专利名称：番鸭细小新型疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及番鸭细小新型疫苗的制备方法。
背景技术：
番鸭细小病毒病(俗称“三周病”)是1987年在我省首先发现的1-3周龄番鸭以 喘泻为临床症状的一种新疫病。该病主要侵害7-21日龄的雏番鸭，发病率27-62%和病死 率22-43%，病愈鸭大部分成为僵鸭，给番鸭业造成很大经济损失。在该病病原、诊断和防 治研究方面，我所均居于国际同类研究的领先水平。我们在国内外首先分离、鉴定了番鸭细 小病毒(MPV)，确认MPV是番鸭细小病毒病的病原，是细小病毒科细小病毒属的新成员，丰 富了动物病毒学内容。在此基础上建立并制备了 5株单抗，应用其中一株单抗致敏聚苯乙 烯胶乳，在国内外率先建立了胶乳凝集(LPA)和凝集抑制试验(LPAI)检测病毒和抗体；同 时利用生物技术选育出符合制造活疫苗用的弱毒株，制备的疫苗可有效预防番鸭细小病毒 病。“番鸭细小病毒病活疫苗”和“番鸭细小病毒病诊断试剂”于2000年分别获得国家一类 新兽药证书。番鸭小鹅瘟病是1997年以来在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流行，目 前全国各养鸭地区均有发生。临床上雏番鸭发生以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征，发病 率50-70%、病死率40-65%。使用各种抗菌素、番鸭细小病毒疫苗及高免卵黄抗体等均不 能控制病情，给养鸭业造成较大经济损失。为有效防制该病，我们开展了病原、诊断和防治 研究自1997年该病在福建省番鸭饲养区流行以来，我们已先后从发病番鸭脏器中分离到 8株番鸭源鹅细小病毒，并进行了全面系统的鉴定，确认该病毒为番鸭小鹅瘟病病毒，在临 床上该病常与番鸭细小病毒病混合感染，危害极大，人工感染或临床上均发现其发病率和 死亡率都高于番鸭细小病毒病。在此基础上，我们选育成番鸭小鹅瘟病病毒细胞适应弱毒 株并研制成番鸭小鹅瘟病弱毒疫苗，可有效预防该病。番鸭细小病毒病和番鸭小鹅瘟病均是番鸭的重要传染病，应用疫苗可有效预防这 二病的发生，为了减少人力物力和减少因多次免疫注射对鸭群造成的不良应激反应，我们 又研制出番鸭细小新型疫苗，1-2日龄雏番鸭免疫1次即可终生预防番鸭细小病毒病和番 鸭小鹅瘟病。
发明内容
本发明的目的是提供番鸭细小新型疫苗的制备方法，本发明是通过如下技术方案 来实现的一种来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)，保藏在CCTCC，保藏 日2010年6月2日，保藏编号:CCTCCN0 :V201013。一种来源于人工致弱的番鸭源鹅细小病毒弱毒D株(GPV-D株)，保藏在CCTCC，保 藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCC NO :V201014。将上述的番鸭细小病毒弱毒Pl株和番鸭源鹅细小病毒弱毒D株应用于制备番鸭细小新型疫苗。本发明以番鸭细小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)和番鸭源鹅细小病毒弱毒D株 (GPV-D株)为种毒，应用番鸭胚成纤维细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当 比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥，研制成遗传性稳定、安全性好、免疫原性强且成本低的 番鸭细小新型疫苗，达到一次接种即可同时预防和控制两种疫病的目的。本发明适于GMP 条件下大规模生产番鸭细小新型疫苗。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进一步说明。(但不是对本发明的限制)。来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)，是利用番鸭胚和番 鸭胚成纤维细胞交替传代等生物技术人工选育致弱而成，已失去对一日龄雏番鸭的致病 性，并具有如下特性(1)病毒效价=MPV-Pl株经尿囊腔接种12日龄番鸭胚，其ELD5tl应 彡IO-4 VO. Iml ；对番鸭胚成纤维单层细胞TCID5tl彡10_5_°/0. Iml ； (2)安全性用1日龄健康 易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射毒种原液0. 