专利名称：对虾传染性肌肉坏死病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体是对虾传染性肌肉坏死病毒 (Infectious myonecrosisvirus，简称IMNV)的现场快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
传染性肌肉坏死病为2002年在巴西发现的一种危害对虾生产的新的病毒性传染 病，2004年美国亚利桑纳大学Donald V. Lightner博士研究发现该病由一种新的病毒引起 并将之定名为传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，简称IMNV)。这种新 型病毒为双链RNA病毒，属于整体病毒科。对虾传染性肌肉坏死病毒的易感对虾种类为南 美白对虾，主要是感染60 80天的幼虾。该病毒能造成感病对虾全身肌肉组织坏死，一般 情况下，病理死亡发生缓慢，死亡率不高，但整个养殖过程都有死亡，累积死亡率可达70%。 目前，该病已在南美流行，而在亚洲，IMNV已证实传入印度尼西亚。我国海南等地区也有报 道，但还未最后确认；我们在2009年的全国对虾流行病学调查时，发现我国有些地区养殖 对虾的发病症状非常类似IMNV。所以开发新的技术快速、准确、灵敏地检测IMNV，加强养殖 水体环境以及对虾苗种和成虾检疫的监测，以预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾 养殖业的健康持续发展就显得尤为迫切和重要。目前，IMNV检测还主要依赖于病理切片法、电镜观察法和RT-PCR检测法。病理切 片法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在 实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费 时间长、准确性低；用抗体检测法检测IMNV虽然在速度上优于病理切片法，但其灵敏度较 低，在IMNV尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；IMNV的RT-PCR检测法， 虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能实现对IMNV的相对快速、准确检测， 但由于常规的RT-PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，使得RT-PCR检测法难 以用于现场的快速检测，这大大限制了 RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。进行对虾传染性肌肉坏死病毒早期检测并采取预防措施是对虾养殖中降低对虾 传染性肌肉坏死病毒流行风险、减少对虾发病导致巨额经济损失的有效手段，所以建立简 单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的对虾传染性肌肉坏死病毒检测试剂盒 就显得极为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的对虾传 染性肌肉坏死病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒 中，以克服现有技术的不足，使IMNV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。首先，本发明利用针对IMNV的RNA聚合酶基因中保守区段设计的4条特异引物、 一种反转录酶和一种DNA聚合酶，无需单独对目的核酸(RNA)进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对IMNV的快速和高灵敏检 测。为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实 验能够在养殖现场开展，本发明对IMNV的检测方法进行了优化。在用FTA卡制备样品核酸 的标准步骤中，需要将被样品勻浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才 能进行漂洗；本发明通过在被样品勻浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物 质(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使润湿的FTA膜片在室温条件下仅需几分钟即可完成干燥 过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩 增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果的方法；由于等温扩增反应的产物 量非常大，这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测 结果出现假阳性；有报道和专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶) 的方法消除污染风险，但却增加了成本；本发明先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上 方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合，无 须打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程 中反应液可能溅出造成后续待检样品被污染的风险。在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤 中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片；本发明无需专门的纯 化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，不仅简化了检测的操作步骤，还 降低了实验成本。为了使该检测方法在生产现场具有更强的实用性，本发明在上述优化整 个检测方法的基础上，将检测IMNV病毒所需的试剂及器材进行了组装、配套，使之标准化， 形成了检测试剂盒。本发明的检测试剂盒包括(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料，扩增反应液组成成分如下扩增 引物的上游引物1和下游引物1各1 2yM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各 0. 1 0. 4 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmM, MgCl2 4 10mM，Betaine (甜菜 碱)0. 6 1. 2M，Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM，MgS04 1 4mM，(NH4) 2S04 6 12mM， TritonX-100 0. 05% 1. 0%，反转录酶1 20U，BstDNA聚合酶2 20U ；核酸染料为分子 生物学研究中常用的核酸染料，包括但不限于SYBR Green、GeIRed、GelGreen、GoldVieW 、 GeneFinder 等；且核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内 侧；(5)阴性对照管，内装无对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；(8)分别封装于无菌袋中的两种FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。上述的扩增引物是根据IMNVRNA聚合酶保守区序列设计的，其核苷酸序列如下上游引物1 5 ‘ -CCACCCCTGGAATCGATAGATTTTAAATATCTAGAATTGCCAAAACG下游引物1 5 ‘ -TTACCTAACGGCAAATTACCACTTGTTTTAAGGCAAAAACAGCTCTTG上游引物2 5 ‘ -GAGACACGTCAGACAAAGT
