专利名称：肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
肺炎克雷伯氏菌，属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌，对营养要求不高，在普通琼脂培 养基上可生长，最适生长温度为37°C。肺炎克雷伯氏菌对人致病性较强，是重要的条件致病 菌和医源性感染菌之一，肺炎克雷伯氏菌广泛分布于自然界如土壤、水和农产品及林产品 中，在人和动物的肠道及呼吸道内也常见。受到肺炎克雷伯氏菌污染的食物与正常食物在 外形与味觉上没有区别，因此准确、快速地检测肺炎克雷伯氏菌具有十分重要的意义。传统肺炎克雷伯氏菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺 点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技 术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且 存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量 测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探 针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量 高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物 技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增 (Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已 建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的肺炎克雷伯氏菌检测试剂 盒及其使用方法以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性 高、漏检率低的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术措施实现一种肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，所 述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒包括以肺炎克雷伯氏菌的oppA基因为靶基因、基于环介 导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。oppA是肺炎克雷伯氏菌周质寡肽结合蛋白基因，主导与宿主细胞结合。所以，所有 肺炎克雷伯氏菌均带有此基因，基因序列比对结果也证实了此结论。与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除肺炎克雷伯氏菌外，无其它菌带 有该基因。作为本发明肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为外引物F3(l) :(SEQ ID NO 1)
TACGCCCCGGTCTGAC外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)GCGCTTTCACCCCCAAC内引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)GGCGAGACCAGTCGTTGCCATTTTCGACGGCACGGCCATT内引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)AACAGCCTCCCCCTACGCGATTTTGTCCCTTTTGCCCGAGG或外引物F3(2) (SEQ ID NO 1)TACGCCCCGGTCTGAC外引物B3(2) (SEQ ID NO 2)GCGCTTTCACCCCCAAC内引物 FIP (2) (SEQ ID NO 5)GGCGAGACCAGTCGTTGCCACGACGGCACGGCCATT内引物 BIP (2) (SEQ ID NO 6)AACAGCCTCCCCCTACGCGAGTCCCTTTTGCCCGAGG或外引物F3(3) (SEQ ID NO 7)GCCATTACAGCGCAGGAT外引物B3(3) (SEQ ID NO 8)TGCAGCGTGGTGTCGT内引物 FIP (3) (SEQ ID NO 9)GGTAGCTCGCGTAGGGGGATTTTCGTCTGGAGCTGGCAACG内引物 BIP (3) (SEQ ID NO 10)CATATCGCCAACGCCCGCGTTTTGCGCTTTCACCCCCAAC或外引物F3(4) (SEQ ID NO 7)GCCATTACAGCGCAGGAT外引物B3(4) (SEQ ID NO 8)TGCAGCGTGGTGTCGT内引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)GGTAGCTCGCGTAGGGGGACGTCTGGAGCTGGCAACG内引物 BIP (4) (SEQ ID NO 12)CATATCGCCAACGCCCGCGGCGCTTTCACCCCCAAC或外引物F3(5) (SEQ ID NO 13)ACCTTTCATTTACGCCCCG外引物B3(5) (SEQ ID NO 14)CGCTTTCACCCCCAACGT
内引物 FIP (5) (SEQ ID NO 15)CGTTGCCAGCTCCAGACGATATTTTGTCTGACCTGGTCCGACG内引物 BIP (5) (SEQ ID NO 16)AACAGCCTCCCCCTACGCGATTTTGTCCCTTTTGCCCGAGG或外引物F3(6) (SEQ ID NO 13)ACCTTTCATTTACGCCCCG外引物B3(6) (SEQ ID NO 14)CGCTTTCACCCCCAACGT内引物 FIP (6) (SEQ ID NO 17)CGTTGCCAGCTCCAGACGATAGTCTGACCTGGTCCGACG内引物 BIP (6) (SEQ ID NO 18)AACAGCCTCCCCCTACGCGAGTCCCTTTTGCCCGAGG或外引物F3(7) (SEQ ID NO 19)TGGAGCTGGCAACGACT外引物B3(7) (SEQ ID NO 20)GGAAGGCGGCATTCGG内引物 FIP (7) (SEQ ID NO 21)CGGGCGTTGGCGATATGCATATTTTTGGTCTCGCCGGCAACA内引物 BIP (7) (SEQ ID NO 22)TGCCCTCGGGCAAAAGGGATTTTCTGGGTCAGAGTGACCTGC或外引物F3(8) (SEQ ID NO 19)TGGAGCTGGCAACGACT外引物B3(8) (SEQ ID NO 20)GGAAGGCGGCATTCGG内引物 FIP (8) (SEQ ID NO 23)CGGGCGTTGGCGATATGCATATGGTCTCGCCGGCAACA内引物 BIP (8) (SEQ ID NO 24)TGCCCTCGGGCAAAAGGGACTGGGTCAGAGTGACCTGC。