专利名称：：一种双反应器系统循环发酵生产含d-乳酸发酵液的方法
技术领域：
：本发明属于生物发酵工程
技术领域：
中D-乳酸发酵液的生产方法，尤其是涉及一种双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液的方法。
背景技术：
：近年来，随着白色污染日益受到关注以及矿物质资源的不可再生性，以可再生资源为原料生产的可生物降解聚合物引起了人们的广泛关注。其中，聚乳酸作为主要的生物可降解塑料之一，其物理性能与聚苯乙烯非常相似，有希望成为石油基塑料的替代物之一。近年来，随着聚乳酸合成研究的不断扩展，发现在L-乳酸二聚体中加入D-乳酸二聚体可以改善聚乳酸的性能，从而拓展了聚乳酸的应用范围。目前，发酵法生产光学纯L-乳酸报道较多，而发酵法生产D-乳酸的研究相对较少。中国专利申请200610097453.6报道了一种组合发酵生产D-乳酸的工艺，D-乳酸产量7.5%13.1%。中国专利申请200710176056.2报道了用发酵法生产D-乳酸，D-乳酸浓度162克/升，转化率94.796.0%，D-乳酸光学纯度在98.0%以上。乳酸发酵通常采用分批式操作，即每一批次发酵都要经过种子多级扩大培养和发酵罐发酵。虽然分批发酵技术发酵过程操作简便且易于控制，但还存在着整个发酵操作周期较长、种子扩大培养增加发酵生产操作步骤、种子扩大培养消耗能源占用场地设备等问题。针对分批发酵技术存在的不足，产生了循环发酵操作技术，即采用发酵结束时将部分培养液作为下一个发酵批次的种子。循环发酵避免了每一批次发酵都要进行多级种子扩大培养，缩短了发酵生产周期，简化了操作。目前，循环发酵普遍采用单个反应器，将一个批次发酵结束后的发酵液作为下一个批次发酵的种子。发酵过程中，菌体生长一般要经历延迟期、指数生长期、稳定期和衰亡期，在发酵末期，菌体生长代谢活力下降，增殖能力减弱。所以，以发酵末期菌体作为种子培养物不能充分发挥菌株产酸能力，不利于提高循环乳酸发酵生产效率。另外，如果以多个单反应器进行并行循环发酵，每一批次发酵结束产生大量待纯化发酵液，给后处理操作带来较大压力。
发明内容本发明提供了一种操作简便、纯度较高的双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液的方法。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液的方法，是以菊糖芽胞杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASDCGMCCNo2185为菌种进行双反应器系统循环发酵，所述双反应器系统由第一反应器和第二反应器组成，是以第一反应器发酵中期发酵液作为第二反应器的种子，当第一反应器结束发酵时，第二反应器中的发酵正进行到中期，再以第二反应器发酵中期发酵液液作为第一反应器的发酵种子，如此循环，得到含D-乳酸发酵液。具体来讲，所述双反应器发酵系统的操作方法为将种子培养液接入含有发酵培养基的第一反应器中进行发酵，当第一反应器的发酵时间进行到发酵周期的一半时，从第一反应器中取出发酵液体积5-20%(优选为10%)的发酵液作为种子液接入第二反应器，并补入等体积发酵培养基至第一反应器中；然后启用第二反应器进行发酵，同时第一反应器仍继续进行发酵；当第一反应器的发酵结束时，将第一反应器中的发酵液取出，得到含D-乳酸的发酵液；此时，第二反应器的发酵正进行到发酵周期的一半，再从第二反应器中取出发酵液体积5-20%(优选为10%)的发酵液作为种子液接入刚清空的第一反应器，并补入等体积发酵培养基至第二反应器；然后再启用第一反应器进行发酵，同时第二反应器仍继续进行发酵；当第二反应器的发酵结束时，将第二反应器中的发酵液取出，得到含D-乳酸的发酵液；此时，第一反应器的发酵正进行到发酵周期的一半，再从第一反应器中取出发酵液体积5-20%(优选为10%)的发酵液作为种子液接入刚清空的第二反应器，并补入等体积发酵培养基至第一反应器中，然后再启用第二反应器进行发酵，同时第一反应器仍继续进行发酵；如此循环。所述菊糖芽胞杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASDCGMCCNa2185菌株已于2007年09月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNa2185，并已在中国专利CN200710176056.2中公开。所述发酵培养基是以葡萄糖为碳源，以酵母粉为氮源，配方优选为葡萄糖90克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙45克/升，PH值5.6。所述发酵条件为发酵温度45士2°C，发酵时间48士2小时，发酵液pH值5.6士0.2。所述发酵条件优选为发酵温度45°C，发酵周期48小时，发酵液pH值5.6，摇床转速100转/分。理论上，所述循环发酵次数是没有限制的，但考虑杂菌污染风险随发酵循环增大等因素，循环次数最好不超过9次。为获得更好的发酵效果，所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2185菌种在发酵前最好进行斜面培养和种子培养。用上述方法获得的含D-乳酸发酵液也属于本发明的保护范围。本发明提供了一种采用双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液的方法。本发明采用双反应器循环发酵技术，实现了以发酵中期具有较强代谢活性的菌体作为种子进行循环发酵生产D-乳酸，有利于提高乳酸生产效率。在双反应器系统中，两个反应器交错开始新的发酵批次，种子培养物从两个反应器分别获得，不需要单独的种子培养过程，且不需要等待一个批次发酵结束才能开始新的发酵批次。