反，在本发明的意义上，实际源自一个共同基因、但是在进化过程中获得另一功能的多个基因被称作“类似物”。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了修饰(特别是降低其活性)转录因子 CcpC或其同系物或直系同源物的亲合力和/或其与被调节的基因的操纵子、特别是转录因子结合结构和/或其辅助因子，从而使获得的源自CcpC或其同系物或直系同源物的经修饰或“经突变的”基因产物(即蛋白质)显示与下述操纵基因结构具有降低的结合活性和 /或相互作用，或没有结合活性和/或相互作用，所述操纵基因结构与被调节的基因或操纵子相关。在一个优选的变体中，这通过原始ccpC基因(野生型)或其同系物或直系同源物的直接遗传修饰进行，从而获得具有经修饰的“经突变的”氨基酸序列、特别是具有经修饰的蛋白质结构的基因产物。在一个替代性或优选地额外的变体中，这通过修饰选自转录、翻译和(适用时)翻译后加工的至少一个过程来进行，特别优选地通过修饰与这些过程相关的至少一种分子结构或其辅因子来进行。这特别通过使用至少一种结构或构建体来实现，所述结构或构建体结合和/或失活涉及至少一种这些过程的结构或序列。所述结构或构建体优选地选择反义构建体和抗体，但不排他地仅限于此。优选地，通过特异性抑制剂直接降低转录因子CcpC或其同系物或直系同源物的活性和/或浓度。此类特异性抑制剂的例子是CcpC基因或其同系物或直系同源物或根据本发明的其他结构相关的核酸分子的反义构建体，所述反义构建体以本身已知的方式被瞬时或稳定地引入宿主细胞中并在其中表达。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了转录因子CcpC及其同系物或直系同源物分别的表达和/或需要时其辅因子的表达的修饰，特别是浓度/活性的降低，即特别是拷贝数的降低，特别是为了降低或完全阻抑所述表达。在一个优选的变体中，这通过ccpC 基因或其同系物或直系同源物操纵子的直接遗传修饰实现。在一个优选的变体中，为此提供控制基因表达的启动子的修饰，并优选地使得发生低表达或者完全不发生表达，也就是 “敲除”。在一个替代性或优选地额外的变体中，这通过调控选自转录、翻译和(适用时)翻译后加工的至少一个过程来实现，优选地特别通过调控与这些过程相关的至少一种分子结构或其辅因子来实现。这些特别包括敲除突变，所述敲除突变可例如通过同源重组以及使用反义构建体，以本身已知的方式获得。可以通过普遍已知的方法将根据本发明的核酸或反义构建体引入宿主细胞中。优选的方法是通过电穿孔、洗涤剂或类似手段，替代性或优选额外地通过射击方法(例如“基因枪”)或类似方法，使细胞壁和/或宿主细胞膜崩解，本发明不限于这些方法和手段。因此，本发明的一个方面是外部、特别是合成生产的DNA或RNA分子，其具有反义方向的根据本发明的核苷酸序列，所述分子可以被引入宿主细胞中。这特别包括以反义方向包含一个或多个拷贝的所述核酸分子的载体。因此，本发明的一个优选的实施方案是经修饰的微生物细胞，所述微生物细胞被修饰以阻抑CcpC或其同系物或直系同源物的表达。在一个变体中，为了 CcpC或其同系物或直系同源物的低表达而修饰细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是编码CcpC的至少一个基因的敲除突变体。本发明因此还包括经修饰的细胞，所述细胞是Bacillus subtilis 的CcpC编码基因同系物的敲除突变体。本发明因此还包括Bacillus subtilis的CcpC编
9码基因的直系同源物的敲除突变体。本发明还包括CcpC及其基因的其他功能类似物的敲除突变体。在宿主细胞遗传修饰的一个替代性或优选额外的变体中，遗传修饰发生在CcpC 转录因子的至少一个和优选若干个结合结构及其片段上。这些优选地是宿主细胞中由CcpC 调节的基因的操纵基因结构。被调节的基因特别是citB和citZ，本发明不旨在仅限于此。通过接近CcpC调节的基因操纵基因区段附近的根据本发明的至少一种优选地提供的突变，根据本发明转录因子与操纵基因的结合应当被阻止或减少，使得关于基因转录的调节效应发生至降低的程度，或完全不发生。用于修饰被转录因子调节的基因的操纵基因区段(特别是它们对转录因子的结合序列)的方法是本领域技术人员已知的。被调节的基因citB和citZ的结合序列和ccpC基因自身中的结合序列例如公开/参考于“Bacillus subtilis中的转录调节数据库”(DBTBS 见httD://dbtbs.hgC. jp/)中。ccpC基因自身调节序列中已知结合序列的例子位于相对于起始密码子第-10到+15位(SEQ ID No. 3)处， 特别是第-5到+10位(SEQ ID No. :8)处。citB的已知结合序列位于相对于起始密码子第-75 到-52 位(SEQ ID No. 4)处，特别是第 _73 到-68 位(SEQ ID No. 9)处或第-64 到-60 位(SEQ ID No. 10)处，和第-35 到-22 位(SEQ ID No. 5)处或第 _；35 到-17 位 (SEQ ID No. 11)处，特别是第-27到-22位(SEQ ID No. 12)处，citZ的已知结合序列位于相对于起始密码子第-11到+5位(SEQ ID No. 6)处，特别是第-11到_8位(SEQ ID No. 13)位处，和第+21 到+44 位(SEQ ID No. :7)处，特别是第+23 到 M6 位(SEQ ID No. 14)处或第+34到+37位(SEQ ID No. 15)处。前述已知结合序列和相应的操纵子列于表 1中。被CcpC调节的已知基因及其操纵子的列表。“绝对位置”以“NCBI序列文件 (登记号no. NC 000964)”中的位置为基础计算。精确的结合序列(顺式元件)加有下划线。来源;http://dbtbs. hRC. ip/。
