专利名称：一种检测志贺氏菌及其ipaH毒力岛的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测食品、水质以及临床样品中志贺氏菌属(幼/取//")细菌(痢疾杆菌)及 其ipaH毒力岛(PAI)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应技术检 测志贺氏菌污染的方法及所使用的试剂盒。
背景技术：
志贺氏菌属(SWgW/fl)细菌通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和危害人类健康的革 兰氏阴性肠道致病菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，可分为A群痢疾志贺氏菌 (幼.c(ysewen'ae)，通称志贺氏痢疾杆菌；B群福氏志贺氏菌(幼,^/tecwmO，通称福氏痢疾杆 菌；C群鲍氏志贺氏菌(幼.6o》W"'),通称鲍氏痢疾杆菌；D群宋内氏志贺氏菌(幼.SO""eO，通称宋内氏痢疾杆菌。志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素，作用于肠壁，使通透性增高， 从而促使毒素的吸收，继而作用于中枢神经系统及心血管系统，引起临床上一系列毒血症症 状，如发热、神志障碍，甚至中毒休克。其毒素破坏粘膜，形成炎症、溃疡，呈现典型的痢 疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经，使肠道功能紊乱，肠蠕动共济失调和痉挛，尤其直肠 括约肌最明显，因而发生腹痛、里急后重等症状。细菌的致病性主要由其毒力因子(如菌毛、鞭毛、内外毒素、酶等)决定，而控制这些 毒力因子的基因可以是染色体上某些特速的位点，也可以是由细菌的质粒或噬菌体所携带的 遗传成分，这些编码毒力相关的基因常在染色体上特点位置形成一段具有典型结构特征的基因簇，现在常被称为毒力岛(pathogenicity island, PAI)——首先是Hacker在研究泌尿道致 病性大肠杆菌时，发现"溶血素岛"，进一步研究发现该岛还含有其他致病基因，于1997年将 该岛命名为毒力岛(Haker I" Blum-Oehler G.， Muhldorfer I., et al. Pathogenicity islands of virulent bacteria structure, fUnction and impact on microbial evolution[J〗.MOL Microbiol. 1997，23:1089-1097)。目前已经在沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌等很多细菌中发现毒力岛，对细 菌的致病机理有了进一步了解。已经发现志贺氏菌具有如下毒力岛l)she毒力岛，大小为 4 607kb，位于p/zeF/及A^基因的3'端，主要编码整合酶和自动运输蛋白等；2) PAIs—SHI-2 毒力岛，毗邻^/C2WAC4基因位点，主要编码多重抗生素抗性蛋白；3)痢疾岛。Buysse等发现侵袭性质粒抗原H(invasiveplasmid,ipaH)同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不随 传代而丢失；近年来，通过比较基因组学分析，发现Sf301的染色体上有572kb特异性序列， 320个长度大于50bp的"痢疾岛"(sWge〃a island, Sis)，其中包括ipaH岛l一5 (赵丽华，万 成松.志贺氏菌毒力岛的结构和功能[J].医学分子生物学杂志，2006， 3 (4): 296—299;刘 红，杨帆，张笑冰，等.痢疾杆菌全基因组序列及其基因组岛的分析[J].中国工程科学，2003， 4(10):40-47.)。 ipaH作为志贺氏菌主要的侵袭性质粒抗原H，其ipaH毒力岛的发现与检测对 于研究志贺氏菌的毒力作用具有重要意义。食源性志贺氏菌流行的主要原因是从事食品加工行业人员患痢疾或带菌者污染食品，食 品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品温度不适当等。近年来，以痢疾志贺氏菌为主的 细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国在多个个省、区发生了不同规模流行。国家质量 监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定志贺氏菌为必检项目。目前对该菌的 检测，国家标准、行业标准等多采用传统培养、噬菌体裂解或酶联反应(ELISA)等方法， 这些方法主要存在操作烦琐、费时费力、周期长(一般至少需要4-6天)等缺点，而且受多 种因素干扰，给食品的进出口带来非常不利的影响，因此建立一种更加快速、准确、操作简 便的致病菌检测方法势在必行。国内外应用于食源性致病菌检测的分子生物学技术，主要有普通PCR技术、荧光PCR技 术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，而且成本较高， 一般实验 室不易开展；普通PCR技术虽然方法成熟、成本低，但需要对PCR产物进行后处理，极易导 致PCR产物污染，不易用于临床检测。