2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫 原性一日龄健康敏感雏番鸭，腿部肌肉注射0.2毫升，其最小免疫量为100TCID5(i/0. 2ml ； (4)病毒增殖选用MDEF增殖培养MPV-Pl，同步接种量为培养液量的1 %，37°C旋转培养至 细胞病变达75%以上的时间为4 5天。MPV-Pl株保藏在中国典型培养物保藏中心(或 简称CCTCC)，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCCNO :V201013。来源于人工致弱的番鸭源鹅细小病毒弱毒D株(GPV-D株)，是利用番鸭胚成纤维 细胞变量交互传代选育致弱而成，已失去对一日龄雏番鸭的致病性，并具有如下特性(1) 病毒效价GPV-D株对番鸭胚成纤维单层细胞TCID50彡10_4 5/0. Iml ；LPA效价达23 ； (2)安 全性用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射毒种原液0. 2毫升，观察20天，应 全部存活；(3)免疫原性一日龄健康敏感雏番鸭，腿部肌肉注射0. 2毫升，其最小免疫量为 300TCID50/0. 2ml ； (4)病毒增殖选用MDEF增殖培养GPV-D ；同步接种量为培养液量的1 %， 37°C旋转培养至细胞病变达75%以上的时间为4 5天。GPV-D株保藏在CCTCC，保藏日 2010 年 6 月 2 日，保藏编号 CCTCC NO :V201014。将上述的番鸭细小病毒弱毒Pl株和番鸭源鹅细小病毒弱毒D株应用于番鸭细小 新型疫苗的制备方法(I)MPV-Pl株增殖，将MPV-Pl株种毒按培养液量的1 %同步接种番鸭胚成纤维细 胞(MDEF)，37°C旋转培养至细胞病变达75%以上，收获MPV-Pl细胞毒。(2) GPV-D株增殖，将GPV-D株种毒按培养液量的1 %同步接种番鸭胚成纤维细胞 (MDEF)，37°C旋转培养至细胞病变达75%以上，收获GPV-D细胞毒。(3)病毒含量TCID5tl测定，MPV-Pl和GPV-D对番鸭胚成纤维单层细胞TCID50分 别彡IO-4 Vo. Iml和彡10_4 70· Iml以上时，可用于配制疫苗。(4)疫苗配制，将MPV-Pl和 GPV-D按1 1 1.5的比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥而成。如何降低生产成本和提高免疫效果是本发明要解决的关键技术，为此，本发明进 一步采取如下措施(1)细胞培养液取0. 5%乳汉液加等量DMEM液，内含3%小牛血清、青霉素和链 霉素各100单位/ml，并以7. 5% NaHCO3调pH为7. 4-7. 6。
(2)番鸭胚成纤维细胞制备取孵育17日龄发育良好的番鸭胚，在检卵灯上用笔 划出气室。置于蛋盘上，先用2%碘酒再用75%酒精消毒蛋壳气室，无菌取出胚胎，去头、四 肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿内，用Hank’ s液洗涤胚体，用灭菌的剪刀剪成2 3mm组 织小块，倒入灭菌三角消化瓶中，再用Hank，s液洗2 3次，加入37°C的0. 25%胰酶(每 个胚8 IOml)，放在恒温(37°C )磁力搅拌器上低速搅拌30分钟后，静置5分钟，使组织 块沉下，上层细胞悬液倒入500ml灭菌玻璃瓶中，玻璃瓶置于冰浴中。消化瓶中的组织块再 加适量的0. 25%胰酶，同上重复消化3 4次，组织块呈棉絮状时，即停止消化。细胞悬液 用4层灭菌纱布过滤后，分装250 500ml灭菌离心瓶(管)中，于4°C 8°C低速(800 1000转/分)离心15 20分种，弃上清液。每个离心瓶的细胞沉淀块，用3 5ml含5% 小牛血清的培养液吹散，收集各个离心瓶(管)中浓缩的细胞悬液于IOOml玻璃瓶中，计数 每亳升含细胞数，用细胞培养液将浓缩细胞悬液稀释成每毫升含150 180万活细胞。备 用。(3)病毒增殖番鸭胚成纤维细胞分别同步接种MPV-Pl和GPV-D种毒，接种量为 培养液量的1%，混勻后置37°C旋转培养，转速为每小时9 11转。每天观察细胞2次，当 75%以上细胞出现病变(细胞病变为细胞折光性增强，细胞圆缩)时，把培养瓶置-20°C冻存。(4)疫苗免疫学指标测定4. 1无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，应无菌生长。4. 2病毒含量测定分别在MDEF单层96孔板上进行，每稀释度接4孔，0. IML/孔， 置 C026. 