专利名称：人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是利用人二倍体细胞(KMB17)生产用于预防人类 狂犬病的疫苗毒种及其制备方法。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种疾病，一旦发病，100%死亡。我国近年来狂犬 病疫情持续上升，发病率现居世界第二位，仅次于印度，狂犬病病死人数居37种法定报告 传染病之首。狂犬病至今无法治愈但可有效预防，因此我国狂犬病的预防工作就显得尤为重要。目前世界用于生产狂犬病疫苗的培养基质细胞主要有地鼠肾细胞、鸡胚细胞和非 洲绿猴肾细胞(Vero细胞)等动物源性细胞。动物源性原代细胞不能排除细菌、病毒、寄生 虫等外源致病因子的污染，且有生产规模不易扩大、环保难解决等缺点；而Vero细胞由于 是传代细胞系，有一定的致瘤性，疫苗中细胞残余DNA必须达到标准，而且其最大的缺点是 该细胞株没有我国自主知识产权。人二倍体细胞为人源性正常核型细胞，无致癌性，无异种 DNA，其安全性无疑要高于动物源性细胞。目前我国使用的狂犬病疫苗种类虽多，但质量良 莠不齐，至今尚无被WHO、FDA等组织肯定和推荐的人二倍体细胞培养疫苗，而基本是用地 鼠肾细胞、Vero细胞和鸡胚细胞等动物源性细胞培养的疫苗。国外生产的人二倍体细胞狂 犬病疫苗，如美国Wyeth厂、法国Merieux研究所和德国Behring厂生产的二倍体疫苗，已 证实其具有良好的免疫原性和安全性，但用人二倍体细胞培养狂犬病毒，有病毒滴度相对 较低、疫苗成本高及价格昂贵等缺点，难以广泛使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有我国自主知识产权，适应于人二倍体细胞(KMB17)， 具有良好免疫原性和传代稳定性，并且易于大量扩增的狂犬病疫苗毒种及其制备方法。用 该毒种生产人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性和 实用性，以便能更安全、有效地预防人类狂犬病。1984年WHO第7次狂犬病专家委员会将CTN-IV5株认可为狂犬病毒固定株，列 为可用于生产疫苗的病毒株。本发明是将狂犬病固定毒CTN-IV5株连续在人二倍体细胞 (KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍 体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞 (KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，分类命 名为狂犬病毒Rabies virus，已于2010年07月16日保藏于中国微生物生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No. 3989。CTN-IV5株经过在人二倍体细胞(KMB17)中传代适应，其病毒滴度由第1代的 4. 51gLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度彡6. 91gLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47 代，病毒滴度基本稳定在7.01gLD50/ml以上。
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本发明的人二倍体细胞(KMB17)的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养 液由Eagle液、乳蛋白及一定量的新生牛血清组成。具体制备方法步骤如下1、用由fegle液、乳蛋白及2% 15%的新生牛血清组成的细胞营养液，于35°C 37°C培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。2、将狂犬病固定毒CTN-IV5株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒 命名为CTN-DK株。传代方法为当细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将 CTN-IV5株按0. 005 1. OMOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于 32°C 37°C，PH7. 2 8. 0培养，培养2 20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DKl，并 以相同方法继续传代。 3、当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名 为CTN-DK29，再以CTN-DI^9经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33 经终末稀释法筛选并传至47代。4、CTN-IV5株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍 体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4. 51 gLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度 彡6. 91gLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7. 01gLD50/ml以上。5、病毒的接种方式是悬浮细胞接种法，病毒接种剂量为0. 005 1. 0Μ0Ι，培养温 度为32°C 37°C，PH7. 2 8. 0，病毒收获时间为接种病毒后2 20天。该毒种参照《中华 人民共和国药典》三部(2005年版)“人用狂犬病疫苗”毒种的无菌检查、支原体检查、鉴别 试验、外源因子检查和免疫原性检查方法检测，检测结果均达到药典要求的标准。经测定， 毒种中和指数为3981，保护指数为> 776，均大大超过药典所要求中和指数不低于500和保 护指数不低于100的标准。研究同时表明，此毒种的G蛋白基因在人二倍体细胞(KMB17) 传代时具有遗传稳定性。本发明的液体毒种保存于-60°C以下，有效期可达3年半以上，毒种真空冷冻干燥 后可于-60°C以下长期保存。用毒种(CTN-DK株)制备了 3批试验性疫苗，经免疫原性、豚鼠异常毒性试验、残 余活病毒检查(包括细胞盲传三代后小鼠脑内接种)和效价测定等均证明安全有效，其中 一批经国家(浙江)新药安全性评价研究重点实验室的安全性评价(小鼠im急性毒性试 验、豚鼠全身主动过敏试验、大鼠被动皮肤过敏试验)，结论为安全。本发明具有以下技术效果本发明制备的毒种可用细胞工厂大量增殖。以细胞工厂制备毒种的培养方式与传 统的克氏瓶相同，但与前者相比，有培养面积大，制备批量大，占用空间小，操作简便，污染 机会小等的优点。毒种(CTN-DK株)用细胞工厂大量增殖的滴度与用克氏瓶制备毒种的滴 度相当。本发明的毒种(CTN-DK株)是一种已经适应于人二倍体细胞(KMB17)，具有良好免 疫原性和传代稳定性，符合《中华人民共和国药典》三部(2005年版)“人用狂犬病疫苗”毒 种要求，并且易于大量扩增的狂犬病毒毒种。用该毒种生产的人二倍体细胞(KMB17)狂犬 病疫苗具有安全性和有效性，可以避免当前国内使用的疫苗中异种DNA残留引起的风险， 将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性，具有重大的社会效益和经济效益。
