专利名称：精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及瓜氨酸的制备方法，具体涉及一种利用本公司研发的精氨酸发酵菌种 Acl89-20所产生的含L-精氨酸发酵液经恶臭假单胞菌Ac88转化为L-瓜氨酸的方法。
背景技术：
L-瓜氨酸是一种具有广泛应用潜力的特种氨基酸，是公认的用途最广泛的天然氨基酸之一。它在人体内直接代谢产物为精氨酸(体内产生一氧化氮的唯一前体)，具有增强人体免疫力，维持关节健康、壮阳、平衡血糖、吸收有害自由基和降低胆固醇等功效，因而被广泛用于保健品或食品添加剂。现有的瓜氨酸的生产方法都是使用含有精氨酸脱亚氨基酶的菌体，例如粪肠球菌、恶臭假单胞菌等，使用游离菌体或者菌体固定化的方法把L-精氨酸成品转化为L-瓜氨酸，因而使瓜氨酸的成本受制于精氨酸成品的价格。目前还尚未见有直接发酵法生产瓜氨酸的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法。利用精氨酸发酵法和瓜氨酸酶转化法联合制备瓜氨酸是目前最接近于发酵法直接制备瓜氨酸的工艺路线，本发明由精氨酸的发酵液直接转化为瓜氨酸，从而合并了两种氨基酸的纯化过程，减少了纯化的损失，提高了产品收率，使得瓜氨酸的生产成本大大降低。本发明的精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法，利用含有精氨酸脱亚氨基酶的菌液投入含有精氨酸的发酵液，将发酵液中的精氨酸直接转化为瓜氨酸，最后分离纯化得到合格的瓜氨酸。具体包括以下步骤1)精氨酸发酵液的制备利用本公司研发的精氨酸发酵菌种Acl89_20，(谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，微生物保藏号CGMCC No. 3693，保藏时间2010年3月25日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)发酵产生含精氨酸60 80g/L的发酵液。其中，种子培养基配方葡萄糖3wt%, KH2PO4O. 05wt %, K2HPO4 · 3Η200· 15wt%, (ΝΗ4) 2S040. 5wt %、MgSO4 · 7H20 0. 04wt %、维生素 H (VH) 25 μ g/L、玉米菜(C. S. L) 3_5wt %、 酵母膏 0. 5wt%、脲 0. IOwt % ο发酵培养基配方葡萄糖12. 5wt%、(NH4)2S044wt%、脲 0. Iwt % ,KH2PO4O. 15wt%, K2HPO4 · 3H20 0. 05wt %、维生素 H(VH)50y g/L、VB1lmg/L、玉米浆(C. S. L)4wt %、酵母膏 0. 2wt%、泡敌(聚醚3010)万分之1 千分之1。发酵条件pH:6. 7 7.0，溶解氧20% 25% (以发酵前溶氧值为100%计)，流加补糖，发酵周期78小时，发酵液中精氨酸含量60 80g/L。2)含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体的培养
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利用本公司研发的菌种Ac88 (恶臭假单胞菌，Pseudomonas putida,微生物保藏号CGMCC No. 3694，保藏时间2010年3月25日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址背景市朝阳区北展西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)制备含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体。其中，培养基配方葡萄糖2wt %，蛋白胨Iwt %，酵母膏2wt %，精氨酸0. 5wt %，磷酸氢二铵0. 5wt %，磷酸二氢钾0. Iwt %。培养条件pH 6. 4，溶解氧5% 15% (以发酵前溶氧值为100%计)，发酵周期 30小时(包括种子罐)。菌体分离将上述培养好的发酵液，经0. 2μπι的陶瓷膜过滤器过滤，使湿菌体体积为总发酵液体积的20%，即得到含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体。3)精氨酸直接转化瓜氨酸将步骤2)得到的恶臭假单胞菌湿菌体按湿菌体对需转化的精氨酸发酵液 1 25 30体积比，投入步骤1)得到的含精氨酸的发酵液中，并加入总体积0.05衬％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为催化剂进行酶转化，即得到含有瓜氨酸的发酵液。转化条件:ρΗ 5. 5 6. 5，温度37°C，转化周期24小时。4)瓜氨酸产品的提纯将步骤3)得到的含瓜氨酸的发酵液，经过0. 2 μ m陶瓷膜过滤器过滤去除菌体， 清液经001X7阳离子交换树脂，瓜氨酸被交换至树脂上，树脂经清洗后用17wt%浓度氨水对树脂进行洗脱，洗脱液经浓缩驱除多于氨后，加入活性炭脱色，60°C真空浓缩至20 25wt%浓度，冷却至0 5°C结晶，经离心机分离结晶，结晶经60°C真空烘干，得到瓜氨酸纯品。本发明的优点是由精氨酸的发酵液直接转化为瓜氨酸，从而合并了两种氨基酸的纯化过程、提高了产品收率、大大降低了瓜氨酸的生产成本。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。下述实例中的原材料如果没有特殊说明，均购自上海国药集团试剂商店，规格为
化学纯。30L自控发酵罐购自上海保兴生物设备工程有限公司。往复式摇床购自上海世平实验设备有限公司型号SPH-331。HPLC型号为岛津1000。陶瓷膜过滤器为九五高科实验装置(膜过滤精度为0. 2 μ m)。实施例130L自控罐精氨基发酵过程利用本公司研发的精氨酸发酵菌种Acl89_20发酵产生含精氨酸60 80g/L的发酵液。其中，种子培养基葡萄糖 3wt %、KH2PO4O. 05wt %、K2HPO4 · 3H20 0. 15wt (NH4) 2S040. 5wt %、MgSO4 · 7H20 0. 04wt %、维生素 H (VH) 25 μ g/L、玉米浆 3_5wt %、酵母膏 0. 5wt% JlO. IOwt % ο