作为本发明肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的肺炎克雷伯氏菌 检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、显色液、稳定液和阳性 对照。作为本发明肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的Bst DNA聚合 酶酶浓度7-10U/yL；所述的缓冲液含0·18-0. 25mol/L Tris-HCl，0· 10-0. 15mol/L KCl， 0. 07-0.15mol/L (NH4)2SO4,15_30mmol/L MgSO4,1-2% TritonX-IOO ；所述的dNTPs 每种核苷酸浓度10-20mmol/L ；
所述的甜菜碱浓度3-6mol/L ；所述的硫酸镁浓度100-200mmol/L ；所述的显色液为SYBR Green I 或 Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为肺炎克雷伯氏菌基因组DNA。作为本发明肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的最优选实施方式，所述的Bst DNA聚合 酶酶浓度8U/ μ L ；所述的缓冲液含0.2mol/LTris-HCl，0. lmol/L KCl，0. lmol/L(NH4)2SO4, 20mmol/L MgSO4,1% TritonX-100 ；所述的dNTPs 每种核苷酸浓度lOmmol/L ；所述的甜菜碱浓度5mol/L ；所述的硫酸镁浓度150mmol/L。作为本发明肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的肺炎克雷伯氏菌 检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有 将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本发明肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔 中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为缓冲 液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其扩增效 率超强，表现在两个方面(1)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；(2)扩增产物的DNA数 量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个μ g，但过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极易 容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，容易出现气溶胶污染。 而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以 去除。本发明的反应管通过隔板和稳定液的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅 能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大 降低气溶胶的污染。本发明还提供一种使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的方法，该方法包括如下步 骤(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；(2)将样品增菌液提取样品模板DNA ；(3)在反应容器中加入Bst DNA聚合酶1.8 2. 4体积份数、缓冲液10体积份数、 dNTPs 15 20体积分数、甜菜碱15 20体积分数、硫酸镁15 20体积分数、稳定液25 35体积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4 体积分数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相 同则为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以肺炎克雷伯氏菌的oppA 基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。作为本发明使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述的两对
10引物可以为
0105]外引物F3(l)
0106]外引物B3(I)
0107]内引物FIP(I)
0108]内引物BIP(I)
0109]外引物F3(2)
0110]外引物B3(2)
0111]内引物FIP(2)
0112]内引物BIP (2)
0113]外引物F3(3)
0114]外引物B3(3)
0115]内引物FIP (3)
0116]内引物BIP (3)
0117]外引物F3(4)
0118]外引物B3(4)
0119]内引物FIP (4)
0120]内引物BIP (4)
0121]外引物F3(5)
0122]外引物B3(5)
0123]内引物FIP (5)
0124]内引物BIP (5)
0125]外引物F3(6)
0126]外引物B3(6)
0127]内引物FIP (6)
0128]内引物BIP (6)
0129]外引物F3(7)
0130]外引物B3(7)
0131]内引物FIP (7)
0132]内引物BIP (7)
0133]外引物F3(8)
