专利名称：一个控制番茄茸毛发生的关键基因Wo的克隆及应用的制作方法
技术领域：
本专利属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个控制番茄茸毛发生的关键基因 Wo的克隆，功能鉴定及应用。该基因在调节番茄茸毛的数量和类型等方面具有显著的功能， 可以在番茄抗虫，抗病毒等方面进行应用。该基因纯合后可以导致胚胎致死，也是番茄胚胎 发育的关键基因。
背景技术：
利用植物体表皮茸毛组织结构作为植物抵抗、驱逐植食性害虫是植物进化过程中 形成的防御机制之一。植物表皮毛是一种特化的单细胞或多细胞表皮结构，包括腺体茸毛 和非腺体茸毛，是研究植物细胞分化调控的一种模式材料。表皮茸毛作为植物防御的第一 道屏障，通过空间障碍和分泌次生代谢物，可延缓、驱逐、毒杀植食性害虫危害，同时间接防 止害虫携带的病毒的侵染。番茄多茸毛突变体(Wo)具有这样的一些功能，同时该基因纯合 (Woffo)后导致胚胎致死，其杂合子(Wowo)则能正常发育。在植物中这种自发形成的半显性 致死基因相当少见，因此番茄茸毛基因的研究既具有揭示茸毛基因与胚胎发育内在关系的 理论意义，又有对番茄遗传育种的实际应用价值。番茄中的表皮茸毛分为7种类型其中I、IV、VI、VII型属于有腺体类型；11、111、 V型属于无腺体类型(Luckwill，1943)。Serna等(2006)认为番茄7种类型的茸毛可能具 有不同的调控途径。番茄单基因(Woolly，Wo)突变体导致多种类型的茸毛密度增加，这说 明不同类型茸毛的发育调控具有共同的调控因子。番茄多茸毛突变体最先在美国的新泽 西州发现，Porte获得这一突变体并将这一性状命名为Angora，Young和Arthur (1947)从 Porte处获得这一材料并将这一多茸毛性状更名为Woolly (Wo)。目前为止，在番茄遗传资 源中心(TGRC)收集了 17种有关Wo基因的突变体材料(共有4个位点突变造成)，包括纯 合致死和纯合可育两种类型，其中，W0__、Wov、Womz为纯合致死突变，Wom为纯合可育突变。这 为我们研究该基因的功能提供了丰富的种质资源。在番茄种质材料中，普通番茄品种体表茸毛稀少，而多毛突变体植株体表茸毛密 集，从而具有抗虫防病毒的特性(图1)。在番茄育种中已成功利用了多茸毛对蚜虫和黄瓜 花叶病毒(CMV)的抵抗特性，培育出多个抗性品种。例如，我国目前栽培面积较大的番茄Fl 品种-毛粉802，总呈现多毛和少毛两种表型植株(呈1 1分离)，在生产上我们只需要 保留多茸毛植株，而汰除不具备抗蚜虫特性的少茸毛植株(占50%)，就可以达到抗虫防病 毒的效果。Rick和Butler(1956)利用形态标记将Wo基因定位于第二条染色体长臂的中间区 段。Tanksley (1992)绘制的番茄遗传图谱显示，Wo基因位于基因prx_2下部，prx-2与标 记CT38处于相同的染色体位置，即Wo基因位于标记CT38下部。番茄第二条染色体上CT38 下部共有161个分子标记，包括8个SSR标记、65个CAPs标记、87个AFLP标记和1个SNP 标记(Tomato-EXPEN2000)。从番茄第二条染色体ILs图谱可以看出标记CT38位于IL2-3 上。由此推断Wo基因位于IL2-3和IL2-5上。至于番茄茸毛基因Wo的精细定位、分离和克隆，茸毛分化发育的调控途径以及导致纯合胚胎致死的原因还没有进行过深入的研究报道。目前，关于植物茸毛发育的研究有很多，主要集中在拟南芥和棉花两种植物。拟 南芥(Arabidopsisthaliana)表皮毛是一种单细胞非腺体茸毛，广泛分布于叶片、茎、叶、 花瓣和根的表面，是研究植物细胞命运调控的一种模式植物。大量茸毛相关突变体的获 得及相关基因的定位克隆及功能分析，其茸毛分化发育的调控机制已经了解得比较清楚。 Kryvych等(2008)对拟南芥的茸毛表达基因进行了 EST分析。GLl是拟南芥中最早克隆到 的控制表皮毛发育的关键基因，它编码一种R2R3MYB转录因子，由228个氨基酸组成，含有 3个外显子和2个内含子，3'端存在一段增强子序列，MYB结构域与HLH蛋白GLABRA3 (GL3) 和EGL3的N端相接合。