专利名称：检测皮肤老化相关基因突变的方法及其专用引物与TaqMan-MGB探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及用分子生物学方法对突变碱基进行定性、定量检测的引物和探针。特别是涉及用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR)技术对皮肤老化相关基因突变进行定性、定量检测的引物和TaqMan-MGB探针。
背景技术：
目前，在已知的人类2万至2. 5万个基因中，有1500个基因对皮肤老化发挥关键作用。在人类衰老的过程中，有数百个基因会发生变异。人类皮肤老化有8种独立的方式， 每种方式均由一组基因控制。一个人的皮肤是否会出现皱纹，不仅与生活方式有关，也与基因有关。每个人的皮肤老化状况是不同的，这与每个人携带的遗传信息不同有很大关系。 皮肤抗老化能力可以分为四个指标解毒能力；抗光老化能力；抗自由基能力；DNA损伤修复能力。在与皮肤老化相关的诸多基因中CYPIAl，CYP2E1，EPHXl，NQO1，GSTPl与皮肤的解毒能力相关；S0D3，CYBA，CAT，N0S3，P0N1，GPX1与皮肤抗自由基能力相关；XPA，XPD，XRCCl， MTHFR, hMLHl与NDA损伤修复能力相关；MMP1，MMP3，MMP9与皮肤抗光老化能力相关。通过检测这些基因的突变情况就可以获得皮肤老化的信息。目前，已报道的用于检测皮肤老化相关基因突变的方法主要包括PCR直接测序和定性PCR等，这些方法普遍存在灵敏度低，特异性不高，费时费力且易污染等缺点，使应用受到一定限制。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，探针只与模板特异结合，其结合位点位于两条引物之间，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。目前常用的TaqMan荧光探针为寡核苷酸，其5’端标记有报告荧光基团，如FAM，VIC等，3’端标记有淬灭荧光基团，如TAMRA等。探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光，当探针与靶序列配对时，PCR延伸反应聚合酶的5’ 一 3’外切酶活性将探针酶切降解，是报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可对未知模板进行定量分析。但是，实际上，探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且，荧光基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高。针对TaqMan探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新 TaqMan-MGB (TaqMan Minor Groove Binder Probe, TaqMan-MGB ), TaqMa-MGB ^ 针是带有一个小沟结合物基团的寡核昔酸探针，工作原理与TaqMan探针相同，报告荧光基团连接在探针的5’端(如FAM、VIC等)，3’端标记有淬灭基团，不同的是淬灭基团为不发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quenoher，NFQ)，淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3 可折叠进由探针末端 5_6bp 核营酸形成的小沟内。DPI3呈新月行，与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋，主要通过范德华力稳定。TaqMan-MGB探针显示了更强的序列特异性。可以大大稳定探针与模板的杂交， 升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值一而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。总之，与传统的TaqMan探针比较，TaqMan-MGB探针有以下优势MGB增加了探针熔点温度(Tm)，这样可使探针较短，尤其适合富含A/T的序列，并且提高配对与非配对模板间的Tm值差异，可进行更多重的PCR ；提高信噪比，由于在探针的3 ‘端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验的结果更精确，分辨率更高；且实验步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高。目前尚没有专门用于检测皮肤老化相关基因突变的实时荧光定量PCR检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供针对皮肤老化相关基因突变进行定性、定量检测的引物。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于检测CAT突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2组成的引物对。用于检测CYBA突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4组成的引物对。用于检测CYPlAl突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6组成的引物对。用于检测CYP2E突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8组成的引物。用于检测EPHX突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10组成的引物对。用于检测GSTPl突变的引物，是由序列表中SEQID NO: 11和SEQ ID N0:12组成的引物对。用于检测MTHFR突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14组成的引物对。用于检测N0S3突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:16组成的引物对。用于检测NQOl突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:17和SEQ ID N0:18组成的引物对。用于检测PONl突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20组成的引物对。用于检测S0D3突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:22组成的引物对。
