专利名称：西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基。
背景技术：
单倍体是指具有配子染色体组成的孢子体。植物单倍体对植物遗传育种有重要意义，其主要用途如下①通过单倍体培养和染色体加倍可快速获得纯合系。在植物的育种过程中，传统的多代自交、回交法一般需5-6年或更长的时间才能获得相对纯合的自交系， 而用单倍体技术仅需要5-6个月的时间就可以获得纯合的材料，从而大大加速了选育的进程，缩短了育种的年限，较快地获得优良品种。②诱变单倍体可迅速发现隐性突变。单倍体培养获得的纯合植株，有利和不利的隐性突变基因都可以得到表达，进行离体诱变和抗性突变体筛选，可使选择效率大大提高。③单倍体技术还可用于固定亲本性状，使原来亲本更稳定均一。④理论研究。单倍体与二倍体杂交得到的非整倍体有助于解决测定连锁群、二倍体的染色体组成分和基因剂量的作用等一些问题。西瓜是葫芦科的重要瓜类作物之一。长期以来，西瓜花药培养研究倍受关注。薛光荣等(1982)对“琼酥”和“周至红”2个西瓜品种进行了花药培养，获得了单倍体植株，但其愈伤组织的诱导率仅为0.5%，育种难以利用。薛光荣等(薛光荣，余文炎等.1983.西瓜花药离体培养获得花粉植株.植物生理学通讯，NO. 4. 40-42)通过花药培养获得的花粉植株经过加倍得到了一个高产、抗病的西瓜优良品种。袁万良等(袁万良，付润民，雷保林， 曹小玲.1995.西瓜花培试验初报.陕西农业科学，1 :29-30.)改良培养基，解决了愈伤组织褐变死亡的问题，不仅将愈伤组织诱导率从0. 5%提高到94. 4，并且快速诱导出了绿色组织。魏瑛等(魏瑛，张俊莲，陈年来等.西瓜花药愈伤组织的诱导，甘肃农业大学学报， 1998)在“西农8号”和“京欣1号” 2个西瓜品种上，花药愈伤诱导率达到57. 7-62. 9%。 缑艳霞(缑艳霞2006西瓜花药离体培养技术研究，[硕士论文].杭州浙江大学)以3个品种“拿比特”、“春光”和“喜都”为材料，发现诱导培养基蔗糖60g/L、4°C下处理72h低温预处理或30°C高温预培养72h后置于25°C常温黑暗培养有助于提高西瓜花药愈伤组织的诱导率，诱导愈伤组织质地良好，但最终还是没有获得再生植株。研究还发现活性炭对西瓜花药愈伤组织的形成有抑制作用。李娟(李娟，张丽，李焕秀，宫国义，张海英，郭绍贵，许勇.2008.西瓜花药培养技术研究中国瓜菜，4 8-10)在西瓜品种261上，先高温(35°C )后常温(26-30°C )的变温培养，在诱导培养基MS+KT1. 5mg/L+6-BA2. Omg/L+NAAl. 5mg/L上愈伤诱导率最高达58. 63%,将愈伤转移愈伤增殖培养基MS+三十烷醇2. Omg/L+6-BAO. 5mg/ L上，培养5天出现深绿色点状组织，培养10天，愈伤生长迅速，分生旺盛，产生大量绿色组织，出现丛生芽。当丛生芽长至2cm左右时转至Ms+0.5mg/L IBA上生根。当成功诱导出根的时将其转入1/2MS+0. 2mg/LIBA+l. Omg/LIAA上，获得了植株，但未鉴定倍性，结果不明确。^ M /R Sari et al (Sari. N, Abak. K, Pitrat. Μ, et al. 1994. Induction ofparthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen inwatermelon. HortScience, 29 :1189_1190·)研究了 4个品种辐射花粉诱导单倍体技术(Y 射线，辐射剂量200或300Gy，剂量率0. 85Gy/min)，接种了 26个果实、13844粒种子，诱导了 761个胚。在诱导的胚中，球形胚占72.8%、心形胚占0.7%，其它26. 5%为坏死(17. 1% ) 或软化(9. 2%)的心形胚。在品种间百粒种子胚诱导率、百胚植株诱导率和千粒种子植株诱导率存在显著地差异。百粒种子胚诱导率的变异幅度为4.0%-14.2%，平均为5. 5% ； 百胚植株诱导率的变异幅度为1. 4% -3. 5%，平均为2. 2% ；千粒种子植株诱导率的变异幅度为0.6% -3. 1%，平均为1.2%。果实发育期对百粒种子胚诱导率、百胚植株诱导率和千粒种子植株诱导率也有显著地影响。尽管5个星期百粒种子胚诱导率最高(8.3%)，2-4个星的期变异幅度为3. 7% -7. 1%，但5个星期的百胚植株诱导率却最低(0. 5% )，2-4个星的期变异幅度为2. 4% -3. 4% ；5个星期的千粒种子植株诱导率也最低(0. 4% )，2-4个星的期变异幅度为1. -1.8%。辐射花粉诱导单倍体方法操做烦琐，费时费力，效率较低，且再生频率较低。为了解决瓜类花药培养以及辐射花粉授粉获得单倍体诱导率低的问题，研究者尝试展开瓜类未受精子房离体培养研究，以建立高效的单倍体技术。在西葫芦(陈学军，邢国明，陈竹军.西葫芦未授粉胚珠离体培养与植株再生.浙江农业学报，2000，12 (3) 165-167)、甜瓜(韩丽华.2004.厚皮甜瓜未受精胚珠离体培养技术[硕士论文].石家庄河北农业大学)和黄瓜(杜胜利.2001.利用生物技术创造黄瓜育种新材料方法研究.天津科技，2:627)均已获得了单倍体，其中在黄瓜上已达到育种应用水平。但迄今为止，西瓜离体雌核发育诱导单倍体研究未见公开报道
发明内容
