专利名称：快速筛选嗜热厌氧产乙醇微生物高产乙醇菌株的方法
技术领域：
本发明属于特定微生物生理性状的突变和化学诱变筛选领域，具体是采用定向进 化和化学诱变相结合的手段，对嗜热厌氧产乙醇微生物进行突变，通过显色反应，快速筛选 高产乙醇菌株。
背景技术：
随着全球经济的迅猛发展，石油、煤炭、天然气等不可再生能源日益耗竭，并且燃 烧化石能源排放的大量温室气体严重的破坏了生态环境([Cifuentes，L.，Borja-Aburto, V. H. , Gouveia, N. , Thurston, G. , Davis, D. L. 2001. Climate change. Hidden health benefits of greenhouse gas mitigation. Science 293,1257-1259·]、[Lashof, D. A., Ahuja, D. R. 1990. RelativeContributions of Greenhouse Gas Emissions to Global Warming. Nature 344，529-531.])，世界各国不得不努力开发并利用绿色低碳的可再生能 源。生物乙醇作为一种新型清洁能源([Hahn-Hagerdal，B.，Galbe, M.，Gorwa-Grauslund, M. F. ,Liden,G. ,Zacchi,G. 2006. Bio-ethanol—the fuel oftomorrow from the residues of today. Trends Biotechnol 24，549-556.])，正逐步作为动力燃料添加到汽油中，很大 程度上减少了人们对化石能源的依赖。美国和巴西是生物乙醇的主要生产国，由于使用玉 米、甘蔗等粮食作物作为原料，不仅存在与人争粮的问题，还需要大面积的毁林开荒种植原 材料([Timothy Searchinger,R. H. ,R. A. Houghton,Fengxia Dong. AmaniElobeid, Jacinto Fabiosa，Simla TokgoziDermot Hayes,Tun-Hsiang Yu. .2008. Use of U. S.Croplands for biofuels increases greenhouse gases throughemissions from land-use change.. Science. 319，1238-1240.])，经过几年的研究探索后，人们逐渐意识到必须大力发展以非 粮食作物为原料的生物乙醇。木质纤维素是世界上最丰富的可再生原料，纤维素乙醇正是利用了这些含有纤维 素、半纤维素的农林废弃物来发酵生产乙醇([Lynd，L. R. 1996. Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass -Technology,economics,the environment, and policy. Annual Review of Energy and theEnvironment 21,403-465·])。但是目前 在工业应用中碰到的主要问题是成本过高，究其原因是加工过程繁琐造成的，即首先需要 借助物理、化学或生物手段将纤维素降解为单糖，然后才能利用酵母等微生物发酵生产乙 醇。因而若能够将纤维素的水解过程和糖发酵过程整合在一起，必能缩短生产周期，降低生 产成本。联合生物加工(Consolidated Bioprocessing,CBP)技术解决了这一难题([Lynd， L. R. , van Zyl, W. H. , McBride, J. Ε. , Laser, Μ. 2005. Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass :an update. CurrOpin Biotechnol 16, 577-583.]),艮口在高温厌氧的 条件下，采用一种或者多种微生物混合发酵，降解纤维素产生还原糖的同时发酵生产乙醇， 一步就可将纤维素转化为乙醇。但该方法目前的瓶颈是乙醇产量太低，不能投入生产。诱 变筛选高产乙醇菌株是解决这个问题最直接有效的办法。目前高产乙醇菌株较为普遍的筛选方法是直接筛选乙醇耐受菌株，如酵母菌的高产乙醇菌株的筛选，通常采用化学或者紫外线诱变后涂布到高浓度乙醇平板上，然后挑 选能够耐受高浓度乙醇的克隆([(侯丽华，马平生。2007，一种构建酿酒酵母乙醇高产菌 株的方法。CN 101323837A.])，再从中筛选高产乙醇菌株。此方法工作量大，耗时长，筛 选效率低，而且不适合嗜热厌氧产乙醇微生物，原因是乙醇耐受性是制约酵母产醇的主要 因素，但对于嗜热厌氧产乙醇微生物，如嗜热厌氧产乙醇杆菌([Wiegel J.，L.L.G. 1981. Thermoanaerobacter ethanolicus gen. nov. ,spec.nov.,a new,extreme thennophilic, anaerobic bacterium. Arch Microbiol. 