用于检测XPA突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24组成的引物对。用于检测XPD突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26组成的引物对。用于检测XRCCl突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28组成的引物对与SEQ ID NO : 和SEQ ID NO 30组成的引物对。用于检测MMP9突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:31和SEQ ID N0:32组成的引物对。用于检测MMP3突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:33和SEQ ID而；34组成的引物对。用于检测MMPl突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:35和SEQ ID N0:36组成的引物对。用于检测hMLHl突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38组成的引物对。用于检测GPXl突变的引物，是由序列表中SEQ ID N0:39和SEQ ID N0:40组成的引物对。本发明还提供了针对皮肤健康相关基因突变进行定性、定量检测的TaqMan-MGB 探针。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于检测突变的CAT TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42的DNA序列。用于检测突变的CYBA TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:43和SEQ ID NO: 44的DNA序列。用于检测突变的CYPlAl TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的DNA序列。用于检测突变的CYP2E TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 47和SEQ ID NO 48的DNA序列。用于检测突变的EPHX TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:49和SEQ ID NO: 50的DNA序列。用于检测突变的GSTPl TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO :51和SEQ ID NO 52的DNA序列。用于检测突变的MTHFR TaciMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 53禾口 SEQ ID NO 54的DNA序列。用于检测突变的N0S3 TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:55和SEQ ID NO: 56的DNA序列。用于检测突变的NQOl TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:57和SEQ ID NO: 58的DNA序列。用于检测突变的PONl TaciMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:59禾口 SEQ ID NO: 60的DNA序列。
用于检测突变的S0D3 TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:61和SEQ ID NO: 62的DNA序列。用于检测突变的XPA TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 63和SEQ ID NO 64的DNA序列。用于检测突变的XPD TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 65和SEQ ID NO 66的DNA序列。用于检测突变的XRCC IiTaciMan-MGB 探针，是序列表中 SEQ ID NO :67，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO :69 和 SEQ ID NO 70 的 DNA 序列。用于检测突变的MMP9 TaciMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:71禾口 SEQ ID NO: 72的DNA序列。用于检测突变的MMP3 TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 73的DNA序列。用于检测突变的MMPl TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 74的DNA序列。用于检测突变的hMLHl TaciMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 75禾P SEQ ID NO 76的DNA序列。用于检测突变的GPXl TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:77和SEQ ID NO: 78的DNA序列。所述探针经过荧光标记，5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭集团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。报告荧光基团为FAM或VIC， 不发光的淬灭基团为NFQ。本发明还提供了一种检测皮肤健康相关基因突变的试剂盒，可包括上述用于检测皮肤健康相关基因突变的引物又以及TaqMan-MGB探针。
具体实施例方式本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用限制本发明范围实施例1、用于对皮肤健康相关基因CAT突变进行检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计CAT基因序列的突变位点，用Primer Express Software 2. 0软件设计PCR引物， 同时根据野生型CAT基因及突变型CAT基因的反向互补序列设计2条TaqMan-MGB探针，将 2条TaqMan-MGB探针的5’端分别标记报告荧光基因FAM(红色荧光)和VIC(绿色荧光)， 3’端标记不发光淬灭基团，并连接DIP3。引物及TaqMan-MGB探针序列为引物5， -attttactcttcaacatagctttt-3，5， -attggcttctttaaacactggaga-3，TaqMan-MGB 探针5， -VIC-cttacctgggggtaaaatttg-MGB-3，5' -FAM-cttacctgggagtaaaatttg-MGB-3'实施例2、皮肤健康相关基因CAT突变的检测1)样本基因组DNA的获取
8