TRANSPARENT TESTA GLABRA 1 (TTGl)是另外一个调控茸毛发育的 关键基因，它编码一个具有四个保守WD重复结构的蛋白，也能与HLH蛋白GLABRA3(GL3) 和EGL3相接合进而与MYB蛋白发生作用。GLl、GL3、EGL3和TTGl形成复合物共同调节茸 毛的发育。四个单重复 MYB 蛋白 CAI3RICE(CPC)、TRIPTYCHON(TRY)、ENHANCER OF TRY AND CPCl (ETCl)和ETC2影响GLl蛋白的活性，其中CPC和TRY与bHLH蛋白(GL3和EGL3)的 N端相互作用，ETCl与EGL3相互作用。TRY、CPC和ETCl与GLl竞争bHLH蛋白，抑制GLl、 GL3、EGL3、TTG1复合物的形成，从而阻止该细胞选择茸毛的命运(图2)。另一个研究较多的是棉花(Gossypium arboretum)，棉花的棉纤维是一种单细胞 非腺体茸毛。Wang等(2004)克隆到一个在纤维细胞发育早期高度表达的基因一 GaMYB2，它 属于R2R3MYB家族。该基因在GLl基因启动子的作用下能够恢复gll突变体的表型，在35S 启动子的作用下能诱导拟南芥的种子生成茸毛。另外一个在发育中的棉纤维细胞高度表达 的基因GhMYB109，也是属于R2R3 MYB家族。GaMYB2和GhMYB109均含有与bHLH蛋白相结 合的模体。后来，在棉花中已克隆到两个编码WD重复蛋白，并且具有与拟南芥中TTGl相似 的功能，能够恢复突变体(ttgl)的表型。棉花也可能是通过与拟南芥相似的复合物一MYB、 bHLH和WD来调控棉纤维细胞的发育。Serna等(2006)将这些调控茸毛分化的MYB相关基因进行了聚类分析，发现拟南 芥茸毛调控基因GLl、AtMYB23与棉花纤维调控基因GhMYB 109、GaMYB2属于同一进化分支， 这两种植物均为Rosids ；而金鱼草茸毛调控基因MIXTA、AmMYBMLl和矮牵牛茸毛调控基因 PhMYBl属于同一进化分支，这两种植物包括番茄均为Asterids。可见，Asteroids类植物 与Rosids类植物具有不同的茸毛调控途径。茸毛作为植物体与环境直接接触的组织结构，它的防虫抗虫作用已经被越来越多 的人认识到。Chu等(1999)的茸毛密度-白粉虱相关性研究表明，高密度茸毛植株上的 虫卵和幼虫明显少于低密度植株。Gurr等(2002)用乙醇溶液去除腺体表面次级分泌物， 降低了马铃薯夜蛾的死亡率。番茄中的次生代谢物姜烯对节肢动物有明显的抗性，Maluf 等(2001)的研究表明，茸毛密度与姜烯的含量高低密切相关。现在以植物的茸毛结构作 为生物反应器，利用基因工程技术提高或抑制次生代谢物生物途径中关键酶的表达量，从 而获得高含次生代谢物的转基因植株。但是，由于次级代谢物的调控途径非常复杂，其在 植物体内的含量不仅受转录水平的调控，而且转录后修饰、蛋白质水平以及转运过程都对 其含量有很大的影响。另外，次级代谢物在不同物种中、不同的环境条件下，其含量均会 受到影响(Verpoorte R.，2002)。单独改变一个或几个基因的表达量往往不会提高目的次级代谢物的含量。这种方法很难用于植物的抗性育种。目前仅见到Wagner等(2001) 有过相关的报道，他们通过抑制茸毛特异基因一P450羟化酶基因的表达，显著提高了 Cembratriene-ol (CBT-ol)的含量，减少了蚜虫的危害。如果我们能够在番茄中克隆到调节 茸毛分化发育的关键基因，像拟南芥中的GLl和TTG1，通过增加番茄体表茸毛密度来增加 抗性则是一种更加有效的方法。番茄多茸毛突变体给我们提供了这样的材料。在番茄生产实践中，由于多茸毛突变体材料存在着纯合子胚致死效应而使其难以 育成纯合稳定的亲本株系，而少毛植株的自交后代少毛性状不再发生分离。这显示番茄茸 毛发生与胚胎致死存在一定的因果关系，表明多茸毛基因不仅具有调控多细胞茸毛发育的 功能，而且纯合(WoWo)后会导致番茄胚胎的死亡。已有的研究报道均表明多茸毛基因Wo与 导致胚胎纯合致死的是同一基因。Wo基因纯合会导致番茄胚胎败育的现象引起了很多研究 人员的关注。研究人员对多茸毛植株的种子作了发芽实验，大约有25%的种子不能发芽，并 对这些不发芽的种子作了解剖学上的观察，发现这些种子均含有正常发育的胚乳和败育的 胚胎。