IOOOml摇瓶配置200ml培养液，共配置6瓶，接种后置于30°C环境内培养24小时， 往复式摇床摇转200r/min。发酵培养基初糖12. 5wt% JlO. IwtKH2PO4O. 15wt%,K2HPO4 · 3Η200· 05wt%, 维生素11作!1)5(^8/1、￥^11^/1、玉米浆(C. S. L)4wt%、酵母膏 0. 2wt%、泡敌(聚醚 3010) 万分之1 千分之1，补糖液中加酵母膏0. 3wt%,L-组氨酸0. 02wt% (均对初定容12L)。30L自控发酵罐，6个摇瓶并瓶后共1. 2L发酵种子液，接入发酵罐，68小时发酵后， 测得精氨酸含量为64g/L，pH 6. 6 6. 9，溶解氧控制在20% 25%，放罐体积17. 5L。实施例2恶臭假单胞菌菌体培养和浓缩利用本公司研发的菌种Ac88制备含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体。其中，培养基葡萄糖2wt %，蛋白胨Iwt %，酵母膏2wt %，精氨酸0. 5wt %，磷酸氢二铵 0. 5wt %，磷酸二氢钾 0. Iwt %。IOOOml摇瓶配置200ml发酵液，合计6瓶，接种后置于30°C环境内，往复式摇床， 转速200r/min，培养24小时。发酵液共计1. 2L，用本实验室陶瓷膜过滤器浓缩湿菌体到原体积20%的湿菌体 240ml ο实施例3精氨酸直接转化瓜氨酸将上述240ml湿菌液加入6L精氨酸发酵液中，盐酸调整pH至6. 0,并加入3. Ig CTAB。于37°C条件下转化24小时，得含瓜氨酸转化液6. 24L。实施例4瓜氨酸产品的提纯用陶瓷膜过滤器去除瓜氨酸转化液中的菌体，并在菌体浓缩到原体积20%时加入等体积洗水，共加入洗水3. 7L，然后弃浓菌液，得含瓜氨酸清液8. 7L，由HPLC外标法测定瓜氨酸含量为4wt% (收率90% )。取上述含量4衬％瓜氨酸发酵清液1. 5L，以25ml/min流速过流，直径55mmX400mm 的001X7树脂柱。随后用5L清水洗柱，配置17wt%浓度氨水溶液2L，以lOmin/min流速过柱，收集流出液从PH 5. O上升10. O段，共1.5L，60°C真空浓缩至300ml，加水至1000ml， 加入IOg活性炭40°C 2小时脱色后，滤除活性炭，清液浓缩至200ml，置于5°C冰箱过夜，抽滤瓶抽滤收集湿晶体，置于60°C真空烘箱烘干后得干晶体41. 5g( —次结晶收率69% )。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
权利要求
1.一种精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法，其特征在于，利用含有精氨酸脱亚氨基酶的菌液投入含有精氨酸的发酵液中，然后将发酵液中的精氨酸直接转化为瓜氨酸， 最后分离纯化得到合格的瓜氨酸，具体包括以下步骤1)精氨酸发酵液的制备利用本公司研发的精氨酸发酵菌种AC189-20，微生物保藏号CGMCC No. 3693，发酵产生精氨酸发酵液；2)含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体的培养利用本公司研发的菌种Ac88， 微生物保藏号CGMCC No. 3694，制备含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体；3)精氨酸直接转化瓜氨酸；4)瓜氨酸产品的提纯。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)的发酵条件为pH6. 7 7. 0，溶解氧20% 25%，流加补糖，发酵周期78小时，得到的发酵液中精氨酸含量为60 80g/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)的培养条件为pH6. 4，溶解氧5% 15%，发酵周期30小时，包括种子罐。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述溶解氧以发酵前溶氧值为 100%计。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤2)得到的恶臭假单胞菌湿菌体按湿菌体对需要转化的精氨酸发酵液1 25 30体积比，投入步骤1)得到的含精氨酸的发酵液中，并加入总体积0. 05wt%的十六烷基三甲基溴化铵作为催化剂进行酶转化，转化条件为pH 5. 5 6. 5，温度37°C，转化周期24小时，即得到含有瓜氨酸的发酵液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将含有瓜氨酸的发酵液经过滤除菌、 洗脱、脱色、浓缩结晶，离心分离，即制得纯品。
全文摘要
本发明公开了一种精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法，包括以下步骤1)利用本公司研发的精氨酸发酵菌种Ac189-20，微生物保藏号CGMCC No.3693，发酵产生含精氨酸60～80g/L的发酵液；2)利用本公司研发的菌种Ac88，微生物保藏号CGMCC No.3694，制备含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体；3)精氨酸直接转化瓜氨酸；4)瓜氨酸产品的提纯。本发明由精氨酸的发酵液直接转化为瓜氨酸，从而合并了两种氨基酸的纯化过程，减少了纯化的损失，提高了产品收率，使得瓜氨酸的生产成本大大降低。
文档编号C12P13/10GK102220390SQ20101014769
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者李文濂, 李炜 申请人:上海聚瑞生物技术有限公司