128，343-348.])，其胞内糖酵解途径的产物种类 很多，在低底物浓度的时候，主要发酵产物为乙醇，但底物浓度一旦超过(w/v)，发酵产 物则由乙醇转向乙酸和乳酸等副产物。由此可见，高底物浓度时副产物的累积是制约乙醇 产量的关键因素。为此，我们设计了如下两个筛选平板乙醇-TTC(2，3，5-三苯基氯化四 氮唑)显色平板和CaC03_高糖平板，以高效的筛选乙醇高产菌株。乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是乙醇生成途径中的关键酶，其活性的高低直接影响产物的产量，TTC 与ADH反应，生成红色物质，其颜色深浅与ADH活性成正比。乙醇-TTC显色平板可以筛选 出具有一定乙醇耐受性且ADH活性高的菌株。CaCO3可以和分泌到胞外的副产物乙酸、乳酸 生成可溶性的乙酸钙和乳酸钙，产酸越多消耗的CaCO3越多，CaCO3平板上形成的透明圈就 越大，即在相同菌落半径的情况下，透明圈直径的大小直接反映产酸的多少。CaCO3-高糖平 板可以筛选出高底物浓度下产酸少的菌株，为避免假阳性菌落，通过在菌落上滴加PH指示 剂提高筛选结果的可靠性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选乙醇高产菌株的方法。 本发明的创新性在于把乙醇适应性进化和化学诱变相结合，筛选乙醇耐受菌株， 并且在筛选方法上从产酸途径入手，联合了乙醇-TTC显色平板和CaC03-高糖平板，可在短 时间内筛选出具有一定乙醇耐受性、乙醇脱氢酶活力高、且在高底物浓度下产酸少的菌株， 并通过在菌落上滴加PH指示剂提高筛选结果的可靠性。从而改变公知技术中对酵母的高 产乙醇菌株的筛选，是将低的乙醇耐受性作为主要制约因素，此法工作量大，耗时长，筛选 效率低，且不适用于嗜热厌氧菌的缺陷。为实现上述目的，本发明提供的本发明快速筛选嗜热厌氧产乙醇微生物乙醇高产 菌株的方法，包括如下步骤1)将野生型菌株在含有乙醇的液体培养基中连续培养，定向进化嗜热厌氧产乙醇 微生物的乙醇耐受性；2)对耐受乙醇的菌株进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变，将诱变后的菌液涂布到含有 乙醇的固体培养基上；3)待形成单菌落后，选择菌落半径大的单菌落滴加2，3，5_三苯基氯化四氮唑 (TTC)显色液，用无菌牙签蘸取显色颜色深的单斑到含有高底物浓度的CaCO3平板上进行复 筛；4)选择菌落半径大但透明圈半径小的菌落，滴加pH指示剂排除假阳性；5)发酵后用气相色谱或乙醇定量试剂盒测定乙醇浓度，选择乙醇产量高的菌株在 非选择条件下培养至少20代，仍能保持高乙醇产量的菌株即为目的菌株。
所述的方法中，步骤1中的嗜热厌氧产乙醇微生物是指最适生长温度高于50°C、 严格或兼性厌氧、存在产酸和产乙醇代谢途径的革兰氏阳性菌，主要包括嗜热厌氧产 Zi If If lif (Thermoanaerobacter ethanolicus) ^^ ^m ^ BiMiMM (Thermoanaerobium brockii)、嗜热硫化氧梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)> 热纤梭菌 (Clostridium thermocellum)禾口嗜热角军糖梭菌(Clostridium thermosaccharoIyticum)。所述的方法中，步骤1中乙醇定向进化的耐受终浓度按体积浓度计为2% -15%。所述的方法中，步骤2中甲基磺酸乙酯工作浓度按体积浓度计为0. 1% -5%。所述的方法中，步骤3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑中乙醇终浓度按体积浓度计为 3% -16%。所述的方法中，步骤3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑浓度为l-100mg/ml。
所述的方法中，步骤3中复筛平板含有0. l-2g/L CaCO3, l-10g/L葡萄糖。所述的方法中，步骤5中非选择条件下培养至少20代仍能保持乙醇产量按体积浓 度计在2%以上。本发明采用定向进化和化学诱变相结合的手段，对嗜热厌氧产乙醇微生物进行突 变，通过显色反应，快速筛选乙醇高产菌株。本发明的方法适用于一切嗜热、厌氧并且存在 产酸和产乙醇代谢途径的革兰氏阳性细菌。本发明能够快速有效的筛选到高产乙醇菌株， 为生物乙醇工业提供优良菌株。