这说明致死作用不是由胚乳发育不良引起的(Shilling，1959)。后来研究人员对这 种番茄胚胎做了石蜡切片的观察，发现在败育的胚胎组织中没有维管束的分化，这说明Wo 基因可能影响维管束的分化，并报道这种致死作用发生在花后22天之前(Huang，1960)。在植物上，胚胎发育的基因调控已经有了比较深入的研究，如拟南芥，发现了很 多胚胎发育过程中的关键基因。Xu等(2003)报道了 AtCPSF73-II基因的Ds插入突变的 纯合植株LGT1922会导致胚胎致死，而杂合体植株会表现正常。Sparkes等(2003)报道了 PEXlO的Ds插入所获得的杂合突变体在适宜的生长环境中表现正常的营养生长，但会产生 约20%败育的种子。Kim和Huang(2004)报道了 LPAATl的T-DNA插入纯合突变体产生皱 缩的种子，种子里面的胚胎在心形胚向鱼雷形胚过渡的时期发生了败育。同样，Kandasamy 等(2005)发现APR7基因导致纯合子胚致死，也影响植株生长和发育，包括茸毛的发育。 Apuyal等(2002)报道了 RASPBERRY3编码一种参与胚胎发育的新型蛋白，相关的突变体 会导致胚胎在球形胚时期发生败育。Uwer等(1998)报道了 EDDl的突变体产生胚胎致死 的现象，这种现象发生在球形胚向心形胚过渡的时期。AtCSLA7、EMB506、RAPT0R/K0G1、 schlepperless(slp)等这些基因的突变体都在心形胚之前发生了致死现象。但还没有基因 具有番茄茸毛基因Wo这样的特点既调节体表茸毛的分化发育，又参与胚胎的生长调控。茸毛基因Wo的研究既具有理论价值，又具有实际应用价值。植物中自发突变所 形成的致死基因非常少见，对植物胚胎致死的研究也不多。本发明以番茄茸毛自发突变体 和茸毛基因所在区段的ILs系为亲本材料构建遗传作图群体，采用已知分子标记和新开发 的分子标记对其进行精细定位，利用生物信息学分析确定候选基因，首次成功克隆了 Wo基 因，并且通过转基因互补实验，验证了该基因的功能。该发明中克隆的基因对研究茸毛的发 育途径和机理，以及与胚胎致死之间的关系有重要意义，同时该基因还在番茄的抗虫和抗 病毒育种中有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于一个控制番茄茸毛发生的关键基因Wo的克隆及应用。本发明 通过图位克隆获得的一个控制番茄茸毛发生的关键基因(Wo)，利用转基因技术，对该基因 在番茄茸毛发生方面的功能进行验证与应用。
本发明是这样实现的本发明通过利用番茄茸毛突变体和IL系构建F2分离群体(具体步骤见实施例 1)，采用图位克隆技术，从番茄中克隆获得了 Wo基因，它属于同源异型家族，它不同于目前 报道的在拟南芥和棉花中所克隆茸毛调控关键基因，不属于这个基因家族，而是一个新分 离的基因，申请人将这个新分离的基因仍然命名为Wo基因，该基因的cDNA序列如序列表 SEQ ID NO :1所示，它包括2193个碱基对，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，它编 码731个氨基酸。与此同时本发明克隆得到Wo基因的等位基因-1，它的cDNA序列如序列 表SEQ ID NO :3所示，它包括2193个碱基对，该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQID NO: 4所示，它编码731个氨基酸，在序列表SEQ ID NO 3的1700bp处有一个G1700-T1700的 碱基突变。克隆得到Wo基因的另一个等位基因-2，它的cDNA序列如SEQ ID NO :5所示， 它包括2193个碱基对，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示，编码731个氨基 酸，在序列表SEQ ID NO 5的2075bp处有一个T2075-C2070的碱基突变。本发明还获得的 Wo基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 7所示，它包括3883个碱基对。本 发明利用克隆的Wo基因在番茄中超量表达，可显著提高番茄的表皮毛数量，增强番茄的抗 虫性和增强抗病毒的能力。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQIDNO:1是Wo基因的cDNA序列O
