专利名称：一种嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子以及冷冻干燥方法
技术领域：
本发明涉及一种嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子以及冷冻干燥方法。
背景技术：
嗜酸乳杆菌是目前乳酸菌家族中极为重视研究与开发的益生菌之一，也是国内外 应用的微生态制剂的主要菌种之一。它广泛分布在人和动物体的消化道、阴道以及乳制品 和发酵的动植物制品中，是人体肠道中的重要微生物之一。嗜酸乳杆菌具有维持人体内微 生物生态平衡、促进消化、防癌抗癌、增强免疫力、抗衰老等功能，其在多种疾病治疗中的功 效显著。嗜酸乳杆菌高活性菌粉已广泛应用于保健食品，医药和食品等行业中，因此，制备 高活性菌粉具有广阔的商业前景。真空冷冻干燥技术是现代工业制备高活性菌粉常用的方法。然而，真空冷冻干燥 过程中会损伤微生物细胞，例如，冰晶引起的细胞损伤及细胞内外溶液引起的共晶损伤。共 晶是指溶液中未冻结的部分(水和溶质)同时冷冻为固体(水合物)的现象。Kristiansen 研究发现盐溶液中的脂质体冻结时，共晶的出现使脂质体损伤程度明显增加。共晶现象不 但对细胞膜产生机械损伤，同时还会损伤细胞内的活性物质。研究表明在冷冻干燥冻干过程中添加适当的保护剂能够有效保护菌体，提高菌 体存活率。但是，保护剂用量的增加必然降低菌粉的活性。因此，提高菌体本身抗冷冻能力 才是解决这一问题的关键。在发酵液中添加一些物质能够改变细胞液和细胞膜的成分(小 分子物质进入细胞液中，大分子物质粘附在细胞膜上)，抑制冷冻干燥过程中共晶现象的发 生，有效提高菌体坑冷冻能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子以及冷冻干 燥方法，添加该复合抗冷冻因子于培养基中培养得到的嗜酸乳杆菌，其存活率可以提高两 倍以上。为实现上述目的，本发明提供了一种嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其配方组成为 甘油2-6mL/L、氯化钠2-8g/L、海藻糖0_4g/L、丙氨酸0_0. 8g/L。为实现上述目的，本发明还提供了一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥方法提供复合抗冷 冻因子，组成为甘油2-6mL/L、氯化钠2-8g/L、海藻糖0_4g/L、丙氨酸0_0. 8g/L ；将该复合 冷冻因子添加至无菌的MRS培养基中培养嗜酸乳杆菌；离心收集菌体后，用生理盐水清洗 菌体；用生理盐水将菌体配制成菌悬液后，将菌悬液与保护剂按照体积比为1 3混合均 勻；最后进行冷冻干燥。本发明与现有技术相比，至少具有以下优点在培养基中添加本发明的复合抗冷 冻因子后，可以使嗜酸乳杆菌在冷冻干燥过程中的存活率高达82. 75%，而如果没有添加该 复合抗冷冻因子，则菌体在冷冻干燥过程中的存活率仅40. 67%，因此，在培养基中添加本 发明抗冷冻因子，可以将菌体在冷冻干燥过程中的存活率提高两倍以上。
具体实施例方式将微孔滤膜除菌的复合抗冷冻因子添加到无菌的MRS培养基中，培养嗜酸乳杆 菌24h，在转速为6000r/min的条件下离心IOmin收集菌体，随后，用生理盐水清洗菌体2 次，离心弃去上清液；用生理盐水将菌体配制成8士0. 5X 101(lCfU/mL的菌悬液，按照体积比 为1 3将菌悬液与保护剂溶液(脱脂奶粉100g/L，蔗糖5g/L，抗坏血酸0. lg/L，氯化钠 8. 5g/L的水溶液)混合均勻，装于冻干管中，装样高度为0. 3-0. 5cm，室温下静止30min后， 放入_35°C冰箱中预冻24h后，放入真空冷冻干燥机中，于温度为_56°C，真空度为4_6Pa的 条件下冻干24h ；用生理盐水复溶，MRS固体培养基计数，测定菌体存活率和菌粉活性。