具体实施例方式以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任 何方式限制本发明。实施例(以嗜热厌氧产乙醇杆菌为例)1)定向进化乙醇耐受性将嗜热厌氧产乙醇杆菌按体积比1 10接种到已除氧的含(ν/ν)乙醇的RCM 培养基(配方见附件1)中，待菌液长浓后，再1 10接种到含(ν/ν)乙醇的RCM培养 基中，反复传5-10代后；将菌液1 10接种到含1.5% (ν/ν)乙醇的RCM培养基中，反复 传5-10代后；将菌液1 10接种到含2% (ν/ν)乙醇的RCM培养基中，反复传5-10代后； 将菌液1 10接种到含2. 5% (ν/ν)乙醇的RCM培养基中，反复传5-10代后，将菌液涂布 在含2. 5% (ν/ν)乙醇的RCM固体培养基上，挑取10-100个单克隆于含2. 5% (ν/ν)乙醇 的RCM培养基中，选取生长速度最快的克隆。附件1 不同种属的厌氧微生物培养基配方不同，RCM培养基仅适合嗜热厌氧产乙 醇杆菌(Themroanaerobacter ethanolicus)。对于特定的微生物，需要选用相应的培养基。 仅需要按照上述步骤在培养基中添加乙醇即可，下同。RCM培养基配制酵母膏3g/L，牛肉 膏10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉lg/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸盐酸盐0. 5g/L,NaCl 3g/ L，NaAc3g/L，琼脂0. 5g/L，刃天青2mg/L，加蒸馏水补至总体积为1L，调整pH值为6. 8，通队 除氧，115°C湿热灭菌15min。RCM固体培养基配制琼脂1. 25%，其它同RCM培养基。2) EMS诱变乙醇耐受菌株(1)将活化的嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇耐受菌株1 100接种到含IOml已除氧的 ATCC 1190培养基(配方见附件2)的Himgate-tube中，60°C培养箱中静置培养至OD6tltl值约 0.4。(2) 6，OOOrpm离心5min收集菌体，重悬于500 μ 1没有碳源的ATCCl 190培养基中， 取150 μ 1菌液重悬于3ml没有碳源的ATCC1190培养基中，60°C培养箱中静置培养2h。(3)在通风橱里，向菌液中加入 40 μ 1 EMS 和 100 μ 1 Tris-HCl (0. 1Μ, ρΗ7· 4，1 % 蔗糖)，漩涡震荡混勻后，60°C摇床震荡(120rpm)培养30分钟。(4)向菌液中加入150 μ 1 2Μ的Na2S2O3中止反应，6000rpm离心20min，弃上清， 用ATCC1190培养基洗两遍，重悬于500μ 1 ATCC1190培养基中。备注ATCC1190培养基 配制=KH2PO4L 5g/L, Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/L, NH4ClO. 5g/L, MgCl2 · 6H20 0. 18g/L，酵母浸 出物2. Og/L,葡萄糖5g/L，半胱氨酸盐酸盐0. lg/L，Na2S 0. lg/L，维生素溶液0. 5ml/L, Wolfe' s矿物盐溶液5. 0ml/L，刃天青(0. 1 % ) 1. 0ml/L，加蒸馏水补至总体积为1L，调整 PH值为7. 3，通队除氧，115°C湿热灭菌15min。附件2:会(500ml) :Biotin 20. Omg, p-Aminobenzoic acid 50. Omg, Folicacid 20. Omg, Pantothenic acid calcium salt 50. Omg, Nicotinic acid 50. Omg, Vitamin B12 1. Omg, Thiamine HCl 5. Omg, Pyridoxine hydrochloride 100. Omg, Thioctic acid 50. Omg, Riboflavin 5. Omg0Wolfe' s 矿物盐溶液(IL) :Nitrilotriacetic acid 1. 5g，MgSO4 · 7H20 3. Og, MnSO4 · H2O 500. Omg, NaCl 1. Og, FeSO4 · 7H20 100. Omg, Co(NO3)2 · 6H20100. Omg, CaCl2 100. Omg, ZnSO4 · 7H20 100. Omg, CuSO4 · 5H20 10. Omg, ALK(SO4)2 10. Omg, Boric acid 10. Omg, Na2MoO4 · 2H20 10. Omg, Na2SeO3L Omg。3)初筛乙醇高产菌株将EMS诱变后的菌液稀释1000倍，取50 μ 1涂布到含3% (ν/ν)乙醇的RCM固体 平板上，将平板倒置在无氧的厌氧罐中，于60°C培养箱中静置培养。待平板上形成单菌落 后，选择菌落半径大的单斑滴加10mg/ml的TTC溶液(pH7. 4，0. IM磷酸盐缓冲液，0. 22 μ m 滤膜过滤除菌)，显色10分钟后，挑取显色后呈深红色的菌落进行下一步复筛。