序列表SEQIDNO:2是Wo基因对应的氨基画I序列。
序列表SEQIDNO:3是Wo基因的等位基因--1的cDNA序列O
序列表SEQIDNO:4是Wo基因的等位基因-1对应的氨基画I序列。
序列表SEQIDNO:5是Wo基因的等位基因--2的cDNA序列O
序列表SEQIDNO:6是Wo基因的等位基因--2对应的氨基画i序列。
序列表SEQIDNO7是Wo基因的启动子的核苷酸序列。图1 是番茄多茸毛的突变体和正常茸毛的野生型的植株表型。图中图IA是番 茄多茸毛的突变体；图IB是正常茸毛的野生型。图2 是拟南芥茸毛的形成机制模式图。图3 是基于IL2-3XLA3186杂交的F2群体对Wo基因的精细定位(a)Wo基因位 于番茄第2条染色体的分子标记W124和C2_At5g64670之间。(b)分子标记W124和C2_ At5g64670在渗入系IL 2-3和IL 2-5的相对位置。(C)Wo与分子标记STS4共分离·。(d) Wo所在的两个BAC的示意图。(e)包含Wo基因的BAC19个候选基因信息，红色箭头所示的 位置为候选的Wo基因。图4:是Wo基因的cDNA序列比对结果。图中1_7基因序列来自于番茄种质多茸 毛突变体LA3186的Wo基因的cDNA不同克隆，8是少毛基因型wo的cDNA序列。在多茸毛 突变体Wo基因cDNA序列第1904位点处，大约有一半(50% )由C突变为G。图5 是Wo基因的gDNA序列比对结果。图中基因序列来自于番茄种质多茸毛突变 体LA3186的Wo基因的gDNA不同克隆，在基因gDNA序列3113位点处，大约有一半(50% ) 由C突变为G。
图6 :Wo基因几个等位基因的cDNA序列比对结果。图中1_3为LA0258不同的cDNA 克隆序列，4-6为LA1531不同的cDNA克隆序列，7_9为LA1908不同的cDNA克隆序列，10为 LA3186cDNA克隆序列。图7 石蜡切片观察番茄正常胚胎(1-5)与LA3186突变体胚胎(6_10)的发育过程。图8 :pMV2-ffo超量表达载体的构建示意图。图9 是转基因植株PCR-CAPS检测结果。利用Wo特异全长引物首先将基因扩增 出来，然后利用酶切鉴定，对照酶切后的大小为1868kb和1534，而转基因酶切后的片段除 对照的两个片段外，还有大小为1035kb、866kb和292kb的三条带。CK 少毛番茄对照；1，2 超量的转基因植株1和2。图10 是转Wo基因的番茄植株与对照叶片上茸毛表型。图IOA是转空载体的对 照；图IOB是转基因植株1 ；图IOC是转基因植株2。图11 是扫描电镜观察转Wo基因番茄植株与对照叶片的表面。图IlA是对照叶 片；图IlB是转基因植株叶片。图12 是转Wo基因番茄植株的茸毛簇生现象(包含图12A和图12B)。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况 下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1 本发明Wo基因的精确定位通过对现有经典番茄遗传图谱Tomato-EXPEN 2000、Tomato-ILs和整合图谱(参 见=Tanksley, 1992, http //sgn. cornell.edu/)分析知道番茄茸毛调控基因(Woolly, Wo, 该基因未被克隆)位于IL2-3和IL2-5(引自美国番茄遗传资源中心(TGRC)，http //tgrc. ucdavis. edu/)的渗入片段所在的区间内。在本发明中，申请人首先以IL2-5为母本，以茸 毛突变体LA3186(引自美国番茄遗传资源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)为父本进行 杂交，拔除F1中少茸毛植株，让多茸毛植株自交并收获F2代种子，随后播种F2群体，随机挑 取其中106株少毛植株作为作图群体，采用已经报道的分子标记U237440，C2_At5g64670, HBa44016SP6, SSR287, W124 和 SSRD69，(上述报道的分子标记 U237440，C2_At5g64670, HBa44016SP6, SSR287, W124 和 SSRD69 已由 http://sgn. Cornell, edu/ 公布)进行初步定 位，将Wo基因定位在分子标记Wl24和C2_At5g64670之间，其包含的遗传距离为5. 