下游引物2 5 ‘ -AGATCTTTTTCTGTTGTTCACTT用本发明上述检测试剂盒检测对虾MNV的方法，按下列步骤进行(1)取样品对虾组织约0. 02 1. 0g置于采样管中，用研磨棒将样品对虾组织磨碎 至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品对虾组织将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1 20min ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3 5min以洗涤FTA膜 片；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测 管置于55 65°C条件下保温40 70min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动l-3min，使扩增反应液与粘附于扩增检测管管壁 或管盖上的核酸染料充分混勻；(7)用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液集聚于扩增检 测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的IMNV检测结果为阳 性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的IMNV检测结果为阴性。在上述步骤中，从第(4)步开始应将作为阴性对照的无对虾传染性肌肉坏死病毒 核酸的FTA膜片、作为阳性对照的吸附了对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片，以及吸 附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测。本发明的积极效果在于在试剂盒中汇集IMNV现场快速检测所需的FTA膜片、TE 缓冲液、扩增反应液、核酸染料等试剂和研磨棒、牙签、吸管等器材，使得IMNV的检测能够 快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明依 据优选的IMNV RNA聚合酶保守区序列所设计的扩增引物能有效检测IMNV的所有毒株，而 与其他病毒的RNA聚合酶又无同源性，检测特异性非常好；采用醇类物质对取样后的FTA 膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置核酸染料，在反应 结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加核酸染料使 后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用 的可靠性。本发明将目的核酸(RNA)的反转录和扩增结合起来同步进行，节省了时间，仅 需1. 5 2小时就可完成对虾IMNV的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如离心机、 PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果 非常容易判别；与对虾IMNV已有检测技术相比，本发明的检测方法成本非常低，整个过程 不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，可以替代对虾传染 性肌肉坏死病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和RT-PCR检 测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在野外的生产现场使用，对加强 IMNV的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1本发明的检测试剂盒由以下部件组成(可检测4个样品的包装)(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；
(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20iiL的TE缓冲液(含10mM Tris_HCl和 ImM EDTA,pH8.0)；(4)扩增检测管，6个，每个管内装有25 PL扩增反应液和lyL的核酸染料，扩增 反应液组成成分如下扩增引物的上游引物1和下游引物1各1. 6 yM，扩增引物的上游引 物 2 和下游引物 2 各 0. 2 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl2 8mM, Betaine (甜 菜碱)1. 2M，Tris-HCl 20mM, KCllOmM, MgS04 2mM, (NH4) 2S04 lOmM, TritonX-100 0.1%，反 转录酶5U，BstDNA聚合酶8U ；核酸染料成分为稀释10倍的GeneFinder ，且核酸染料已粘 附固定于扩增检测管的管盖内侧。(5)阴性对照管，1个，内装无对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，1个，内装吸附了对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，1管，内装500 u L无水乙醇；(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌 袋中；(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4X6个；(10)使用说明书，1份。实施例2使用本发明的检测试剂盒检测对虾传染性肌肉坏死病毒的方法。(1)取样品对虾组织约0. lg置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置lOmin ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min ；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，57°C保温 60min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动2min，使扩增反应液与管盖上的核酸染料充分混 勻；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液聚于扩增 检测管底部，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的IMNV检测结果为阳 性，如果呈现橙黄色则表示该样品的IMNV检测结果为阴性。在上述步骤中从第4步开始，应将无对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片、吸 附了对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直 至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。实施例3使用本发明试剂盒检测养殖水体中病毒存在情况。使用实施例1中的检测试剂盒，按下列步骤进行(1)用80目筛绢过滤海水，将过滤物用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置lOmin ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min ；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，57°C保温 60min ；