具体实施例方式实施例1 用由Eagle液、乳蛋白及2% 15%的新生牛血清组成的细胞营养液，于35°C 37°C培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。当细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细 胞，将CTN-IV5株按0. 005 1. OMOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)， 于32°C 37°C，PH7. 2 8. 0培养，培养2 20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DKl， 并以相同方法继续传代。当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为 CTN-DK29，再以CTN-DI^9经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经 终末稀释法筛选并传至47代。CTN-IV5株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适 应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4. 51gLD50/ml逐渐升高，到20代时病 毒滴度> 6. 91gLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7. 01gLD50/ ml以上。实施例2 采用悬浮细胞接种方法，取已长成单层的细胞，用胰酶常规消化，收集细胞，再以 生长液(含10% 15%新生牛血清的fegle乳白蛋白培养液)按合适的比例悬浮细胞。在 悬浮细胞中接种病毒，置37°C培养至细胞长成单层，去除原培养液，换上维持液(含2% 5 %新生牛血清的fegle乳白蛋白培养液)，分别置32 °C、33 °C、34°C、35 °C、36 °C、37 °C培养， 5 7天收获病毒液。收获的病毒液以狂犬病病毒滴度滴定试验(LD50)检测，结果见表1。表1毒种在人二倍体细胞(KMB17)中不同培养温度的病毒滴度(lgLD50/ml)
权利要求
1.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种，其特征在于将狂犬病固定毒CTN-IV5株连续 在人二倍体细胞(KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获 得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育 出在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种 (CTN-DK 株)，其保藏号为 CGMCC No. 3989。
2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种病毒滴度>7. 01gLD50/ml 。
3.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种在人二倍体细胞(KMB17) 传代，其G蛋白基因具有稳定性。
4.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于液体毒种_60°C以下可保存3 年半以上，毒种真空冷冻干燥后于-60°C以下长期保存。
5.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种的制备方法，其特征在于具体制备方法步骤为1)用由Eagle液、乳蛋白及2% 15%的新生牛血清组成的细胞营养液，于35°C 37°C培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。2)将狂犬病固定毒CTN-IV5株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒命名为 CTN-DK株。传代方法为细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-IV5株 按0. 005 1. OMOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32°C 37°C， PH7. 2 8. 0培养，培养2 20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DKl，并以相同方法继 续传代。3)当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为 CTN-DK29，再以CTN-DI^9经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经 终末稀释法筛选并传至47代。4)0^-1^株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体 细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4. 51gLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度 彡6. 91gLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7. 01gLD50/ml以上。5)病毒的接种方式是悬浮细胞接种法，病毒接种剂量为0.005 1. 0Μ0Ι，培养温度为 32°C 37°C，PH7. 2 8. 0，病毒收获时间为接种病毒后2 20天。
6.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种的制备方法，其特征在于人二倍体细胞 (KMB17)的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由Eagle液、乳蛋白及一定量的 新生牛血清组成。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，特别是利用人二倍体细胞(KMB17)生产用于预防人类狂犬病的疫苗毒种及其制备方法。本发明是将狂犬病固定毒CTN-1V5株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，从而获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出可在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)。用该毒种生产人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗可以有效避免当前国内使用的疫苗中异种DNA残留引起的风险，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性和实用性，具有重大的社会效益和经济效益。
文档编号C12R1/93GK102093983SQ20101025355
公开日2011年6月15日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者严宵, 周康凤, 姜立民, 李永学, 林晓波, 毛子安, 陈秋红, 高磊, 黄海鹰 申请人:浙江普康生物技术股份有限公司