专利名称：一种h9亚型禽流感病毒荧光定量rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法。
背景技术：
禽流感是由正粘病毒科禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，根据其血凝素HA 和神经氨酸酶NA的抗原性将禽流感病毒分成不同亚型，包括15种特异的HA亚型和9种特 异的NA亚型，两者的不同组合形成不同亚型禽流感病毒。根据毒株致病性的不同，禽流感 可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感两大类。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，产 蛋家禽感染后，可引起产蛋率下降，软壳蛋、无壳蛋增多，严重的将会停止产蛋。种禽感染 后，除上述症状外，还表现出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雏禽出壳困难，出壳 后的雏禽弱雏增多。雏禽在一周内死亡率较高，且易感染大肠杆菌，治疗较困难。H9亚型禽 流感混合感染其他病原时，可导致发病率和死亡率的大幅度提高，给养殖业带来巨大损失。 近年来，H9亚型禽流感病毒感染人的病例也时有发生，因此它也是不容忽视的人兽共患病 病原。H9亚型禽流感传播快，危害大，因此早期快速诊断就成为预防和控制该病的前提 条件。根据其流行特点、临诊表现和病理变化可作出初步诊断，确诊还需要进行实验室诊 断，传统的实验室检测方法主要是血清学检测。血清学检测具有精确、敏感的优点，但操作 繁琐，耗时较长，约需要一周左右的时间才能确诊。基于分子生物学技术的荧光定量RT-PCR 方法，能够快速准确的对样品进行检测，对疾病的早期治疗及疫情的控制提供参考。
发明内容
本发明建立了灵敏度高、特异性强、操作简单的H9亚型禽流感荧光定量RT-PCR检 测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保 障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。本发明的具体步骤是1、引物设计参照GenBank中公开发表的H9亚型禽流感病毒HA基因序列，应用Primer Premier 5. 0软件设计了特异性引物序列名称核苷酸序列(5，-3，)位置
H9F-1ACCAGTGCATGGAGACAATTC1484--1504
H9R-1CAAATGTTGCATCTGCAAGAC1709--1689
H9F-2AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA1576--1600
H9R-2ATTGGACATGGCCCAGAACA1609--1639
H9-probeFAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG-TAMRA1686--16672、病毒RNA提取①取H9N2亚型禽流感病毒悬液250 μ L，加入750 μ LTrizol液，混勻；
②室温放置5min，然后以每Iml Trizol液加入0. 2ml的比例加入氯仿，盖紧离心
管，用手剧烈摇荡离心管15秒；③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0. 5ml异丙醇的比例加入异 丙醇，室温放置IOmin, 12000g离心IOmin ；④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，混勻，4°C下 7500g 离心 5min ；⑤重复④中的操作；⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-lOmin，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度； ⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置IOmin。提取的RNA须在2h内进行PCR扩 增，若需长期保存须放置-70°C冰箱。3、RT-PCR 扩增①反转录合成cDNA 反转录反应体系包括10 X RT mix 2 μ 1，2. 5mM dNTPs 2 μ 1， 2μ 1 U-12禽流感通用反转录引物(5~-AGCAAAAGCAGG-3~)，Quant Reverse Transcriptase 1μ 1，5μ 1已制备的RNA，DEPC水8μ 1。37°C作用lh，即反转录完成。②PCR 扩增PCR 总体系为 25μ 1，其中 IOXBuffer 2. 5 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ 1,2. 5mM dNTPs 2 μ 1，上、下游引物(H9F-1 和 H9R-1)各 0.5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，模板 1 μ 1， 余下用灭菌ddH20补足。反应条件为:95°C预变性5min，然后94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 30s, 进行30个循环，最后72°C延伸6min。反应结束后，取5μ1 PCR产物于1 %琼脂凝胶中电 泳。4、质粒标准阳性模板的制备①确定阳性质粒PCR产物于琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按 照常规方法将目的片段与PMD18-T载体连接，并转化DH5ci感受态细胞中，于氨苄青霉素 酶培养基37°C培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，EcoR I和Pst I双酶切鉴 定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列 对比分析，确定阳性质粒。②阳性质粒浓度的测定将质粒提取物用超纯水IOX稀释后，在260nm与280nm 波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数。
质粒浓度X 6.023 XIO23