实时荧光PCR技术是在PCR体系中加入荧光标记探针， 使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映 PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收 集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈 值(Ct)的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR将DNA扩增与检测过 程融合为一体动态检测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大大縮短了结果分析时间， 使得该方法更加快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶 胶污染和由此造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐 取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM " a/. Real-time PCR in virology.. Nucleic Acids Res. 2002 5;30(6): 1292-1305; Lie, Y.S.， Petropoulos, C丄，Advances in quantitative PCR technology: 5， nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 1998. 9， 4348.)，与传统 的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增 过程中有耙序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团 相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的 进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性， 一个关 键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，将该技 术应用于志贺氏菌的所有已知变异体之ipaH毒力岛基因多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。发明内容本发明的一个目的是提供一种实时荧光PCR技术定量检测样品中志贺氏菌属(SWge/Zfl) 细菌及其ipaH毒力岛基因存在的方法，从而判断是否有志贺氏菌污染的方法。基本原理是利 用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条耙多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶、高 质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg^等PCR反应缓冲液中，通过DA7600、 ABI 7500 等荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸 的目的。本发明提供的实时荧光定量PCR技术定性与定量检测临床样品中志贺氏菌属(SWge/to) 细菌及其毒力岛基因存在的方法，包括(1)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶 和(c) 2，-脱氧核苷三磷酸(dNTP)的扩增反应体系，以及包括(a)能够与待检双链耙多核 苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(b)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合 的反向引物，以及(c)能够与双链靶多核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发 生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针的荧光检测体系；(2)通过一次或多次聚合酶链反应 扩增所说的靶多核苷酸；(3)退火后使所说的荧光发生基团通过探针与靶多核苷酸结合并产 生荧光信号；(4)检测并确定荧光发生基团所产生的荧光量；(5)分析一次或多次扩增循环 所发出的荧光量，以检测靶多核苷酸的存在；特征在于其中所说的耙多核苷酸是志贺氏菌基因组多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是ipaH—F: 5，-gctgttgctgctgatgcca.3'(SEQIDNO: l)和ipaH—R: 5，-gat gcc tga tgg acc agg ag-3， (SEQ ID NO: 2)，以及由正向弓i物志贺氏斷paH—F向5，端方向延伸5个碱基、向3，端方向延伸5个碱基范围内得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列；以及由反向引物志贺氏菌ipaH—R向5，端方向延伸5个碱基、向3，端方向延伸5个碱基范围内所得到的引物序列或能与这段范围内的序列 可以杂交的引物序列；并且所使用的寡核苷酸探针是ipaH—P: 5'-aga get gtg agg acc gtg tcg cgc-3'(SEQIDNO: 3)，特征在于所使用的寡核苷酸探针序列包括寡核苷酸探针ipaH—P: 5'-agagctgtgaggaccgtgtcgcgc-3，(SEQIDNO: 3)，以及由寡核苷酸探针ipaH—P向5，端方 向延伸5个碱基、向3'端方向延伸5个碱基范围内得到的探针序列或能与这段范围内的序列可 以杂交的探针序列。与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时定量聚合酶链反应 方法可以在扩增反应的进程中实时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性 和精密度。