用细胞裂解法提取口腔粘膜脱落细胞中的DNA，悬浮于Iml生理盐水中，2000Xg 离心IOmin ；弃上清，每管加Iml生理盐水重复洗涤一次，再2000 X g离心IOmin ；弃上清，每管加 400 μ 1 细胞裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0 ；0. Imol EDTA, PH 8. 0 ；0. 5% SDS)，放在50°C水浴中温育30分钟；然后冷却至室温，加等体积的酚一氯仿一异戊醇(体积比25 24 1)，混勻，5000 Xg离心IOmin ；转移上层水相到另一 Eppendorf管中，重复抽提一次；再转移上层水相到另一 Eppendorf管中，加1/10体积的3M NaAc (pH5. 2)，混勻； 加入2. 5倍体积的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉淀DNA 30分钟；10000 Xg离心15分钟，弃上清；加lml70%冷乙醇清洗沉淀，IOOOOXg离心分钟，弃上清；37°C温箱30分钟烘干；将DNA 沉淀溶于20 μ 1 TE缓冲液中，加1 μ 1 RNA酶，37°C 30分钟，置于_20°C保存。2) PCR 扩增以步骤1)提取的DNA为模板，在实施例1所述引物及TaqMan-MGB探针的引导下， 用ABI7900实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行PCR扩增，并按等位基因鉴别实验操作步骤完成并分析，即依次进行读取等位基因鉴别实验PCR扩增前信号、执行扩增程序及读取、分析扩增后信号。其中，PCR反应体系为2 XTaqMan通用PCR扩增预混试剂 (购自美国应用生物系统公司)，引物各900nM，荧光标记的2条I1aqMan-MGB探针各200nM， 150ng DNA。PCR反应条件为先95°C 10分钟；然后95°C 15秒，60°C 1分钟，共40个循环。3)得出结果用SDS软件(美国应用生物系统公司)分析实验结果。本次实验共取100名受试
者样本进行实验，最终的基因型分布见下表。
受试者数AAAGGG
1OO51445序列表<160>64<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>1attttactct tcaacatagc tttt<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>2
attggcttct ttaaacactggaga
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3
ccgagtggga gaggcccagcCgCg
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>4
atagtaattc ctggtaaagggccc
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>5
agaaggtgat tatctttggcatgg
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>6
ttccacccg ttgcagcaggatagc
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>7cttcatttct catcatattt tcta<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>8ttctgttcta actggcaata tata<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>9atctcctact ggcggaatga at tt<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>10tcggtctctc cctacataca gtac<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>11Bgccctggtg gacatggtga atga<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<230><400>12ccaaccctgg tgcagatgct caca<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230〉<400>13atgtgtcagc ctcaaagaaa agct<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>14ccgaagcagg gagctttgag gctg<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>15aggaaacggt cgcttcgacg tgct<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>16acgtggggtg ctccaggggc acct<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列
12
<220>
<230>
<400>17
cttccaggat ttgaattcgggcgt
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>18
cctcagagtg gcattctgcatttc
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>19
tcacttggac tatagtagac3.3.C3.
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>20
ttatgtgtgt atgttttaattgca
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>21
tgggcgtgtg CgggCCSgggctct
<210>22
<211>24
<212>DNA<213>人工序列 <220> <230> <400>22
tggccgccgc cgggtggggg CCgC <210>23 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <230> <400>23
ctaaagccgc cgcctccggc aaag
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>24
ctggctcgcc tcggcgtgca gtgc
<210>25 <211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>25
gaaccgttta tggccccacc cgcc
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>26
cctgtccctg ctcatcctgg agca
<210>27
<211>24
CN 102168128 A
说明书10/21页
[0243 [0244 [0245 [0246 [0247 [0248 [0249 [0250 [0251 [0252 [0253 [0254 [0255 [0256 [0257 [0258 [0259 [0260 [0261 [0262 [0263 [0264 [0265 [0266 [0267 [0268 [0269 [0270 [0271 [0272 [0273 [0274 [0275 [0276 [0277 [0278 [0279 [0280 [0281
1权利要求
1.用于检测CAT突变的引物，是由序列表中SEQID NO :1和SEQ ID NO :2组成的引物对。
2.用于检测CYBA突变的引物，是由序列表中SEQID NO :3和SEQ ID NO :4组成的引物对。
3.用于检测CYPlAl突变的引物，是由序列表中SEQID NO :5和SEQ ID NO :6组成的引物对。
4.用于检测CYP2E突变的引物，是由序列表中SEQID NO :7和SEQ ID NO :8组成的引物对。
5.用于检测EPHX突变的引物，是由序列表中SEQID NO :9和SEQ ID N0:10组成的引物对。