8cM(见 图3a，b)。随后以IL2-3为母本，以茸毛突变体LA3186为父本杂交，同时拔除F1中少茸毛 植株，让多茸毛植株自交并收获F2代种子，随后播种F2群体，将群体扩大至1031株，利用 BAC 序列开发新的分子标记 WY42，STS64, STS64, STS62 和 STS4(上述 WY42，STS64, STS64, STS62和STS4标记的引物序列及相应内切酶见表1所示)进行精细定位。将Wo基因定位 于STS64和STS62之间，并于STS4共分离(见图3c)。利用精细定位的结果，采用与目的基因Wo两侧紧密连锁的分子标记为探针，筛选 茸毛基因Wo所在的BACs，将Wo基因定位在第2条染色体的两个BAC :C02HBa0006L05和 C02HBa0204D01 (http://sgn. Cornell, edu/)上(见图 3d)，将这两个 BAC 末端进行序列分
7析拼接后，获得了一个包含200kb的序列，通过生物信息学分析，推测该覆盖目的基因(Wo) 的序列含有19个ORFs (见图3e)，通过对各ORFs可能具有的功能预测，分析其中一个基因 H0ME0D0MAIN GLABROUS 2为Wo基因的候选基因。
表1本发明用于Wo基因定位的分子标记引物及内切酶标记标记名正向引物(5' -3')反向引物(5' -3')内切酶
类型称
SSRWY42GGTTTCGCCAGCATAAAATGCAACAAGAGTCCCAAGCAAA
STSSTS33GCATCGGAGCTTGCTAAAAGACTTTGGTGGAGGCAAAATG
STSSTS64TTACGGGTGTAATCGCACAAAGGGAGCAGCATGGTTAAAA
CAPSSTS4ATTTGAGGCCGGTTTAGCTTTGCCTGCAGTTCCCTTTCTADral
CAPSSTS62TTTGACTGGGCAAGAACCTTTTGGGACTTTCCAGTTGAGGAvail实施例2 =Wo基因的克隆与序列分析依据候选的Wo基因信息，设计出可扩增出该基因全长的PCR引物正向引物 5，-TTCAAGATGTTTAATAACCACCAGC-3，，反向引物5，-ACCTTTCATGCATTTGCGGAAGTTAC-3，。提 取番茄叶片基因组RNA，利用反转录酶(购自Τ0Υ0Β0公司)将RNA反转录成cDNA(参照 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，通 过PCR扩增得到Wo全长基因产物，经0. 8%琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒(购自Axgen公 司)回收目的片段，用PMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)克隆，取5yL 连接产物进行热击处理，具体方法参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指 南(第三版)，科学出版社，2002版，转化大肠杆菌DH5 α，涂布于含有氨苄青霉素/异丙 基-β -D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB 固体平板上，37°C培养过夜，挑选蓝斑1个和白斑若干，于含Amp 50mg/L的液体LB培养基 中，于37°C 200r/min振荡培养过夜，用小量法提取质粒(小量法提取质粒的试剂盒购自 北京普博欣公司，具体程序见该试剂盒的说明书)。将该质粒用Wo基因特异引物，正向引 物5，-TTCMGATGTTTAATAACCACCAGC-3，，反向引物5，-ACCTTTCATGCATTTGCGGAAGTTAC-3， 进行检测，对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定，测序工作由上海英骏生物技术 有限公司完成。