如众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增中，同时加入引物和5'、 3'末端分别 标记有荧光报告基团(例如6-FAMamidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基 若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告 基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时， DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因 而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而 实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标 准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。如前所述，为了检测样品中可能存在的所有志贺氏菌，包括痢疾志贺氏菌(幼.办M她n'w)、 福氏志贺氏菌(幼^ex股n')、鲍氏志贺氏菌(幼.&qy力i)、宋内氏志贺氏菌(幼.so朋e!')，并能 够准确有效地将志贺氏菌污染与霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、沙 门氏菌、副溶血弧菌等志贺氏菌属的近缘菌属鉴别开来，设计并制备了实现这些目的的寡核 苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件对已知 的志贺氏菌变异体的基因组核苷酸序列进行同源性比较并找出同源区段的基础上，进一歩使 用适当的引物设计软件(例如Primer Express 2)选择并计具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引 物l: 5，-gctgttgctgctgatgcca-3， (19mrs) (SEQIDNO: 1)，引物2: 5，-gatgcctgatggacc aggag-3， (20mrs) (SEQIDNO: 2);以及具有下示序列的寡核苷酸探针5，-aga get gtg agg acc gtg tcg cgc-3， (24mrs) (SEQIDNO: 3)。引物所对应的扩增区段相当于志贺氏菌株ipaH 基因序列的保守区，长度为92bp。其中，引物1互补于细菌基因组的第1170—1220位核苷酸； 引物2互补于细菌基因组的第1251 — 1300位核苷酸；探针则互补于第1211 — 1250位核苷酸。由 于所设计的这些引物和探针均具有互补于志贺氏菌属ipaH毒力岛基因组保守区的序列，而且 与其他同源菌属的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶，所以大大减少 甚至避免了志贺氏菌检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5'端标记作为荧光发生基团(报道基团)的6-FAM amidite，并在其3'端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，可使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。使用常规DNA提取方法或市售的DNA提取试剂盒，从得自但不限于食品、水质以及临床粪便等样品中提取DNA，然后在含有引物l (ipaH-F)和2 (ipaH-R)(各14 pmol)、探针(ipaH-P)(8 pmol)、 dNTP (10mM)、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、PCR缓冲液和水的反应体系中，使用DA7600、 ABI7000型等其他结构类型的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是93"C预变性2分钟后，93°C 45秒，55°C l分钟，迸行10次循环后；93°C 30秒，55°C 45秒，共进行30次循环。反应完成后，借助装置上配置的自动分析系统分析结果。在本研究中，如果循环阈(Ct)值等于或大于28，结果即为阴性；如果Ct值小于28，结果则为阳性。其中以反应的前5 — 10个循环所产生的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置为3-8个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 一般说来，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。因为在扩增反应的Ct值之前的阶段，扩增系统中的酶、引物、探针和dNTPs均大大过量，而且系统的pH值和离子浓度等也相对稳定，所以此时扩增反应的效率是一个与模板数无关的饱和定值。与Ct值相关的只有起始模板数(多聚核苷酸样品的浓度)和与样品无关的PCR系统效率。