0134]外引物B3(8)
0135]内引物FIP (8)
0136]内引物BIP (8)
0137]
(SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 4)或 (SEQ ID NO 1) (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6)或 (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 9) (SEQ ID NO 10)或 (SEQ ID NO 7) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 11) (SEQ ID NO 12)或 (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO 16)或 (SEQ ID NO 13) (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 18)或 (SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 21) (SEQ ID NO 22)或 (SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24)。
作为本发明使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤(3) 中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。
0138] 本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测肺炎克雷伯氏菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶 和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异 、生识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎_环DNA混合物。LAMP反 应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸 镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C)条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传 统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员 的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本 低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩 增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特 异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即 可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以 微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴 定需2 3天，完成鉴定报告需10 15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且， 本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需一个恒 定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试 剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高 特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高； 4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断 试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物—— 焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证 率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的oppA基因作为靶基因设计引物，使得本发 明的检测试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制 的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。下列缩略语适用于本发明LAMP loop-mediated isothermal amplification,环介导恒温扩增dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,Bst 酶:Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸DNA deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸Betaine 甜菜碱Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚oppA 肺炎克雷伯氏菌周质寡肽结合蛋白基因实施例1试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3(l) :(SEQ ID NO 1)TACGCCCCGGTCTGAC
外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)GCGCTTTCACCCCCAAC内引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)GGCGAGACCAGTCGTTGCCATTTTCGACGGCACGGCCATT内引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)AACAGCCTCCCCCTACGCGATTTTGTCCCTTTTGCCCGAGG。(2)购置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制缓冲液缓冲液按 0. 18mol/L Tris_HCl，0. 10mol/L KCl，0. 07mol/ L(NH4)2SO4,15mmol/L MgSO4,1 体积％ TritonX-100 配制，置于容器；(4)配制dNTPs 每种核苷酸浓度按lOmmol/L配制，置于容器；(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按3mol/L配制，置于容器；(6)配制硫酸镁溶液硫酸镁浓度按lOOmmol/L配制，置于容器；(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；(8)购置显色液SYBR Green I，置于容器；(9)提取阳性对照提取肺炎克雷伯氏菌基因组DNA，置于容器；(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；制备工艺简述如下1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质 检；2、将反应液[即上述(2) — (6)步骤配制的液体]无菌分装，并按照实验用进行 浓度确定，抽样质检；3、将稳定液分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。实施例2试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3(2) :(SEQ ID NO 1)TACGCCCCGGTCTGAC外引物B3(2) (SEQ ID NO 2)GCGCTTTCACCCCCAAC内引物 FIP (2) : (SEQ ID NO 5)GGCGAGACCAGTCGTTGCCACGACGGCACGGCCATT内引物 BIP (2) (SEQ ID NO 6)AACAGCCTCCCCCTACGCGAGTCCCTTTTGCCCGAGG。(2)购置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制缓冲液缓冲液按 0. 25mol/L Tris_HCl，0. 15mol/L KCl，0. 15mol/ L(NH4)2S04，3(kimol/L MgSO4, 2 体积％ TritonX-100 配制，置于容器；(4)配制dNTPs 每种核苷酸浓度按20mmol/L配制，置于容器；(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按6mol/L配制，置于容器；
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2)提取增菌液模板DNA进行环介导等温扩增后进行快速筛选。
3)阴性结果可以直接出报告，阳性结果采用传统方法分离鉴定后确认t 本发明建立体系如下表示
表1肺炎克雷伯氏菌菌LAMP反应体系 1、室内验证1.1特异性小批量特异性试验采用菌株见表2。采用的LAMP方法为1)、提取细菌DNA模板直接取该增菌液ImL加到1. 5mL无菌离心管中，IOOOOr/ min离心2min，尽量吸弃上清；加入80 μ L DNA提取液，混勻后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ； 10000r/min离心2min，上清即为核酸模板。2)、按研制的体系配制反应液，对上述模板进行LAMP反应，判断引物特异性。反应管中加入22 μ L的反应液+0. 5 μ L的DNA聚合酶+30 μ L的稳定液+2. 5 μ L待 检模板；65°C环介导等温反应60min ；往反应管中加入2 μ L显色液，封管后轻轻摇勻观察， 反应管液体呈绿色，为肺炎克雷伯氏菌阳性，呈橙色则为阴性。反应液的主要成分dNTP, Tris-HCl [pH 8. 8]，MgSO4, Triton X-100，Betaine,内 / 外引物。表2小批量特异性试验采用菌株
肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae
肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae
肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae
肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae
肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae
广东出入境检验检疫局kpen 57
广东出入境检验检疫局kpen _0623__
广东出入境检-验检疫局肺72南
广东出入境检验检疫局肺95南
广东出入境检验检疫局肺WOl
厦
李斯特氏菌 Listeria
伤寒沙门氏菌 Salmonella typhi
痢疾志贺氏菌 Shigella dysenteriae
— 变形杆菌 Proteus, vulgaris
副溶血孤菌 Vibrio parahaemolyticus
广东省孩i生物所CMCC(B)51252
广东省；跃生物所CMCC(B)50071
广东省微生物所CMCC(B)51252
广东出入境检验检疫局pro HB7131
广东省彳效生物所VPL4-90采用本发明方法对上述菌株的检测结果见表表3.采用本发明方法进行特异性试验结果
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编号__检测结果
阳性对照阳性
阴性对照阴性—
kpen 57阳生
kpen 0623阳性
肺72南阳性一肺95南__阳性
肺WOl厦阳性—
CMCC(B)51252阴性
CMCC(B)50071阴性
CMCC(B)51252阴性
proHB7131阴性
VPL4-90阴性小批量特异性实验初步表明，本方法的设计引物对肺炎克雷伯氏菌检测的特异性
尚ο分别采用分离自食品、经生化确认为肺炎克雷伯菌的36株。对上述菌株营养肉汤 培养液活化培养获得菌液，采用本发明方法进行LAMP检测，结果均肺炎克雷伯菌阳性，见 表4。表4.分离自食品菌株检测结果编号检测结果
18 综合以上实验结果，表明本发明方法对肺炎克雷伯菌检测具有良好的特异性。1.2灵敏度/检测低限