另外，采用双反应器循环发酵，两个反应器交错结束发酵，所获含D-乳酸发酵液分别进入乳酸提取工序。与多个单反应器进行并行循环发酵相比，所产生的待处理发酵液得以分散，从而减轻了后处理操作工序的压力，有利于提高后处理操作设备的利用效率。本发明含D-乳酸发酵液的生产方法明显优于现有的含D-乳酸发酵液的生产方法，具有纯度高、低污染、生产效率高、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。其目的是为了更好的理解本发明的内容，因此，所举例的实例并不限制本发明的保护范围。实施例1、双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液本实施例中所使用的各培养基的组成如下斜面培养基葡萄糖20克/升，酵母提取物10克/升，碳酸钙10克/升，琼脂粉15克/升；所述斜面培养基的pH值为6.5。115°C灭菌20分钟。种子培养基葡萄糖50克/升，酵母提取物10克/升，碳酸钙25克/升；余量为水。所述种子培养基的PH值为6.5。115°C灭菌20分钟。发酵培养基葡萄糖90克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙45克/升；余量为水。所述发酵培养基的PH值为5.6。115°C灭菌20分钟。利用双反应器系统连续发酵生产含D-乳酸发酵液(第一反应器中发酵1次，第二反应器中发酵1次)，具体方法包括以下步骤(1)斜面培养将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASDCGMCCNa2185接种于斜面培养基上，45°C培养48小时。(2)种子培养将步骤⑴培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30mL种子培养基的IOOmL三角瓶中，45°C静止培养48小时，制得种子培养液。(3)发酵培养将20mL步骤⑵制得的种子培养液接入装有ISOmL发酵培养基的500mL三角瓶中(第一反应器)，45°C(45士2°C均可)摇床振荡培养，摇床转速100转/分。当培养进行至24小时，从第一反应器中取出20mL发酵液接入第二个500mL三角瓶中(第二反应器)，然后在第一反应器中补加20mL的新鲜发酵培养基。加入ISOmL新鲜发酵培养基至第二反应器。此时，第一反应器继续发酵，第二反应器开始发酵，45°C(45士2°C均可)摇床振荡培养，摇床转速100转/分；第一反应器发酵48小时(48士2小时均可)后取出第一反应器中全部发酵液；第二反应器发酵开始后24h时，重复之前针对第一反应器的操作，待第二反应器发酵(48士2小时均可)后取出第二反应器中的全部发酵液。检测针对48小时的发酵液进行离心，测定菌体干重，并取上清液稀释，检测D-乳酸含量。D-乳酸含量采用Agilent1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定，手性分离柱(日本三菱化学公司，MCIGEL-CRS10ff(3y)4.6IDX50mm，光学异体分离用)，0.002mol/L硫酸铜为流动相，流量0.5mL/min,进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25°C。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625。平行检测3次取平均值。结果显示，第一反应器获得菌体干重1.2克/升，D-乳酸产量80克/升，生产能力1.7克/升/小时；第二反应器获得菌体干重1.6克/升，D-乳酸产量85克/升，生产能力1.8克/升/小时。由结果可知，以第一反应器中发酵中期发酵液作为第二反应器中发酵的种子，不仅两反应器均能各自完成发酵过程，第二反应器的D-乳酸发酵效率还有所提升，说明双反应器连续发酵生产含D-乳酸发酵液的方法有效。实施例2、双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液利用双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液(第一反应器中发酵5次，第二反应器中发酵4次)，参见实施例1的过程，具体包括以下操作不进行斜面培养和种子培养，直接进行发酵培养发酵培养将实施例1中的发酵过程在双反应器系统中继续循环进行，即，第一反应器继续发酵至48小时结束，此时第二反应器发酵至24小时。将第一反应器清空，从第二反应器中取出20mL24小时发酵液作为种子接入第一反应器中，在第二反应器中补加20mL的新鲜发酵培养基。另加入ISOmL新鲜发酵培养基至第一反应器，第一反应器开始新一轮发酵，第二反应器继续发酵。当第二反应器发酵至48小时，第一反应器再次发酵时间为24小时，此时清空第二反应器，从第一反应器中取出20mL发酵液作为种子接入第二反应器，在第一反应器中补加20mL的新鲜发酵培养基。另加入新鲜发酵培养基ISOmL至第二反应器，第二反应器中的再次发酵开始，第一反应器中的发酵继续进行。如此循环往复，第一反应器中发酵5次，第二反应器中发酵4次。每一反应器发酵48小时取出的全部发酵液即为含有D-乳酸的发酵液，可用于后续D-乳酸的提取。检测同实施例1。结果如表1所示，由结果可知，在双反应器系统多次循环发酵过程中，D-乳酸产量不但没有下降，反而随着发酵循环的进行有一定程度的提升。菌体干重略有增长。D-乳酸生产能力由循环初始的1.8克/升/小时提高到2.0克/升/小时。由此可知，双反应器系统适于循环发酵生产D-乳酸。经多次发酵仍能保持D-乳酸生产效率。