可利用己知起始志贺氏菌浓度的标准品(如，用比浊法测定标准株培养物的细菌浓度)制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始浓度(志贺氏菌个数/mL)的对数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知样品靶多核苷酸的Ct值后，即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始志贺氏菌浓度的对数，然后计算出该耙多核苷酸的起始志贺氏菌浓度(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，为了基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始志贺氏菌浓度)，本发明的方法还进一歩包括(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量耙多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中志贺氏菌的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有DNA提取液、具有本领域已知的常规成分的PCR扩增反应液、阴性参考品、阳性参考品和阳性标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和逆向引物分别 是ipaH-F: 5,- get gtt get get gat gcc a -3， (SEQ ID NO: l)禾口ipaH-R: 5，- gat gcc tga tgg acc agg ag -3， (SEQ ID NO: 2)，其中正向引物ipaH-F可向5，和3'端方向各延伸5个碱基，反向引物ipaH-R 可向5'和3'端方向各延伸5个碱基。根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是 ipaH-P: 5，-agagctgtgaggaccgtgtcgcgc-3，(SEQIDNO: 3)，其中该寡核苷酸探针序列可向5， 和3'端方向各延伸5个碱基。可按照如上所描述的和试剂盒中所附使用说明书中指出的方法使用本发明的试剂盒。如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的所有志贺氏菌属中各菌群，并能够准确有 效地将志贺氏菌感染与霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、 副溶血弧菌等志贺氏菌属的近缘菌属的感染鉴别开来，本发明基于对这些变异体和相关细菌 基因组核苷酸序列的同源性比较，特别设计了适用本发明试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使 用这些引物和探针完成的实时定量检测，大大减小了志贺氏菌多核苷酸检测的假阳性和假阴 性。我们的实验证明，本发明检测志贺氏菌基因组核苷酸的精确度几乎为100%，灵敏度达到 1.0xl0'个细菌/ml。值得特别说明的是，为了确保本发明的志贺氏菌检测方法的准确性，我们还使用了来自 中科院生物制品研究院鲍氏志贺菌标准株(编号51313)作为阳性参考品，并且，还利用麦 氏比浊法测定上述志贺氏菌标准株10倍稀释成浓度梯度后作为志贺氏菌定量检测标准品。借 助这些额外参考品与定量标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所 谓的外标定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精确度和准确性，并作为生产本 发明试剂盒的附加的质量控制标准。另外，由于本发明试剂盒的扩增反应条件中所采用的退火温度为55'C，距离预定的实际 退火温度65'C相差达10'C左右。所以，即使样品中的靶核苷酸只有单个核苷酸的变异，也足 以保证荧光探针与靶核苷酸的结合及荧光信号的产生和释放。总之，本发明的实时荧光定量检测方法及试剂盒可以检测但不限于食品、水质及临床粪 便、肛拭子等标本中的志贺氏菌，可为灵敏、快速诊断志贺氏菌污染提供可靠的实验证据； 同时由于能准确定量，可以对临床治疗和预防重大食源性疾病的爆发具有重大意义。本发明提供的实时荧光定量检测方法及试剂盒可以检测出1.0xlO'个细菌/ml的浓度，说明 具有非常好的灵敏度。本发明针对志贺氏菌属的ipaH毒力岛基因保守区设计特异引物探针，能检测出志贺氏菌病原体，不能检测出非志贺氏菌病原体，说明具有很好的特异性，不会出现假阳性结果。本发明提供的实时荧光定量检测方法及试剂盒可以检测食品、水质及临床粪便、肛拭子 等样品中的志贺氏菌病原体及其ipaH毒力岛，不需要前期增菌培养，处理方法简单；不但可 以判断是否为志贺氏菌感染或污染，还可以判断是否具有致病性，可为灵敏、快速、早期诊 断与预防志贺氏菌感染提供可靠的实验证据；同时由于能准确定量，所以可对临床用药进行 有效监测。
图l显示(Stdcurve)窗口下的标准曲线。针对模板数为1.0X 1(^ 1.0X 1(^个志贺氏菌/ml 的反应体系进行TaqM旭PCR分析。当志贺氏菌个数为1.0X 10'时，检测样品的Ct值在24左右， 即检测下限灵敏度可达到1.0Xl(^个志贺氏菌/mL。绘制得到的标准曲线斜率为一3.11,在Y轴 截距为26.46， R2=0.9955。图2显示强中弱三份阳性标本的检测曲线。三份标本的Ct值分别是21.13、 13.65和7.82; 结合所绘制的扩增曲线呈S形，故可判定三份样品均为阳性。图3显示阴性标本的检测曲线。三个标本的扩增曲线为比较平直的折线，与荧光检测阈 值线没有交点，或者显示Ct值在28 30之间的范围内并且扩增曲线不具有S形特征。图4显示志贺氏痢疾杆菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌等标本的检 测曲线，标本均购自中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)和中国药品生物制品检定所并确认为 相应型别。扩增曲线呈S形，可判定被检样品均为阳性。图5显示阳性标本重复性实验的检测曲线，可看出不同的曲线均在同一Ct值范围，说明 试剂盒的重复性好。
具体实施方式