(6)将扩增检测管上下反复甩动2min，使扩增反应液与管盖上的核酸染料充分混 勻；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液聚于扩增 检测管底部，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的IMNV检测结果为阳 性，如果呈现橙黄色则表示该样品的IMNV检测结果为阴性。在上述步骤中从第4步开始，应将无对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片、吸 附了对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直 至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。实施例4利用已有Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方 法制备对虾病毒核酸的效果对比为了验证本发明中快速核酸制备方法制备核酸的效果，分别利用Whatman-FTA卡 标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法分别从感染IMNV的对虾中制备对虾病毒核酸。利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备对虾病毒核酸(1)取约10-20毫克的对虾附肢放入1. 5mL离心管中，加入100 y L份PBS缓冲液， 用研磨棒将对虾附肢研磨成浆状；(2)用吸液管将研磨的组织勻浆液加到FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加 25u L ；(3)将加好样品的FTA卡室温放置干燥至少一个小时；(4)用一个钻取工具从所上述干燥后的FTA卡上取下直径约2. 0mm的圆片，放进 1. 5mL离心管中；(5)在上述离心管中加入200 u L FTA纯化试剂(Whatman产品编号WG120204)，
静置5分钟；(6)用吸液管将离心管内的FTA纯化试剂全部吸出；(7)重复步骤(5)——(6)两次；(8)在上述离心管中加入 200 iiL TE 缓冲液(10mM Tris-HCl，0. ImM EDTA, pH 8. 0)，静置5分钟；(9)用吸液管将离心管内的TE缓冲液全部吸出；(10)重复步骤⑶——(9)两次；(11)将上述离心管内的圆片在室温下干燥大约一个小时，圆片即可用于核酸的扩 增了。利用本发明中快速核酸制备方法按下面的步骤制备对虾病毒核酸(1)取约10-20毫克的对虾附肢放入1. 5mL离心管中，用研磨棒将对虾附肢研磨成 浆状；(2)用吸液管将研磨的组织勻浆液加到3个FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加 5 u L ；(3)将3个FTA卡上分别滴加100 u L甲醇、无水乙醇和异丙醇，室温放置3 5分 钟；(4)用一个钻取工具从所上述3个FTA卡上分别取下直径约2. Omm的圆片放进
81. 5mL离心管中；(5)在上述离心管中加入800 PL灭菌水，剧烈震荡3分钟；(6)取出离心管内的圆片即可用于核酸的扩增了。从上述过程中可以看出，采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法大约需要2个多 小时才能完成核酸制备，而采样本发明的快速核酸制备方法大约只需要6 10分钟就可以 完成核酸制备；所以与Whatman-FTA卡标准核酸制备方法相比，本发明的快速核酸制备方 法具有操作简单、快速的优点。实施例5已有Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制 备对虾病毒核酸的效果对比用实施例4中Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备 的对虾病毒核酸分别作为模板，进行等温扩增反应，每个扩增反应中含25 y L扩增反应液， 扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物1和下游引物1各1. 5 y M，扩增引物的上 游引物 2 和下游引物 2 各 0. 3 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 5mM, MgCl2 7mM, Betaine (甜 菜碱)1.3M，Tris-HCl 20mM, KC1 lOmM, MgS04 2mM, (NH4)2S04 lOmM, TritonX-100 0. 1%, 反转录酶2U，BstDNA聚合酶8U ；等温扩增反应条件为58°C保温60分钟，然后90°C保持 5分钟；最后将每个反应管中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果发现，利用本发 明快速核酸制备方法(制备核酸过程中采用了甲醇、无水乙醇和异丙醇等挥发性醇类作为 快速干燥液)制备的核酸均可以有效用作等温扩增反应的模板，并且扩增效果略好于采用 Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸的扩增效果。综上所述，本发明检测试剂盒及其检测方法不仅可以应用于养殖水体中IMNV的 检测，还可应用于对虾样品中IMNV的检测。本发明中所述的FTA膜片是英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片；将FTA 卡片裁切成尺度为长X宽不小于1毫米XI毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸 片即可制成FTA膜片。本发明的试剂盒所使用的试剂和材料引物由上海生物工程有限责任公司合成； 乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜碱(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、 KCl、MgS04、(NH4)2S04、MgCl2、Triton X-100购自上海生物工程有限责任公司；无水乙醇、甲 醇、异丙醇等购自国药集团化学试剂北京有限公司；等温扩增用的Bst DNA聚合酶、反转录 酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinder 购自厦门百维信生物科技有限公司。引物序列表<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>对虾传染性肌肉坏死病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法<160>4<210>1<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据对虾传染性肌肉坏死病毒RNA聚合酶基因序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作对虾传染性肌肉坏死病毒等温扩增检测的上游引物1<400>1ccacccctgg aatcgataga ttttaaatat ctagaattgc caaaacg 47<210>2<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据对虾传染性肌肉坏死病毒RNA聚合酶基因序列和等温扩增引物设计要 求而设计，用作对虾传染性肌肉坏死病毒等温扩增检测的下游引物1<400>2ttacctaacg gcaaattacc acttgtttta aggcaaaaac agctcttg 48<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据对虾传染性肌肉坏死病毒RNA聚合酶基因序列和等温扩增引物设计要 求而设计，用作对虾传染性肌肉坏死病毒等温扩增检测的上游引物2<400>3gagacacgtc agacaaagt19<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据对虾传染性肌肉坏死病毒RNA聚合酶基因序列和等温扩增引物设计要 求而设计，用作对虾传染性肌肉坏死病毒等温扩增检测的下游引物2<400>4agatcttttt ctgttgttca ctt2权利要求