6.用于检测GSTPl突变的引物，是由序列表中SEQID N0:11和SEQ ID N0:12组成的引物对。
7.用于检测MTHFR突变的引物，是由序列表中SEQIDN0:13和SEQ ID N0:14组成的引物对。
8.用于检测N0S3突变的引物，是由序列表中SEQID N0:15和SEQ ID N0:16组成的引物对。
9.用于检测NQOl突变的引物，是由序列表中SEQID NO 17和SEQ ID NO 18组成的引物对。
10.用于检测PONl突变的引物，是由序列表中SEQID N0:19和SEQ ID N0:20组成的引物对。
11.用于检测S0D3突变的引物，是由序列表中SEQID NO :21和SEQ ID N0:22组成的引物对。
12.用于检测XPA突变的引物，是由序列表中SEQID NO 23和SEQ ID NO 24组成的引物对。
13.用于检测XPD突变的引物，是由序列表中SEQID NO 25和SEQ ID NO J6组成的引物对。
14.用于检测XRCCl突变的引物，是由序列表中SEQID NO 27和SEQ ID NO J8组成的引物对与SEQ ID NO 29和SEQ ID NO 30组成的引物对。
15.用于检测MMP9突变的引物，是由序列表中SEQID NO :31和SEQ ID N0:32组成的引物对。
16.用于检测MMP3突变的引物，是由序列表中SEQID N0:33和SEQ ID而；34组成的引物对。
17.用于检测MMPl突变的引物，是由序列表中SEQID NO 35和SEQ ID NO :36组成的引物对。
18.用于检测hMLHl突变的引物，是由序列表中SEQID NO 37和SEQ ID NO 38组成的引物对。
19.用于检测GPXl突变的引物，是由序列表中SEQID NO 39和SEQID NO :40组成的引物对。
20.用于检测突变的CATTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO :41禾口 SEQ ID NO:(42的DNA序列。
21.用于检测突变的CYBATaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:43和SEQ ID NO: 44的DNA序列。
22.用于检测突变的CYPlAlTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的DNA序列。
23.用于检测突变的CYP2EiTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:47和SEQ ID NO: 48的DNA序列。
24.用于检测突变的EPHXTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:49和SEQ ID NO: 50的DNA序列。
25.用于检测突变的GSTPlTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:51和SEQ ID NO: 52的DNA序列。
26.用于检测突变的MTHFRTaciMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO :53和SEQ ID NO: 54的DNA序列。
27.用于检测突变的N0S3TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:55和SEQ ID N0: 56的DNA序列。
28.用于检测突变的NQOlTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:57和SEQ ID N0: 58的DNA序列。
29.用于检测突变的PONlTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:59和SEQ ID N0: 60的DNA序列。
30.用于检测突变的S0D3TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:61禾口 SEQ ID N0: 62的DNA序列。
31.用于检测突变的XPATaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO :63禾口 SEQ ID N0: 64的DNA序列。
32.用于检测突变的XPDTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO 65禾口 SEQ ID N0: 66的DNA序列。
33.用于检测突变的XRCCITaqMan-MGB探针，是序列表中SEQID NO :67，SEQ ID N0: 68，SEQ ID NO :69 和 SEQ ID NO 70 的 DNA 序列。
34.用于检测突变的MMP9TaciMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:71禾口 SEQ ID N0: 72的DNA序列。
35.用于检测突变的MMP3TaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO :73的DNA序列。
36.用于检测突变的MMPlTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID NO :74的DNA序列。
37.用于检测突变的hMLHlTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:75和SEQ ID N0: 76的DNA序列。
38.用于检测突变的GPXlTaqMan-MGB探针，是序列表中SEQ ID N0:77和SEQ ID N0: 78的DNA序列。
39.根据权利要求20-38所述的DNA序列，其特征在于5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭集团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。
40.根据权利要求20-38所述的TaqMan-MGB探针，其特征在于所述报告荧光基团为 FAM或VIC，不发光的淬灭基团为NFQ。
41. 一种检测皮肤老化相关基因突变的试剂盒，包括权利要求1-19所述的引物以及权利要求20-38所述的TaqMan探针。
全文摘要
本发明公开了用于检测皮肤老化相关基因突变的方法及其专用引物与TaqMan-MGB探针。用于检测皮肤老化相关基因突变的引物，是由序列表中SEQ ID1～SEQ ID40共40条DNA序列组成。该TaqMan-MGB探针是序列表中SEQ ID41～SEQ ID78共38条DNA序列所述DNA序列5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端不仅标记有不发光的淬灭集团，还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。本发明为皮肤老化的检测、测试、分析、评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。
文档编号C12Q1/68GK102168128SQ20101011452
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者楼屹 申请人:上海金缘生物科技有限公司