本实施例获得的Wo基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO :1所示。序 列同源性分析采用GenBank的BLAST程序，氨基酸序列比对分析采用Clustal W程 序。另外根据基因的上游序列信息设计扩增Wo基因的启动子的引物，其正向引物 5，-CCATCCTATTAGCCATAAGTGTGA-3，)，反向引物5，-AATACCTTCTCGATCTTCTTCAAAA-3，。提 取番茄叶片基因组DNA，利用上述启动子特异引物扩增得到启动子基因产物，克隆后进行测 序，方法同上该启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。挑选了茸毛突变体LA3186材料中多茸毛植株，利用上述Wo的特异引物对Wo基因 进行了扩增，随后将PCR产物克隆到PMD-18T载体，随机挑选了多个cDNA克隆进行测序。同 时，对少毛植株(基因型为wowo)中wo基因进行了测定，序列比对结果表明，与少毛的WO 基因相比，多茸毛材料中有一半的克隆在第1904位点处发生了变异，其碱基序列由C突变 为G，所以多茸毛的LA3186突变体Wo位点是处于杂合状态(基因型为Wowo)，这个位点正 好是一个Xho I的酶切位点，本发明可以利用Xho I酶切来鉴定番茄多毛突变体和番茄少毛的野生型(图4)。为了验证其准确性，对多茸毛材料Wo基因的多个gDNA克隆也进行了 测序，发现在gDNA序列的第3113位点(即cDNA的1904位点)处发生了 50%相同的突变 (见图5)。此结果进一步说明材料LA3186的Wo位点是杂合的，这与LA3186具有纯合致死 的特点正好相符。分析Wo基因的序列结构表明，Wo基因由730个氨基酸残基组成，自序列 表SEQ ID NO :2的第58位至第117位是同源异型结构域，第126位至第203位是亮氨酸拉 链结构域，第250位到469位是蛋白质的START保守结构域。同时对几个茸毛等位突变体的Wo基因cDNA序列进行了测序，发现同样具有纯合 致死特性的材料LA0053(引自美国番茄遗传资源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)和毛 粉802 (购自中国陕西省西安市蔬菜研究所，商业品种)在Wo基因第1904位点处碱基也由C 突变为G。而纯合不致死材料LA0258，LA1531(引自美国番茄遗传资源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)在Wo基因cDNA序列第1700位点处由G突变为T (图6)，另外一个纯合不致 死材料LA1908(引自美国番茄遗传资源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)在第2075位点 处由T变为C(图6)。对比拟南芥、玉米、杨树等不同的作物中Wo基因编码的蛋白质序列， 发现茸毛突变体碱基突变的位置正好是氨基酸的保守结构域，其变异对氨基酸编码的蛋白 质的功能有很大的影响。实施例3 茸毛突变体植株中胚胎败育时期的确定茸毛突变体LA3186有纯合导致胚胎致死的特性，申请人以LA3186为材料，对其胚 胎致死的时期进行了显微观察。采集授粉花后第4天到第40天的番茄果实中的种子(番 茄植株生长一致，均采第3薹果)进行固定、染色、脱水等步骤制作石蜡切片(方法参照，王 灶安，1992)，观察统计花授粉后各个时期番茄胚胎发育的情况，发现授粉后7天胚胎的发 育程度差异不大，到第9天，正常胚胎和败育胚胎的发育开始出现不同，正常胚胎随着时间 的增加，胚柄开始降解，胚胎出现明显的分化，随后经过球形胚，鱼雷形胚，子叶形胚逐渐成 熟。而败育胚胎始终停滞在球形胚时期，没有继续分化，胚柄也没有降解(图7)。