实施例l:志贺氏菌检鑭试剂的研制1、 引物探针的设计通过对Genbank数据库已有的全部志贺氏菌核酸序列以及国内外已发表 文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，选择ipaH基因中无二级结构且高度保守的区段， 根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。2、 反应体系的建立与优化样品的准备以中科院生物制品研究院购买的标准株51313作为志贺氏菌检测的阳性标准品；以霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌等作为阴性参考品。分别用DNA提取液煮沸法提取上述阳性标准品与阴性参考品的基因组DNA待用。引物探针的筛选以阳性标准品与阴性参考品的基因组DNA为检测对象，经反复试验， 筛选出特异性好的最佳引物探针组合。引物探针浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.15pmol/L至 0.5nmol/L浓度梯度的弓I物和从0.075nmol/L至0.25nmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经多 次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为0.35pmol/L、探针浓度为0.2nmol/L。镁离子浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从lmmol/L至 2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为 25mmol/L。酶用量的优化在4(HiL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U (酶单位)至 8U浓度梯度的酶用量/人份进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的酶用量为3U/人份。dNTPs浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至 0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0. 25、mol/L。反应温度的优化根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为93。C预变性2min;然后93'C 45s， 55°C lmin， 10个循环；最后93。C 30s, 55°C 45s， 30个循环。 3、灵敏度实验以麦氏比浊法测定上述志贺菌标准株纯培养物的浓度为1.0xl(^个/mL，然后梯度稀释成 1.0xl()5个/mL、 1.0xl()4个/mL、 1.0xl()3个/mL、 1.0xl()2个/mL、 1.0xl(^个/mL、 1.0xlO。个/mL 作为志贺氏菌阳性定量标准品，检测结果表明，本发明方法的最低检测下限为1.0xlO'个/mL。实施例2:志贺氏菌检測试剂盒及其使用1、 制备包括下列组成成分的试剂盒DNA提取液(500^1 /管)2管、PCR反应液20管、阴性 参考品U00^1/管)l管、临界阳性参考品(50jil/管)l管、阳性定量标准品(50nl/管)4管。2、 标本采集、运送和保存2.1粪便在发病早期(治疗前)采集粘液脓血粪便作床边接种，如不能及时接种可置甘油 保存液或卡-布运送培养基内送检。2.2标本保存和运送标本可立即用于测试，也可保存于-2(TC待测，保存期为6个月。标本 运送时应采用0"C冰壶。3、检测歩骤向粪便标本中加入4倍体积的生理盐水，轻轻震荡后置4'C冰箱过夜；用枪头或吸管混匀 后吸取1 ml至1.5ml离心管中，12，000rpm离心5分钟；去上清后，沉淀中加入50jil DNA提 取液充分混匀，IO(TC恒温处理10±1分钟，12,000 rpm离心5分钟，备用。然后分别取阴性参考品、标本、临界阳性参考品、定量标准品各5pl，加入PCR反应管中 进行PCR扩增。PCR循环条件是93"C预变性2min;然后93。C 45s， 55°C lmin， 10个循环； 最后93。C30s， 55°C45s， 30个循环。反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标 准曲线(Std curve )窗口下的标准曲线达到最佳(即R、0.97)(参见图l所示)。由图2和图3 可以看出，阳性标本的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值；由于 阴性标本的荧光曲线低于阈值，故没有Ct值。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测 定数值(Qty)，即标本中志贺氏菌的浓度(参加图2和图3)。实施例3:对确定志贺氏菌型别的标本进行检测具体步骤同实施例2，不同的是所用标本来自中国微生物菌种保藏中心和中国药品生物 制品检定所的志贺氏痢疾杆菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌。标本提取 核酸后用本发明的试剂盒进行PCR扩增，在扩增的同时由仪器自动监测并收集荧光信号的变 化。反应结束后分析，应用本发明的试剂盒均能检测出已知型别的标本(参见图4)。实施例4:临床标本检翻的重复性测试具体步骤同实施例2，不同的是所用标本为测序确定为志贺氏菌阳性的标本。提取核酸后 用本发明的试剂盒进行PCR扩增，每一份标本设置多个复管。在扩增的同时由仪器自动监测 并收集荧光信号的变化。反应结束后分析，应用本发明的试剂盒检测结果显示同一标本不同 的曲线均在同一Ct值范围内，此结果表明试剂盒具有良好的重复性。