1)、分别接种5株肺炎克雷伯氏菌于5支装有增菌液培养基的小试管中，生长至约 1 X 108CFU/mL (测定 0D_ 值约 0. 4)。2)、分别取一定量的菌液，加入生理盐水以10倍稀释，分别标记为107，106，105， IO4, IO3, IO2, IO1, IO0o3)、分别取各梯度的肺炎克雷伯氏菌液lmL，同时取等体积生理盐水为空白对照， 依据本发明方法进行检测，确定本发明方法的检出限。4)、同时取各梯度的变形杆菌液lmL，按国标GB/T 4789. 2进行菌落计数，计算各 稀释度的具体菌落数，结合3)中的检测结果分析技术方法的灵敏度。实验结果见表5和表6。对10° IO7浓度的菌液应用本发明方法检测结果见表5。表5.本发明方法检测肺炎克雷伯氏菌灵敏度结果
对10° IO3浓度的菌液按GB/T4789. 2做菌落计数结果见表6。 表6.肺炎克雷伯氏菌各稀释度对应的菌落计数结果单位CFU/mL 稀释度编号 计数结果
结合表5和表6的结果，在本次实验中判断试剂盒灵敏度可达到2. 4 X 104CFU/mL。1. 3人工模拟样品试验1. 3. 1样品制备、增菌培养
1)接种和培养取标准待测菌株接入适当的培养基中，培养至600nm波长处吸光度在0. 35-0. 45 之间，取菌液做10倍梯度稀释，分别标记为IiT1 10_1(1。2)菌落计数取25g(mL)食品，按国标方法进行勻浆；分别取各稀释浓度菌液Iml进行食品样品 人工污染，同时进行增菌后菌落计数，计数按国标GB/T 4789. 2方法进行。3)增菌按国标GB/T 4789. 4方法中的6. 1作增菌处理。1. 3. 2细菌模板DNA的制备增菌液模板DNA的制备1)、取ImL待测增菌液至离心管中，10000r/min离心2min，弃上清；2)、加入80L DNA提取液，混勻，沸水浴10_20min，置冰上IOmin ；3)U0000r/min离心2min，上清即为核酸模板；_20°C保存备用。1. 3. 3LAMP 方法检测1)、反应过程a)在反应管中分别加入相应反应液22. 5 μ L、Bst酶0. 5 μ L，混勻，然后加入30 μ L 稳定液，最后在管中加入2. 5 μ L上述核酸摸板；b)反应管置65°C温育60min ；2)、阴性对照、阳性对照设置以样品预处理液代替DNA模板作为阴性对照；
以已知浓度的标准菌株DNA模板作为阳性对照。1. 3. 4结果观察在反应管中分别加入2L显色液后观察结果；在阴性对照反应管为橙色，阳性对照 反应管呈绿色的条件下待检样品反应管呈绿色，则为阳性；待检样品反应管呈橙色，则可报告为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测。1. 3. 5实验结果各稀释浓度菌液接种至食品样品按GB方法增菌后用本发明方法检测结果见表7。表7.人工污染食品样品检测结果
21 根据菌落计数，待测菌株增菌后浓度大约为2.4X108CFU/mL，从表7可见，该方法 检测食品中肺炎克雷伯菌在大多数食品样品中灵敏度为240CFU/25g食品。 抽取市场食品样品200份，其中肉制品80份、水产品60份、乳制品60份，分别采 用本发明方法及GB/T 14926. 13-1994方法检测肺炎克雷伯氏菌，结果见表8。表8实际样品中单核细胞增生李斯特氏菌检测结果 从表8可见，本发明方法与GB/T 14926. 13培养方法结果吻合率高。2、室外验证邀请了华南理工大学轻工与食品学院、广东省微生物研究所、深圳出入境检验检 疫局食品检验检疫技术中心、湖南出入境验检疫局食品检验检疫技术中心、贵州验检疫局 检验检疫综合技术中心、东莞出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心6家单位按以下要 求进行本发明方法的室间评估验证。2. 1特异性 取表1所列菌株分别按相应标准接种选择性增菌液增菌后，提取细菌DNA模板，按 本发明研制体系进行等温扩增反应，对结果进行判断。步骤如下
(1)取 Iml 菌液，IOOOOrpm 离心 Imin,去上清；
(2)加入样品处理液100 μ L，混勻；置100°C保温lOmin，冰上放置IOmin ；(3) IOOOOrpm离心2min，上清用于扩增检测(4)按表2所示配制体系表2.等温扩增反应体系 (5).置65°C保温lh，加入显色液2yL观察结果。2. 2灵敏度/检测低限取目标菌菌液定量到约0. 4麦氏浊度，然后进行10倍梯度稀释，获得ICT1 10, 浓度的菌液；取其中的10_4 10_6浓度的菌液Iml按GB/T4789. 2进行平板计数，另取10—1 10,浓度的菌液用于本发明方法做提取核酸及检测，比较等温扩增结果与菌落计数结果判 断灵敏度。步骤如下(1)取编号为kpen 57菌液，用生理盐水稀释至约0. 4麦氏浊度；(2)取0. 5ml步骤1的稀释菌液加入4. 5ml无菌生理盐水中，混勻，获得ICT1菌液， 如此类推获取KT1 10,浓度的菌液；(3)取其中的10_4 10_6浓度的菌液Iml按GB/T4789. 2进行平板计数；(4)另取ICT1 10,浓度的菌液按本报告实验内容3. 2步骤进行提取及检测；(5)比较等温扩增结果与菌落计数结果判断灵敏度。2. 3人工模拟样品试验取实验内容3. 3中的10_4、10_5和10_6三组浓度菌液1ml，分别加入准备好15份 250ml食品增菌液中混匀，按GB/T 14926. 13方法增菌；取Iml按本发明方法检测，同时划 平板按GB/T 14926. 13方法分离目标菌，比较两方法结果。步骤如下(1)取食品样品午餐肉、冻牛肉、盒装牛奶、冰鲜鱼、贝类，分别按GB/T14926. 13要 求，每个食品样品取3份25g样分别加入3瓶225ml增菌液中；(2)在每个食品样品的3瓶中分别加入10_4、10_5和10_6浓度菌液Iml制备成人工 污染样品，均按GB/T4789. 10方法增菌；(3)增菌后，取Iml菌液按本发明方法做提取核酸及检测，判读结果；