质粒DNA拷贝数=质粒DiVZ分子量注每个碱基的平均分子量为6605、荧光定量PCR标准曲线绘制提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，荧光定量标准品为位于HA基因上 1484 1709之间、大小约为226bp的基因片段的质粒。倍比稀释(107 102copies/μ L)用 于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20 μ 1，其中2. 5 XrealMasterMix 8μ 1，上下 游引物(H9F-2 和 H9R-2)各 0. 8μ 1，探针 0. 8μ l，20XProbe Enhancer solution Ι.ΟμΙ， 模板 2μ 1，超纯水 6. 6μ 1。反应条件为95°C Imin ;95°C 10s,60°C 15s，68°C 34s，40 个循 环。
本发明的有益效果主要体现在
(1)灵敏度高通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为looC。pieS／reaCti。n。
(2)特异性强除H9亚型的毒株均能检测到阳性的荧光信号外，而其他亚型流感病毒H1、H3、H5、H7等均为阴性，新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均为阴性。
(3)重复性好选择不同浓度的4个质粒标准品进行荧光定量PCR检测，每个标准品在同一反应条件下重复3次作为同一批次内重复试验，然后在另一时间再重复一次作为不同批次间重复试验，通过计算得出，批次内变异系数的mean I-S．D．为0．82 I-0．64％，批次间变异系数的mean I-S．D．为1．15 I-0．17％。
说明书附图
图l是H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR标准品扩增曲线
图2是H9亚型禽流感病毒荧光定量PCR标准曲线
具体实施例方式 参照GenBank中公开发表的H9亚型禽流感病毒Iu基因序列，设计了特异性引物序列
名称核苷酸序列(5’一3’)
H9F—lACCAGTGCATGGAGACAATTC
H9R—lCAAATGTTGCATCTGCAAGAC
H9F一一2AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA
H9R一一2ATTGGACATGGCCCAGAACA
H9一probeFAM—ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG—TAMRA
实施例一以已知H9N2亚型禽流感病毒为检测材料，并以超纯水为阴性对照。
l、H9N2亚型禽流感病毒RNA提取
①取H9N2亚型禽流感病毒悬液250 u L，加入750 u LTrizol液，混匀；
②室温放置5min，然后以每lml Trizol液加入0．2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
⑧取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0．5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min；
④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少lml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min；
⑤重复④中的操作；
⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5—10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；
⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置一70℃冰箱。
2、反转录合成cDNA
反转录反应体系包括lo×R／mix 2 u l，2．5nN dNTPs 2 u l，2 u l U—12禽流感通用反转录引物(5~-AGCAAAAGCAGG-3~)，Quant Reverse Transcriptase 1μ1，5μ1 已制备 的RNA，DEPC水8μ 1。37°C作用lh，即反转录完成。3、荧光定量PCR检测取上述反转录获得的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，反 应体系 20 μ 1，其中 2. 5 XrealMasterMix 8 μ 1，上下游引物(H9F-2 和 H9R-2)各 0. 8μ 1，探 针 0. 8 μ 1，20XProbe Enhancer solution 1· 0 μ 1，模板 2 μ 1，超纯水 6· 6 μ 1。反应条件 为95°C Imin ；95°C 10s,60°C 15s，68°C 34s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材 料中的病毒核酸量(copies)。结果说明本方法能有效地检测H9亚型禽流感病毒核酸量。实施例二 待检病料(病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子)中H9亚型禽流感病毒的荧光 定量PCR检测。1、样品制备病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子品在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液 体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，编号备用。2、病毒RNA提取①取上述液体250 μ L，加入750 μ LTrizol液，混勻；②室温放置5min，然后以每Iml Trizol液加入0. 2ml的比例加入氯仿，盖紧离心
管，用手剧烈摇荡离心管15秒；③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0. 5ml异丙醇的比例加入异 丙醇，室温放置IOmin, 12000g离心IOmin ；④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，混勻，4°C下 7500g 离心 5min ；⑤重复④中的操作；⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-lOmin，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度；⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置IOmin。提取的RNA须在2h内进行PCR扩 增，若需长期保存须放置-70°C冰箱。3、反转录合成cDNA反转录反应体系包括10X RT mix 2 μ 1,2. 