(参见图5)。序列表<i 10>中山人学达安基W股份有限公":)"20—种检测志贺氏菌及其ipaH毒力岛的方法及试剂盒<140><141><160>3<210> 1<211> 19<212>DNA<213>人T序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 1gctgttgctg ctgatgcca<210>2 <2'1>20 <212>DNA <213>人丁.序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 2gatgcctgat ggaccaggag<210>3 <211>24 <212> DNA <213>人丁序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400> 3agagctgtga ggaccgtgtc gcgc
权利要求
1. 一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测样品中志贺氏菌属(Shigella)细菌(痢疾杆菌)及其ipaH毒力岛(PAI)存在的方法，该方法包括(1)提供包括样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(5)分析扩增循环后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光监测体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸探针，特征在于所使用的寡核苷酸引物序列包括正向引物ipaH-F5’-gct gtt gct gct gat gcc a-3’(SEQ ID NO1)和反向引物ipaH-R5’-gat gcc tga tgg acc agg ag-3’(SEQ ID NO2)，由正向引物ipaH-F向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列；以及由反向引物ipaH-R向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内所得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列。
2、 根据权利要求l中荧光监测体系包括的寡核苷酸探针，特征在于所使用的寡核苷酸探 针序列包括寡核苷酸探针ipaH—P: 5'-agagctgtgaggaccgtgtcgcgc-3，(SEQIDNO: 3)， 以及由寡核苷酸探针ipaH—P向5'端方向延伸5个碱基、向3'端方向延伸5个碱基范围内得到的 探针序列或能与这段范围内的序列可以杂交的探针序列。
3、 根据权利要求l的方法，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b) 2'-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，和(d)能够与双 链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物；其中所说的荧光检测体系包括能够与靶多核苷酸 结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
4、 根据权利要求l的方法，所说的方法进一歩包括(1)确定样品中的耙多核苷酸经扩 增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶 多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品 中靶多核苷酸的量。
5、 根据权利要求l的方法，其中所说的样品选自但不限于食品、水质、患者粪便及肛拭子。
6、 根据权利要求l的方法，其中所说的志贺氏菌选自志贺氏菌属的任何一种变异株，包 括痢疾志贺氏菌(幼J"e"Zm'ae)、福氏志贺氏菌(幼.yfec"eW)、鲍氏志贺氏菌(幼.60^///)、宋 内氏志贺氏菌(S"o朋e/);其中所说的耙多核苷酸来自志贺氏菌。
7、 一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测临床样品中志贺氏菌的试剂盒，该 试剂盒包括(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性参考品、阳性参考品和阳 性标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
8、 根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和反向引物序列分别 是5，- get gtt get get gat gec a -3，禾卩5，- gat gec tga tgg acc agg ag -3，。
9、 根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针序列 是5,- aga get gtg agg aec gtg teg cgc -3,。
全文摘要
本发明涉及检测临床样品中志贺氏菌(Shigella)菌属细菌及其ipaH毒力岛(PAI)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术检测志贺氏菌(Shigella)菌属细菌的方法和试剂盒。
文档编号C12N15/11GK101235413SQ20071002660
公开日2008年8月6日 申请日期2007年1月30日 优先权日2007年1月30日
发明者何蕴韶, 王伟毅, 钢 程, 邓中平, 高秀洁 申请人:中山大学达安基因股份有限公司