权利要求
1.经修饰的生产核黄素的微生物，其特征在于，与未经修饰的野生型微生物相比，CcpC 型转录因子的表达和/或活性被降低，优选地被降低至少25%。
2.如权利要求1所述的微生物，其特征在于，其包含处于被CcpC型转录因子调节的至少一个基因的一个或多个结合序列中的至少一个突变，优选地处于citZ和/或CitB基因的结合序列中的至少一个突变。
3.如权利要求2所述的微生物，其特征在于，其包含处于根据SEQID Nos. :3、4、5、6、 7的序列或其片段中，特别是SEQ ID Nos. :8、9、10、11、12、13、14或15中的至少一个突变。
4.如权利要求1或2所述的微生物，其特征在于，编码Ccpc的基因被敲除。
5.如权利要求1或4所述的微生物，其特征在于，包含选自下组的核酸分子，所述组由以下组成a)包含核苷酸序列SEQID No. 1或由核苷酸序列SEQ ID No. 1组成的核酸分子；b)编码下述多聚氨基酸分子(蛋白质)的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No. 2或由氨基酸序列SEQ ID No. 2组成；c)与a)或b)的核酸分子具有至少70%同源性的核酸分子；d)在严格条件下与a)或b)的核酸分子之一杂交的核酸分子；和c)根据a)或b)的核酸分子的片段和/或类似物，其编码具有CcpC型转录因子功能/ 活性的蛋白质，其中根据a)到c)的核酸分子具有至少一处下述遗传突变，所述遗传突变导致与CcpC 野生型的活性相比降低的、优选地降低至少25%的CcpC蛋白质活性。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的微生物，其特征在于，与未经修饰的微生物或野生型微生物相比具有提高至少10%的核黄素产率。
7.根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其特征在于，选自由以下组成的组Bacillus、Corynebacterium 禾口 Pseudomonas，优选地 Bacillus anthracis、 Bacillus cereus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillus amyloliquifaciens 或 Bacillus subtilis。
8.根据前述权利要求中任一项所述的微生物用于与未经修饰的微生物或野生型微生物中的核黄素合成相比提高核黄素合成、特别是提高至少10%的用途。
9.编码CcpC型转录因子的经修饰的核酸分子的用途，其特征在于，所述修饰导致转录因子功能的降低，优选地导致至少25 %的降低，特征在于要被修饰的核酸分子选自由以下组成的组a)包含核苷酸序列SEQID No. 1或由核苷酸序列SEQ ID No. 1组成的核酸分子；b)编码下述多聚氨基酸分子(蛋白质)的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No. 2或由氨基酸序列SEQ ID No. 2组成；c)与a)或b)的核酸分子具有至少70%同源性的核酸分子；d)在严格条件下与a)或b)的核酸分子之一杂交的核酸分子；和c)根据a)或b)的核酸分子的片段和/或类似物，其编码具有CcpC型转录因子功能/ 活性的蛋白质。
10.经修饰的核酸分子的用途，其特征在于，所述修饰导致CcpC型转录因子功能的降低，优选地导致至少25%的降低，特征在于要被修饰的核酸分子选自所述转录因子的结合序列。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述经修饰的核酸分子选自由SEQID Nos. :3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 和 15 组成的组。
12.用于生产核黄素的方法，其特征在于所述方法包括培养根据权利要求1到7中任一项的微生物。
13.用于生产核黄素的方法，其特征在于包括步骤a)提供根据权利要求1到7中任一项所述的合适的宿主细胞，b)在适用于核黄素生产的发酵条件下培养，和c)将核黄素与培养基和/或经修饰的宿主细胞分离。
全文摘要
本发明涉及生物技术发酵生产核黄素(在下文中也称作维生素B2)的方法和手段，和实施所述方法的手段，特别是具有提高的核黄素产率的经修饰的微生物宿主细胞。本发明因此公开了调节参与宿主细胞核黄素生产的酶活性的表达的新颖方法和手段。
文档编号C12N15/31GK102245781SQ200980150515
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者克劳斯·穆彻, 卓阿克姆·施密德, 弗洛瑞娜·柯克纳 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司