0、37°C 条件下培养，观察 7 天，计算 TCID5tl。MPV-Pl 应彡 105'5TCID50/ml 和 GPV-D 应 彡 105 0TCID50/mL·4. 3安全检验用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射10倍量的疫苗， 观察20天，接种鸭均未见饮食欲和精神异常，且生长发育良好，全部存活。4. 4效力检验从表1可知，一日龄易感雏番鸭腿肌接种1羽份疫苗，并于接种后7 天连同不免疫对照组采血分离血清，供LPAI抗体效价测定；同时分别攻击MPV和GPV强毒， 每组10羽。结果显示免疫鸭均可抵抗同源强毒的攻击，保护率分别达100%和87. 5%;同 时攻毒前免疫鸭血清中MPV-LPAI抗体和GPV-LPAI抗体分别达2_2 2和2_2 3，而对照鸭为2°_6 以下。表1 一日龄雏番鸭疫苗免疫后对同源强毒的保护率测定 4. 5免疫产生期和免疫持续期测定从表2可知，免疫后7天LPAI抗体水平均在 22_°以上，并能抵抗强毒攻击，且一直持续至免疫后80天即87日龄，此时已达到或超过番鸭 出栏日龄。结果表明一日龄雏番鸭免疫1次即可终生保护，也意味着1次免疫注射可同时预防番鸭细小病毒病和小鹅瘟病，不仅减少人力物力，也减少因多次免疫注射导致的应激 反应。表2 —日龄雏番鸭疫苗免疫后血清中抗体水平动态变化
3.64. 6疫苗免疫后抗MPV LPAI抗体水平与攻毒保护相关性从表3可知，1日龄雏 番鸭免疫注射疫苗后7天测定抗MPV LPAI抗体效价，同时攻击MPV强毒。结果抗体效价在 2"1以上，对MPV攻毒保护率为100%抗体效价〈2—1，其发病率62. 5%，死亡率33. 3%，证明 LPAI效价与保护力呈正相关。同时，用LPAI方法测定MPV抗体效价可以代替疫苗效力检验 用强毒攻击的方法，既简便，又可防止强毒扩散。表3疫苗免疫注射后7天番鸭血清中抗MPV LPAI效价与保护力的关系* 4. 7疫苗免疫后抗GPV LPAI抗体水平与攻毒保护相关性从表4可知，1日龄雏 番鸭免疫注射疫苗后7天测定抗GPV LPAI抗体效价，同时攻击GPV强毒。结果抗体效价在 2_2以上，对GPV攻毒保护率为100% ；抗体效价在2—1，其发病率13%，死亡率0 ；抗体效价 < 2—1，其发病率70%，死亡率35%;证明LPAI效价与保护力呈正相关。同时，用LPAI方法 测定GPV抗体效价可以代替疫苗效力检验用强毒攻击的方法，既简便，又可防止强毒扩散。表4疫苗免疫注射后7天番鸭血清中抗GPV LPAI效价与保护力的关系* 4. 8临床应用效果评价在试验鸭场共免疫注射5000多羽份一日龄雏番鸭，跟踪 观察20d，未见免疫鸭出现不良反应；且免疫组成活率达95%以上，明显高于对照组(成活 率68% )。进一步证明该疫苗安全、有效，可用于临床上预防番鸭细小病毒病和小鹅瘟病。
权利要求
来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒P1株，保藏在CCTCC，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCC NOV201013。
2.来源于人工致弱的番鸭源鹅细小病毒弱毒D株，保藏在CCTCC，保藏日2010年6月 2 日，保藏编号=CCTCC NO :V201014o
3.用权利要求1所述的番鸭细小病毒弱毒Pl株和权利要求2所述的番鸭源鹅细小病 毒弱毒D株在制备番鸭细小新型疫苗上的应用。
全文摘要
本发明涉及番鸭细小新型疫苗的制备方法以番鸭细小病毒弱毒P1株(MPV-P1株，保藏编号CCTCC NOV201013)和番鸭源鹅细小病毒弱毒D株(GPV-D株，保藏编号CCTCC NOV201014)为种毒，应用番鸭胚成纤维细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥，研制成安全有效的番鸭细小新型疫苗，雏番鸭一次接种即可同时预防和控制番鸭细小病毒病和番鸭小鹅瘟病，解决了因多次免疫接种造成番鸭的应激反应。本发明适合于GMP条件下的规模化生产，且节省了疫苗生产成本。
文档编号C12R1/93GK101880651SQ201010215818
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月1日 优先权日2010年7月1日
发明者朱小丽, 林天龙, 林锋强, 王劭, 程晓霞, 程由铨, 胡奇林, 陈仕龙, 陈少莺 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所