表1双反应器系统循环发酵生产D-乳酸结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3-4、双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液利用双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液(第一反应器中发酵5次，第二反应器中发酵4次)循环发酵过程参见实施例2的操作，所不同的是实施例3中，发酵温度设定为46°C，完成发酵时间设定为46小时；发酵期间取出发酵液(作为种子液)时间调整为开始发酵后21(比发酵周期一半提前2小时)小时，取出量为10mL。实施例4中，发酵温度设定为44°C，完成发酵时间设定为50小时；发酵期间取出发酵液(作为种子液)时间调整为开始发酵后27(比发酵周期一半延后2小时)小时，取出量为40mL。同样对多次得到的发酵液进行检测，结果参见表2，可见生产能力没有显著变化。说明，本发明循环发酵操作中的具体参数可以适当进行调整，如发酵温度、时间均可变化，发酵期间取出发酵液的步骤可以在完成发酵时间的中期前后2小时进行，另外此时菌种的都较为活跃；取出发酵液的量在发酵液体积总量的520%均适合。表2双反应器系统循环发酵生产D-乳酸结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>另外，本发明利用双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液过程中，循环的次数可以考虑实际生产需求确定，考虑杂菌污染风险随发酵循环增大等因素，循环次数最好不超过9次。权利要求一种双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液的方法，是以菊糖芽胞杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASDCGMCC№2185为菌种进行双反应器系统循环发酵，所述双反应器系统由第一反应器和第二反应器组成，是以第一反应器发酵中期发酵液作为第二反应器的种子，当第一反应器结束发酵时，第二反应器中的发酵正进行到中期，再以第二反应器发酵中期发酵液作为第一反应器的发酵种子，如此循环，并以各自反应器发酵结束时的全部发酵液为含D-乳酸发酵液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述双反应器发酵系统的操作方法为将种子培养液接入含有发酵培养基的第一反应器中进行发酵，当第一反应器的发酵时间进行到发酵周期的一半或前后2小时范围内，从第一反应器中取出发酵液体积5-20%的发酵液作为种子液接入第二反应器，并补入等量发酵培养基至第一反应器继续进行发酵，然后启用第二反应器进行发酵；当第一反应器的发酵结束时，将第一反应器中的发酵液取出，得到含D-乳酸的发酵液；此时，第二反应器的发酵正进行到发酵周期的一半；再从第二反应器中取出发酵液体积5-20%的发酵液作为种子液接入刚清空的第一反应器，并补入等量发酵培养基至第二反应器中继续进行发酵，然后启用第一反应器进行第二次发酵；当第二反应器的发酵结束时，将第二反应器中的发酵液取出，得到含D-乳酸的发酵液；此时，第一反应器第二次的发酵正进行到发酵周期的一半，再从第一反应器中取出发酵液体积5-20%的发酵液作为种子液接入刚清空的第二反应器，并补入等量发酵培养基至第一反应器中继续进行发酵，然后再启用第二反应器进行第二次发酵；如此多次循环。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基是以葡萄糖为碳源，以酵母粉为氮源，配方为葡萄糖90克/升，酵母粉10克/升，碳酸钙45克/升，余量为水，pH值5.6。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵条件为发酵温度45士2°C，发酵时间48士2小时，发酵液pH值5.6士0.2。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵条件为发酵温度45°C，发酵周期48小时，发酵液pH值5.6，摇床转速100转/分。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述循环发酵次数不超过9次。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2185菌种在发酵前还需进行斜面培养和种子培养。8.用权利要求1-7任一项所述方法获得的含D-乳酸发酵液。全文摘要本发明公开了一种双反应器系统循环发酵生产含D-乳酸发酵液的方法。该方法是以菊糖芽胞杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASDCGMCC№2185为菌种进行双反应器系统循环发酵，所述双反应器系统由第一反应器和第二反应器组成，是以第一反应器发酵中期培养液作为第二反应器的种子，当第一反应器结束发酵时，第二反应器中的发酵正进行到中期，再以第二反应器发酵中期培养液作为第一反应器的发酵种子，如此循环，得到含D-乳酸发酵液。本发明含D-乳酸发酵液的生产方法明显优于现有的含D-乳酸发酵液的生产方法，具有纯度高、低污染、生产效率高、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。文档编号C12R1/01GK101805758SQ20101014803公开日2010年8月18日申请日期2010年3月24日优先权日2010年3月24日发明者唐鸿志,孙际宾,王丽敏,许平,赵博,马延和申请人:天津工业生物技术研究所