实施例4 与茸毛发生相关的Wo基因的功能互补验证利用设计的Wo基因的特异引物(引物序列见本发明的实施例2)，用fastPfu酶 (购自Transgen公司)，从多茸毛的突变体材料LA3186中扩增Wo基因的全长cDNA序列， 将扩增产物切胶回收(回收试剂盒购自Axgen公司)后，连接到pEASY-Blimt载体(购自 Transgen公司)上，测序后确认在Wo基因第1904位点处碱基为G，以XbaI和KpnI双酶切 带有目的基因Wo全长片段的克隆pEASY-Blunt载体，同时以XbaI和KpnI双酶切pMV2载 体，回收连接后得到含Wo基因的重组超量表达载体pMV2-Wo，构建流程见图8，该载体由35S 启动子驱动，选择标记基因为壮观霉素(Spec)。将Wo基因的超量表达载体pMV2-Wo转入少 毛材料AilsaCraig(引自美国番茄遗传资源中心，http//tgrc. ucdavis. edu/)，转化程序 参照张俊红报道的方法(张俊红，2006)，获得了转基因植株。利用突变体与野生型材料的 单核苷酸突变导致的酶切位点XhoI的变化，对转基因番茄植株进行了 PCR-CAPS鉴定(方 法是以上述转基因番茄植株的DNA为模板，先进行PCR扩增(采用如上实施例2所述的Wo 基因的特异引物)，然后用XhoI酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测)，非转基因番茄植株 酶切后电泳条带大小为1868bp和1534bp，由于TO代转基因植株Wo位点为杂合的，所以该 转基因番茄材料PCR产物应包含Wo和wo基因序列，所以酶切后的片段除对照的两个片段 外，还有大小为1035bp、866bp和292bp的三条带。确认有2株为阳性的转基因植株(见图9)。对转基因植株表型进行观察后发现，转基因番茄植株的叶片和茎杆上茸毛明显增多，变 得更加浓密，恢复了多茸毛突变体的表型(图10)，利用扫描电镜(型号，JSM-6390/LV)对 转基因植株和对照(非转基因)植株的茸毛进行了观察，结果表明本发明的转基因番茄植 株叶片上茸毛密度明显增加(图11)，并且叶片上有些茸毛簇生在一起，与一般番茄的茸毛 有明显的区别(图12)。主要参考文献1.王灶安.植物显微技术.北京中国农业出版社，19922.张俊红.番茄Aux/IAA基因的克降与功能分析，博士论文，中国知网httD Il epub3. cnki. net3. 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权利要求
一种调控番茄茸毛的Wo基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述的基因，它的蛋白质序列如SEQID N0:2所示。
3.权利要求1所述的Wo基因的等位基因-1，它的cDNA序列如序列表SEQID N0:3所 示，在序列表SEQ ID NO 3的1700bp处有一个G1700-T1700的碱基突变。
4.权利要求1所述的Wo基因的等位基因-2，它的cDNA序列如SEQID NO 5所示，它 的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO :6所示，在序列表SEQ ID NO :5的2075bp处有一个 T2075-C2075的碱基突变。
5.权利要求1所述的Wo基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:7所示。
6.权利要求1-4任一项的基因在番茄遗传改良中的应用。
7.权利要求5所述的启动子在控制基因在番茄中表达中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个与番茄茸毛发生相关的Wo基因的克隆及应用。本发明克隆的Wo基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，它编码731个氨基酸。本发明的还涉及Wo基因的启动子以及Wo基因的两个等位基因的克隆。本发明Wo基因在番茄中超量表达，可提高番茄的表皮毛数量，显著增强番茄的抗虫性和增强抗病毒的能力。
文档编号C12N15/113GK101985623SQ20101023422
公开日2011年3月16日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者卢永恩, 叶志彪, 张余洋, 张俊红, 李汉霞, 杨长宪, 王涛涛 申请人:华中农业大学