专利名称：用issr分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的方法
技术领域：
本发明涉及一种用ISSR分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的方法。
背景技术：
阿魏是我国传统中药材，其应用历史悠久。本品为伞形科植物新疆阿魏O^rWa sinkiangensis K. M. Shen)或阜康阿魏(/ / ^ fukanensis K. M. Shen)的树脂，为《中华人民共和国药典》2005年版所收载。阿魏始载于唐代《新修本草》，记有“苗叶根酷似白芷。倒根汁，日煎做饼者为上， 揭根穿暴干者为次。体性及臭而能止臭，亦为奇物。”因疗效显著，唐以后，历代本草都有记载。阿魏药用价值阿魏味苦、辛、性温。归脾、胃经。有消积，散脾，杀虫等功效。用于肉食积滞，瘀血、腹中痞块，虫积腹痛等症。阿魏成分阿魏主要含有树脂，树胶和挥发油等有效成分。树脂主要含有阿魏酸及其脂类，还有香草醛等；挥发油中主要含有菔烯，并伴有多种二硫化合物。主要药理作用阿魏有双向调节平滑肌、抗过敏、抗生育、抗溃疡、抑菌等生理作用。我国药用阿魏过去主要靠进口，解放前为少数民族用药。目前的阿魏药材主要来源于野生资源，而且主要产于新疆地区。由于阿魏要8年才能开花结实，而药材又在开花结实前采割，50年代阿魏年产量几千公斤，由于大量垦荒造田和不合理采收使植株死亡或失去生长繁殖能力，加之春季阿魏生育期正值牧草缺少季节，放牧影响了阿魏生长。自从70年代以来，随着阿魏资源的过度开发和生态环境的破坏，阿魏药用植物资源在自然条件下濒临灭绝，现在新疆阿魏和阜康阿魏皆被列为国家三级保护植物，其植物资源处于濒危的边缘。同时，新疆地区的阿魏植物中仅具蒜样异臭的少数几种阿魏所提取的树脂才能作为药用，其他多达16种阿魏虽然数量和面积都非常大，也有块状树脂溢出，但无特异臭味， 称为香阿魏，不能药用。目前药用阿魏一般通过以下方法鉴定一是性状鉴别，通过外观、颜色、气味等进行鉴别，误鉴率较高，二是化学鉴定，虽然鉴别相对性状鉴别比较准确，但实施要求较高，不易进行，而且仍有很高的误鉴率。ISSR 分子标记是简单序列重复区间 Qnter Simpie Sequence Repeat, ISSR)DNA 标记技术，结合了 SSR和RAPD的优点，具有模板需要量少，多态性丰富，成本低，操作简单， 稳定性高等优点，而较之AFLP又具技术要求较低的特点。近年来ISSR已广泛应用于品种鉴定、种质资源和遗传多样性研究等领域。由于ISSR分子标记技术是基于PCR的一种分子标记技术，其扩增结果受模板DNA 浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度等多种因素的综合影响，因此有必要筛选出ISSR分析对反应体系的最佳方法。
因此一种用ISSR分子标记法对新疆药用阿魏进行快速鉴别的方法就应运而生。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速鉴别新疆药用阿魏的方法，特别是一种用ISSR 分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的方法，以实现在人工繁育中保证品种的准确性和繁育的高效性。本发明通过以下技术方案实现
以新疆阿魏幼苗为材料，具体方法是将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-7(T -10(TC保存，待用；
所使用的引物序列(5—3)为(CT)8RC,所用的引物浓度为0. 6 0. 85vmol/L ； 基因组DNA的提取及DNA质量检测
采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA，用0. 6^1. 0%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定，并将DNA浓度稀释到l(T30ng/VL，于-18 保存备用；
检测所用的试剂dNIPs浓度为0. 4 0. 8mmol / L，Mg2+浓度为浓度为1. 0 1. 5mmol/L, Taq DNA 聚合酶浓度1. 0 1. 5U。采用本ISSR分子标记法对新疆药用阿魏进行品种鉴定、种质资源和遗传多样性进行研究，具有模板需要量少、多态性丰富、成本低、操作简单、稳定性高等优点，而较之 AFLP又具技术要求较低的特点。
具体实施例方式实施例1
材料处理将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-80°C保存，待用。所选引物与试剂实验所用TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker (DL2000)均购自 TaKaRa (宝)生物工程(大连)有限公司。ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Uniwersity of British Columbiii，UBC)所设计的引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使用的引物序列如下(5—3) =(CT)8RC0DNA提取及检验方法采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA (欧文军等， 2008)，用1.0%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将DNA浓度稀释到20ng/vL，于_20°C保存备用。实验条件
引物浓度0. 6vmol/L作为ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。DNTP 因此选用0. 4mmol/L浓度即可。Mg2+浓度为1. Ommol/L时，谱带清晰。DNA聚合酶浓度为1. OU时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并比较清晰的情况出现，即表明是我们需要的品种，否则或不出现条带则是我们不需要的品种。PCR产物检测用含EB (0.48 g-mL-1 )的1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 4在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。实施例2
材料处理将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于_75°C保存，待用。所选引物与试剂实验所用TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker (DL2000)均购自 TaKaRa (宝)生物工程(大连)有限公司。ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Uniwersity of British Columbiii，UBC)所设计的引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使用的引物序列如下(5——3) :(CT)8RC。DNA提取及检验方法采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA (欧文军等， 2008)，用0. 7%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将DNA浓度稀释到25ng/vL，于_20°C保存备用。实验条件
引物浓度0. 65vmol/L作为ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。DNTP 因此选用0. 8mmol/L浓度即可。Mg2+浓度为1. 2mmol/L时，谱带清晰。DNA聚合酶浓度为1. 2U时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并比较清晰的情况出现，即表明是我们需要的品种，否则或不出现条带则是我们不需要的品种。PCR产物检测用含EB (0.5 g · mL_l )的1. 8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。实施例3
材料处理将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-85 °C保存，待用。所选引物与试剂实验所用TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker (DL2000)均购自 TaKaRa (宝)生物工程(大连)有限公司。ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Uniwersity of British Columbiii，UBC)所设计的引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使用的引物序列如下(5——3) :(CT)8RC。DNA提取及检验方法采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA (欧文军等， 2008)，用0. 8%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将DNA浓度稀释到20ng/vL，于-18°C保存备用。实验条件