(4)同时剩余菌液按GB/T 14926. 13方法分离目标菌，比较两方法结果。2. 4实际样品试验(可选)抽取市场猪肉、鸡肉、牛奶、奶粉、水饺样品共30份分别采用本发明方法及GB/T 14926. 13方法检测肺炎克雷伯氏菌，对结果进行判断。2. 5室间验证结果华南理工大学轻工与食品学院、广东省微生物研究所、深圳出入境检验检疫局食 品检验检疫技术中心、湖南出入境验检疫局食品检验检疫技术中心、贵州验检疫局检验检 疫综合技术中心、东莞出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心6家单位分别完成上述验 证并返回验证报告，经各单位评估验证后得到一致的结论验证实验表明，本发明对肺炎克 雷伯氏菌具有很好的特异性，灵敏度可达到IO3 104CFU/mL，可应用于现实食品样品的检 测。根据以上验证实验结果，本发明具有快速、简便、灵敏的特点，无需使用PCR仪，适用于 多种食品中肺炎克雷伯氏菌的快速初筛检测，适合作为基层实验室大规模普查应用。实施例5采用反应管的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒本实施例的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，采用的试剂和引物与实施例1相同，试 剂盒还包括反应管，反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B 两个空腔的纵向延伸的隔板，其中空腔A内装有22. 0μ L的LAMP反应液和0. 5 μ L的Bst DNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2. 0 μ L的LAMP反应显色液，液体上层也 由石蜡封存，将该反应管-20°C保存。本实施例采用反应管作为容器，对肺炎克雷伯氏菌进行LAMP检测，同时设有阳性 对照组和阴性对照组，具体包括如下步骤取上述制备的反应管三支，采用移液枪分别加入阴性对照样品、待检测样品和阳 性对照样品各2. 5 μ L，加样时枪头穿透保护液层，样品加至反应管A腔内，盖紧管盖并做好 标记,移至反应区。将上述反应管均于65°C恒温反应Ih。反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合 均勻后观察。若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现 橙色则为阴性。在LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后 期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
2权利要求
一种肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒包括以肺炎克雷伯氏菌的oppA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述的两对引物为外引物F3⑴ TACGCCCCGGTCTGAC 外引物B3⑴ GCGCTTTCACCCCCAAC 内引物FIP(I)GGCGAGACCAGTCGTTGCCATTTTCGACGGCACGGCCATT 内引物BIP(I)AACAGCCTCCCCCTACGCGATTTTGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3⑵ TACGCCCCGGTCTGAC 外引物B3⑵ GCGCTTTCACCCCCAAC 内引物FIP (2)GGCGAGACCAGTCGTTGCCACGACGGCACGGCCATT 内引物BIP (2)AACAGCCTCCCCCTACGCGAGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3(3) GCCATTACAGCGCAGGAT 外引物B3(3) TGCAGCGTGGTGTCGT 内引物FIP (3)GGTAGCTCGCGTAGGGGGATTTTCGTCTGGAGCTGGCAACG 内引物BIP (3)CATATCGCCAACGCCCGCGTTTTGCGCTTTCACCCCCAAC 或外引物F3(4) GCCATTACAGCGCAGGAT 外引物B3(4) TGCAGCGTGGTGTCGT 内引物FIP (4)GGTAGCTCGCGTAGGGGGACGTCTGGAGCTGGCAACG 内引物BIP (4)CATATCGCCAACGCCCGCGGCGCTTTCACCCCCAAC 或外引物F3(5) ACCTTTCATTTACGCCCCG 外引物B3(5) CGCTTTCACCCCCAACGT 内引物FIP (5)CGTTGCCAGCTCCAGACGATATTTTGTCTGACCTGGTCCGACG 内引物BIP (5)AACAGCCTCCCCCTACGCGATTTTGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3(6) ACCTTTCATTTACGCCCCG 外引物B3(6) CGCTTTCACCCCCAACGT 内引物FIP (6)CGTTGCCAGCTCCAGACGATAGTCTGACCTGGTCCGACG 内引物BIP (6)AACAGCCTCCCCCTACGCGAGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3(7) TGGAGCTGGCAACGACT 外引物B3(7) GGAAGGCGGCATTCGG 内引物FIP (7)CGGGCGTTGGCGATATGCATATTTTTGGTCTCGCCGGCAACA 内引物BIP (7)TGCCCTCGGGCAAAAGGGATTTTCTGGGTCAGAGTGACCTGC 或外引物F3(8) TGGAGCTGGCAACGACT 外引物B3(8) GGAAGGCGGCATTCGG 内引物FIP (8)CGGGCGTTGGCGATATGCATATGGTCTCGCCGGCAACA 内引物BIP (8)TGCCCTCGGGCAAAAGGGACTGGGTCAGAGTGACCTGC。
3.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述的肺炎克雷 伯氏菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、显色液、稳定液和阳性对照。
4.根据权利要求3所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶浓度7-10U/ μ L ；所述的缓冲液含0. 18-0. 25mol/L Tris_HCl，0. 10-0. 15mol/L KC1，0. 07-0. 15mol/ L(NH4)2SO4,15-30mmol/L MgSO4,1-2 体积％ TritonX-100 ； 所述的dNTPs 每种核苷酸浓度10-20mmol/L ； 所述的甜菜碱浓度3-6mol/L ； 所述的硫酸镁浓度100-200mmol/L ； 所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ； 所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为肺炎克雷伯氏菌基因组DNA。