5mM dNTPs 2μ1，2μ1 U-12 禽流感通 用反转录引物(5~-AGCAAAAGCAGG-3~)，Quant Reverse Transcriptase 1μ1，5μ1 已制备 的RNA，DEPC水8μ 1。37°C作用lh，即反转录完成。4、荧光定量PCR检测取上述反转录获得的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，反 应体系 20 μ 1，其中 2. 5 XrealMasterMix 8 μ 1，上下游引物(H9F-2 和 H9R-2)各 0. 8μ 1，探 针 0. 8 μ 1，20XProbe Enhancer solution 1· 0 μ 1，模板 2 μ 1，超纯水 6· 6 μ 1。反应条件 为95°C Imin ；95°C 10s,60°C 15s，68°C 34s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材 料中的病毒核酸量(copies)。结果说明本方法能敏感地检测病料中H9亚型禽流感病毒核酸量。
权利要求
一种H9亚型禽流感病毒荧光定量RT PCR检测方法，其特征在于该检测方法包括下步骤(1)引物设计参照H9亚型禽流感病毒HA基因序列设计特异性引物，引物序列；(2)病毒RNA提取①取H9N2亚型禽流感病毒悬液250μL，加入750μL Trizol液，混匀；②室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；③取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min；④弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混匀，4℃下7500g离心5min；⑤重复④中的操作；⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5 10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中，放置10min；(3)RT PCR扩增①反转录合成cDNA反转录反应体系包括10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl U 12禽流感通用反转录引物(5` AGCAAAAGCAGG 3`)，Quant Reverse Transcriptase1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl；37℃作用1h，即反转录完成；②PCR扩增PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，2.5mM Mg2+2μl，2.5mM dNTPs 2μl，上、下游引物(H9F 1和H9R 1)各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板1μl，余下用灭菌ddH2O补足；反应条件为95℃预变性5min，然后94℃ 30s，45℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸6min；反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳；(4)质粒标准阳性模板的制备①确定阳性质粒PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18 T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，EcoR I和Pst I双酶切鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；②阳性质粒浓度的测定将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；注每个碱基的平均分子量为660(5)荧光定量PCR标准曲线绘制提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(107～102copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H9F 2和H9R 2)各0.8μl，探针0.8μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水6.6μl；反应条件为95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40个循环；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为100copies/reaction。FSA00000201952300021.tif
2.根据权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于 所述的特异性引物及引物序列如下H9F-1 :ACCAGTGCATGGAGACAATTC ； H9R-1 CAAATGTTGCATCTGCAAGAC ； H9F-2 :AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA ； H9R-2 :ATTGGACATGGCCCAGAACA ；H9-probe :FAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG_TAMRA。
3.根据权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于 所述的荧光定量标准品为位于HA基因上1484 1709之间、大小为226bp的基因片段的质
全文摘要
本发明涉及H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法是采用TaqMan技术，设计一组仅在H9亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，应用荧光定量检测仪对样品进行检测。该方法灵敏度高、特异性强，操作简单，能大大缩短检测周期，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
文档编号C12Q1/70GK101914632SQ201010234168
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者吕静, 姚美玲, 柴同杰 申请人:山东农业大学