本发明的目的在于提供一种胚状体诱导培养基，可应用于西瓜未授粉的子房培养形成胚状体。本发明提供的胚状体诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基细胞分裂素、生长素、碳源和凝胶剂；所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是0. l_2mg/L，所述生长素的终浓度是 0. 1-1. 5mg/L ；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。表1. MS基本培养液的溶质
权利要求
1.胚状体诱导培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基细胞分裂素、生长素、碳源和凝胶剂；所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是0. l_2mg/L，所述生长素的终浓度是 0. 1-1. 5mg/L ；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。
2.如权利要求1所述的胚状体诱导培养基，其特征在于所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素和生长素的终浓度分别是如下1)或2)或3)1)细胞分裂素为0.1-1. 5mg/L，生长素为0. Ι-lmg/L ；2)细胞分裂素为1.5-2mg/L，生长素为1-1. 5mg/L ；3)细胞分裂素为1.5mg/L，生长素为lmg/L。
3.如权利要求1或2所述的胚状体诱导培养基，其特征在于所述细胞分裂素是6-BA， 所述生长素是2，4-D。
4.如权利要求1-3中任一所述的胚状体诱导培养基，其特征在于所述碳源是蔗糖，所述蔗糖在所述胚状体诱导培养基的终浓度是30g/L ；所述凝胶剂是琼脂，所述琼脂在所述胚状体诱导培养基的终浓度是8g/L。
5.植物单倍体的生产方法，包括如下的步骤1)将植物未授粉的子房置于权利要求1-4中任一所述的胚状体诱导培养基中培养，得到胚状体；2)将步骤1)得到的胚状体置于丛生芽伸长培养基培养，得到丛生芽；3)将步骤2)得到的丛生芽置于生根培养基中培养，得到单倍体的再生植株。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述丛生芽伸长培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基6-BA、NAA、碳源和凝胶剂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述丛生芽伸长培养基中6-BA和NAA的终浓度是如下1)或2):1)6-BA的终浓度是0.1-0. 3mg/L，所述NAA的终浓度是0. 01-0. lmg/L ；2)6-BA的终浓度是0. 2mg/L,所述NAA的终浓度是0. 05mg/L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述碳源是蔗糖，所述蔗糖在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是30g/L ；所述凝胶剂是琼脂，所述琼脂在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是8g/L。
8.如权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述生根培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基IBA、碳源和凝胶剂；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述生根培养基中IBA的终浓度是0. 25-lmg/L。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述生根培养基中IBA的终浓度是0.5mg/ L ；所述碳源是蔗糖，所述蔗糖在所述生根培养基的终浓度是30g/L ；所述凝胶剂是琼脂，所述琼脂在所述生根培养基的终浓度是8g/L。
10.如权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选是葫芦科作物，更优选是西瓜。
全文摘要
本发明公开了一种西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基。本发明提供的专用培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基细胞分裂素、生长素、碳源和凝胶剂；所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是0.1-2mg/L，所述生长素的终浓度是0.1-1.5mg/L；所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。实验证明从上述专用培养基中的11个子房切片中共找到了3个体积膨大的胚状体可形成丛生芽R1、R2和R3。利用流式细胞仪检测分析可知所有来源于R2胚的再生植株的DNA相对含量在100附近，表明来源于R2胚的所有再生植株的倍性为单倍体。证明了利用未授粉胚珠离体培养获得西瓜单倍体的方法是可行的。
文档编号C12N5/04GK102239802SQ20101017818
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者宋晓华, 杨颖 , 沈文娟, 王建设, 裴晓利 申请人:北京市农林科学院