5.根据权利要求4所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶浓度8U/ μ L ；所述的缓冲液含0. 2mol/L Tris-HCl,0. lmol/L KC1，0. lmol/L (NH4) 2S04, 20mmol/L MgSO4,1 体积％ TritonX-100 ；所述的dNTPs 每种核苷酸浓度lOmmol/L ； 所述的甜菜碱浓度5mol/L ； 所述的硫酸镁浓度150mmol/L。
6.根据权利要求3、4或5所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述的肺炎 克雷伯氏菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔 的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
7.根据权利要求6所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个 空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为 缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。
8.一种使用如权利要求3所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的方法，其特征在于，该 方法包括如下步骤(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；(2)将样品增菌液提取样品模板DNA；(3)在反应容器中加入BstDNA聚合酶1. 8 2. 4体积份数、缓冲液10体积份数、dNTPs 15 20体积分数、甜菜碱15 20体积分数、硫酸镁15 20体积分数、稳定液25 35体 积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积 分数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则 为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以肺炎克雷伯氏菌的oppA基因 为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
9.根据权利要求8所述的使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的方法，其特征在于，所述 的两对引物为外引物F3⑴TACGCCCCGGTCTGAC 外引物B3⑴ GCGCTTTCACCCCCAAC 内引物FIP(I)GGCGAGACCAGTCGTTGCCATTTTCGACGGCACGGCCATT 内引物BIP(I)AACAGCCTCCCCCTACGCGATTTTGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3⑵ TACGCCCCGGTCTGAC 外引物B3⑵ GCGCTTTCACCCCCAAC 内引物FIP (2)GGCGAGACCAGTCGTTGCCACGACGGCACGGCCATT 内引物BIP (2)AACAGCCTCCCCCTACGCGAGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3(3) GCCATTACAGCGCAGGAT 外引物B3(3) TGCAGCGTGGTGTCGT 内引物FIP (3)GGTAGCTCGCGTAGGGGGATTTTCGTCTGGAGCTGGCAACG 内引物BIP (3)CATATCGCCAACGCCCGCGTTTTGCGCTTTCACCCCCAAC 或外引物F3(4) GCCATTACAGCGCAGGAT 外引物B3(4) TGCAGCGTGGTGTCGT 内引物FIP (4)GGTAGCTCGCGTAGGGGGACGTCTGGAGCTGGCAACG 内引物BIP (4)CATATCGCCAACGCCCGCGGCGCTTTCACCCCCAAC 或外引物F3(5) ACCTTTCATTTACGCCCCG 外引物B3(5) CGCTTTCACCCCCAACGT内引物FIP (5)CGTTGCCAGCTCCAGACGATATTTTGTCTGACCTGGTCCGACG 内引物BIP (5)AACAGCCTCCCCCTACGCGATTTTGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3(6) ACCTTTCATTTACGCCCCG 外引物B3(6) CGCTTTCACCCCCAACGT 内引物FIP (6)CGTTGCCAGCTCCAGACGATAGTCTGACCTGGTCCGACG 内引物BIP (6)AACAGCCTCCCCCTACGCGAGTCCCTTTTGCCCGAGG 或外引物F3(7) TGGAGCTGGCAACGACT 外引物B3(7) GGAAGGCGGCATTCGG 内引物FIP (7)CGGGCGTTGGCGATATGCATATTTTTGGTCTCGCCGGCAACA 内引物BIP (7)TGCCCTCGGGCAAAAGGGATTTTCTGGGTCAGAGTGACCTGC 或外引物F3(8) TGGAGCTGGCAACGACT 外引物B3(8) GGAAGGCGGCATTCGG 内引物FIP (8)CGGGCGTTGGCGATATGCATATGGTCTCGCCGGCAACA 内引物BIP (8)TGCCCTCGGGCAAAAGGGACTGGGTCAGAGTGACCTGC。
10.根据权利要求8或9所述的使用肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的方法，其特征在于， 步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明提供一种肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒包括以肺炎克雷伯氏菌的oppA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。
文档编号C12Q1/68GK101892300SQ20101011424
公开日2010年11月24日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者冯雪梅, 尹斌, 曹以诚, 李志勇, 杜正平, 田文武, 陈洵, 高东微 申请人:广州华峰生物科技有限公司