4)复筛乙醇高产菌株用无菌牙签蘸取深红色菌落到复筛平板上，复筛平板为含有0.5g/LCaC0dni0g/L 葡萄糖的RCM固体平板，将平板倒置在无氧的厌氧罐中，60°C培养箱中静置培养，待平板上 形成单菌落后，挑取菌落半径大但透明圈半径小的菌落，滴加刚果红PH指示剂，选择偏红 色的单菌落；或者滴加甲基红PH指示剂，选择偏黄色的单菌落。刚果红pH指示剂配方称取刚果红0. 5g，溶解于100ml 10%的乙醇中(0. 22 μ m 滤膜过滤除菌)，变色范围是PH 3.0 5.0，颜色由蓝变红。甲基红pH指示剂配方称取甲 基红0. Ig,溶解于7. 4ml 0. 05mol/L的氢氧化钠溶液中，再加水稀释至200ml (0. 22 μ m滤膜 过滤除菌)，变色范围是PH4. 2 6. 3，颜色由红变黄。5)产物稳定性检测将筛选到的菌株和野生型菌株在含有lg/L葡萄糖的ATCC1190培养基中进行发酵 实验，60°C培养箱中静置培养60小时，取样用气相色谱测定乙醇浓度。将乙醇产量显著高 于野生型菌株的菌株连续培养20代，产量高且性状稳定的菌株即为乙醇高产菌株。利用上述方法可以在1个月之内得到乙醇耐受性6% (体积比)以上，产量3%(体积比)以上的高产乙醇的菌株。
权利要求
一种快速筛选嗜热厌氧产乙醇微生物高产乙醇菌株的方法，主要步骤如下1)将野生型菌株在含有乙醇的液体培养基中连续培养，定向进化嗜热厌氧产乙醇微生物的乙醇耐受性；2)对耐受乙醇的菌株进行甲基磺酸乙酯诱变，将诱变后的菌液涂布到含有乙醇的固体培养基上；3)待形成单菌落后，选择菌落半径大的单菌落滴加2，3，5-三苯基氯化四氮唑显色液，取显色颜色深的单斑到含有高底物浓度的CaCO3复筛平板上进行复筛；4)选择菌落半径大但透明圈半径小的菌落，滴加pH指示剂排除假阳性；5)发酵后用气相色谱或乙醇定量试剂盒测定乙醇浓度，选择乙醇产量高的菌株在非选择条件下培养至少20代，仍能保持高乙醇产量的菌株即为目的菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中的嗜热厌氧产乙醇微生物是指最适 生长温度高于50°C、严格或兼性厌氧、存在产酸和产乙醇代谢途径的革兰氏阳性菌，主 要包括嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜热厌氧细菌 (Thermoanaerobiumbrockii)、B誉热硫化M1 梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)、 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)禾口嗜热角军糖梭菌(Clostridiumthermosaccharoly ticum)ο
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中乙醇定向进化的耐受终浓度按体积浓度 计为 2% -15%。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2中甲基磺酸乙酯工作浓度按体积浓度计为 0. 1% -5%。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑中乙醇终浓 度按体积浓度计为3% -16%。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤3中2，3，5_三苯基氯化四氮唑浓度为 l-100mg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3中复筛平板含有0.l-2g/LCaC03, l-10g/L葡萄糖。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤5中非选择条件下培养至少20代仍能保持 乙醇产量按体积浓度计在2%以上。
全文摘要
一种快速筛选嗜热厌氧产乙醇微生物高产乙醇菌株的方法，主要步骤如下1)将野生型菌株在含有乙醇的液体培养基中连续培养，定向进化嗜热厌氧产乙醇微生物的乙醇耐受性；2)对耐受乙醇的菌株进行甲基磺酸乙酯诱变，将诱变后的菌液涂布到含有乙醇的固体培养基上；3)待形成单菌落后，选择菌落半径大的单菌落滴加2，3，5-三苯基氯化四氮唑显色液，取显色颜色深的单斑到含有高底物浓度的CaCO3复筛平板上进行复筛；4)选择菌落半径大但透明圈半径小的菌落，滴加pH指示剂排除假阳性；5)发酵后用气相色谱或乙醇定量试剂盒测定乙醇浓度，选择乙醇产量高的菌株在非选择条件下培养至少20代，仍能保持高乙醇产量的菌株即为目的菌株。
文档编号C12R1/145GK101845434SQ20101014912
公开日2010年9月29日 申请日期2010年4月19日 优先权日2010年4月19日
发明者宋厚辉, 徐健, 籍月彤 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所