对添加不同配比的抗冷冻因子于发酵液中培养得到的菌体进行冻干的存活率的 验证结果如表1 表1添加不同配比的复合抗冷冻因子发酵得到的菌体进行冻干的存活率的验证 结果 由上述表格可知，当发酵液中不添加复合抗冷冻因子时，冻干制备菌粉，其菌体存 活率仅40. 67% ；而发酵液中添加本发明复合抗冷冻因子，冻干制备菌粉，其菌体的存活率 至少在60. 73%以上，其中，当其组成为甘油4mL/L、氯化钠4g/L、海藻糖4g/L、丙氨酸 0. 4g/L时，其菌体存活率最高，达到82. 75%，与不添加复合抗冷冻因子相比，提高了两倍 多，切菌粉活性可达lXlO^cfu/g以上。以上所述仅为本发明的一种实施方式，不是全部或唯一的实施方式，本领域普通 技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明 的权利要求所涵盖。
权利要求
一种嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油2-6mL/L、氯化钠2-8g/L、海藻糖0-4g/L、丙氨酸0-0.8g/L。
2.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油 4mL/L、氯化钠4g/L、海藻糖4g/L、丙氨酸0. 4g/L。
3.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油 6mL/L、氯化钠8g/L、海藻糖4g/L、丙氨酸0. 6g/L。
4.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油 6mL/L、氯化钠6g/L、海藻糖2g/L、丙氨酸0. 3g/L。
5.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油 2mL/L、氯化钠4g/L、海藻糖4g/L、丙氨酸0. 8g/L。
6.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油 3mL/L、氯化钠4g/L、海藻糖2g/L、丙氨酸0. 3g/L。
7.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油 2mL/L、氯化钠2g/L、海藻糖2g/L、丙氨酸0. 4g/L。
8.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子，其特征在于其配方组成为甘油 4mL/L、氯化钠 4. 5g/L。
9.一种嗜酸乳杆菌冷冻干燥方法，其特征在于提供复合抗冷冻因子，组成为甘油 2-6mL/L、氯化钠2-8g/L、海藻糖0_4g/L、丙氨酸0-0. 8g/L ；将该复合冷冻因子添加至无菌 的MRS培养基中培养嗜酸乳杆菌；离心收集菌体后，用生理盐水清洗菌体；用生理盐水将菌 体配制成菌悬液后，将菌悬液与保护剂按照体积比为1 3混合均勻；最后进行冷冻干燥。
10.如权利要求9所述的嗜酸乳杆菌冷冻干燥方法，其特征在于所述保护剂的组分 为脱脂奶粉100g/L、蔗糖5g/L、抗坏血酸0. lg/L、氯化钠8. 5g/L。
全文摘要
本发明提供了一种嗜酸乳杆菌复合抗冷冻因子以及冷冻干燥方法，复合抗冷冻因子的配方组成为甘油2-6mL/L、氯化钠2-8g/L、海藻糖0-4g/L、丙氨酸0-0.8g/L。方法为将上述复合抗冷冻因子添加到培养基中培养嗜酸乳杆菌；离心收集菌体后，用生理盐水清洗菌体，离心弃去清夜；用生理盐水将菌体配制成菌悬液后，将菌悬液与保护剂混合均匀，最后进行冷冻干燥。将本发明抗冷冻因子冻干直接添加至培养基制备嗜酸乳杆菌菌粉，冻干后菌体存活率最高可达82.75％，菌粉活性可达1×1011cfu/g以上，与不添加该抗冷冻因子冻干制备菌粉存活率(40.67％)相比，其存活率提高了2倍多。
文档编号C12N1/20GK101870960SQ201010207358
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者王磊, 王长风, 石教锋, 舒国伟, 陈合 申请人:陕西科技大学