一种对虾传染性肌肉坏死病毒现场快速高灵敏检测试剂盒，其特征是该检测试剂盒包括(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料；(5)阴性对照管，内装无对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了对虾传染性肌肉坏死病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液；(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述的核酸染料为分子生物学中应用的核酸 染料，包括但不限于 SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView 或 GeneFinder 。
3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的快速干燥液是亲水性且易挥发 的醇类物质。
4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述扩增检测管内的核酸染料粘附于 扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管管盖内侧。
5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的FTA膜片是由英国Whatman公 司用来制备核酸的FTA卡片裁切城的尺度不小于1平方毫米的纸片。
6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述的扩增反应液由以下组份组成 扩增引物的上游引物1和下游引物1各1 2 yM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各·0.1 0. 4 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmM, MgCl2 4 10mM，甜菜碱 0. 6 ·1.2M, Tris-HCl 10 40mM，KC1 10 20mM，MgS04 1 4mM，(NH4) 2S04 6 12mM，Triton X-100 0. 05% 1. 0%，反转录酶1 20U，具有链置换活性的DNA聚合酶2 20U。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于上述扩增反应液中的扩增引物的核酸 序列是上游引物 1 5 ‘ -CCACCCCTGGAATCGATAGATTTTAAATATCTAGAATTGCCAAAACG 下游引物 1 5 ‘ -TTACCTAACGGCAAATTACCACTTGTTTTAAGGCAAAAACAGCTCTTG 上游引物 2 5 ‘ -GAGACACGTCAGACAAAGT 下游引物 2 5 ‘ -AGATCTTTTTCTGTTGTTCACTT。
8.权利要求1所述检测试剂盒应用于检测对虾传染性肌肉坏死病毒。
9.使用权利要求1所述检测试剂盒检测对虾传染性肌肉坏死病毒的方法，其特征在于 该方法包括下列步骤(1)取样品对虾组织0.02 1. 0g置于采样管中，用研磨棒将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1 20min；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3 5min以洗涤FTA膜片；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置 于55 65 °C条件下保温40 70min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动l-3min，使扩增反应液与粘附于扩增检测管管壁或管；(7)向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部， 直接观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则表示该样品的对虾传染性肌肉坏死 病毒检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样品的对虾传染性肌肉坏死病 毒检测结果为阴性。
10.使用权利要求1所述检测试剂盒检测对虾养殖水体中传染性肌肉坏死病毒的方 法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用80目筛绢过滤海水，将过滤物用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置lOmin；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，57°C保温60min；(6)将扩增检测管上下反复甩动2min，使扩增反应液与管盖上的核酸染料充分混勻；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液聚于扩增检测 管底部，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的IMNV检测结果为阳性，如 果呈现橙黄色则表示该样品的IMNV检测结果为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种对虾传染性肌肉坏死病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒包括采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和核酸染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本发明的检测方法具有比RT-PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，且成本低，使用方便，检测更准确、快速、灵敏度极高，且对人和环境都非常安全，可以替代已有的相关检测方法。本发明不仅可在室内的实验室使用，也可在野外生产现场使用，对加强对虾传染性肌肉坏死病毒的流行病学监测、及对虾养殖水体监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。
文档编号C12Q1/68GK101921873SQ201010147949
公开日2010年12月22日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者刘莉, 宋晓玲, 张庆利, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所