引物浓度0. 75vmol/L作为ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。DNTP 因此选用0. 8mmol/L浓度即可。Mg2+浓度为1. 5mmol/L时，谱带清晰。DNA聚合酶浓度为1. 4U时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并比较清晰的情况出现，即表明是我们需要的品种，否则或不出现条带则是我们不需要的品种。PCR产物检测用含EB (0. 52 g-mL-1 )的1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。
实施例4
材料处理将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-80°C保存，待用。所选引物与试剂实验所用TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker (DL2000)均购自 TaKaRa (宝)生物工程(大连)有限公司。ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Uniwersity of British Columbiii，UBC)所设计的引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使用的引物序列如下(5——3) :(CT)8RC。DNA提取及检验方法采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA (欧文军等， 2008)，用0. 6%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将DNA浓度稀释到20ng/vL，于-22°C保存备用。实验条件
引物浓度0. 85vmol/L作为ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。DNTP 因此选用0. 8mmol/L浓度即可。Mg2+浓度为1. 5mmol/L时，谱带清晰。DNA聚合酶浓度为0. 9U时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并比较清晰的情况出现，即表明是我们需要的品种，否则或不出现条带则是我们不需要的品种。PCR产物检测用含EB (0. 55 g · mL_l )的0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。实施例5
材料处理将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-78 °C保存，待用。所选引物与试剂实验所用iTaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker (DL2000)均购自 TaKaRa (宝)生物工程(大连)有限公司。ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Uniwersity of British Columbiii，UBC)所设计的引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使用的引物序列如下(5——3) :(CT)8RC。DNA提取及检验方法采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA (欧文军等， 2008)，用0. 6%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将DNA浓度稀释到25ng/vL，于_20°C保存备用。实验条件
引物浓度0. 70vmol/L作为ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。DNTP 因此选用0. 7mmol/L浓度即可。Mg2+浓度为1. 3mmol/L时，谱带清晰。DNA聚合酶浓度为0. 8U时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并比较清晰的情况出现，即表明是我们需要的品种，否则或不出现条带则是我们不需要的品种。PCR产物检测用含EB (0.5 g · mL_l )的0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。实施例6 材料处理将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗，待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-78 °C保存，待用。所选引物与试剂实验所用TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarker (DL2000)均购自 TaKaRa (宝)生物工程(大连)有限公司。ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学(Uniwersity of British Columbiii，UBC)所设计的引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。所使用的引物序列如下(5——3) :(CT)8RC。DNA提取及检验方法采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA (欧文军等， 2008)，用0. 6%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定， 并将DNA浓度稀释到25ng/vL，于-22°C保存备用。实验条件
引物浓度0. 75vmol/L作为ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。DNTP 因此选用0. 7mmol/L浓度即可。Mg2+浓度为1. 2mmol/L时，谱带清晰。DNA聚合酶浓度为0. 8U时观察是否扩增出的一些条带及清晰度。当出现条带并比较清晰的情况出现，即表明是我们需要的品种，否则或不出现条带则是我们不需要的品种。PCR产物检测用含EB (0.5 g · mL_l )的0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 在凝胶成像系统上观察电泳结果并记录凝胶图像。
权利要求
1. 一种用ISSR分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的方法，其特征在于主要采用以下过程实现以新疆阿魏幼苗为材料，具体方法是将解除休眠的新疆阿魏种子播于穴盘萌发幼苗， 待幼苗长出两片真叶时取样，液氮冷冻后于-7(T -10(TC保存，待用； 所使用的引物序列(5—3)为=(CT)8RC; 基因组DNA的提取及DNA质量检测采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA，用0. 6^1. 0%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定，并将DNA浓度稀释到l(T30ng/VL，于-18 保存备用；检测所用的引物浓度为0. 6 0. 85vmol/L，dNIPs浓度为0.4 0.8mmol / L，Mg2+ 浓度为浓度为1. 0 1. 5mmol/L, Taq DNA聚合酶浓度为1. 0 1. 5U。
全文摘要
本发明公开了一种用ISSR分子标记法对新疆药用阿魏品种进行快速鉴别的方法，以新疆阿魏幼苗为材料取样冷冻，所使用的引物序列(5---3)为(CT)8RC，所用的引物浓度为0.6～0.85vmol/L，采用改良的CTAB微量法提取基因组总DNA，用0.6~1.0%的琼脂糖电泳检测DNA质量，DNA的纯度和浓度用紫外分光光度计法测定，检测所用的试剂dNTPs浓度为0.4～0.8mmol／L，Mg2+浓度为浓度为1.0～1.5mmol/L，TaqDNA聚合酶浓度1.0～1.5U。采用本发明的方法对新疆药用阿魏进行品种鉴定、种质资源和遗传多样性进行研究，具有模板需要量少、多态性丰富、成本低、操作简单、稳定性高等优点，而较之AFLP又具技术要求较低的特点。
文档编号C12Q1/68GK102373269SQ20101025952
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者凯撒·苏来曼, 朱国强, 赵鑫, 阿依别克·热合木都拉 申请人:新疆维吾尔自治区中药民族药研究所