专利名称：以TaqMan探针定量多聚酶链反应技术检测基因单点突变的方法
技术领域：
本发明涉及荧光定量多聚酶链反应(FQ-PCR)技术，特别涉及使用TaqMan 探针，以实时荧光定量多聚酶链反应(FQ-PCR)技术检测基因单点突变的方法。
背景技术：
聚合酶链反应(PCR)是一类最常用的DNA模板扩增技术，它是在特异性引 物存在时，利用DNA聚合酶的作用，在体外进行DNA链的人工扩增技术。在此基 础上发展起来的实时荧光定量PCR，是在普通PCR体系中加入了荧光探针或者染 料，最常用的是T叫Man探针。这些显色物质可以特异地同PCR扩增后的产物即 人工合成的DNA结合,随着PCR循环过程产物的不断增加其显色强度也及时增加， 即显色强度的大小和产物的多少呈正比关系。随着PCR循环数的增加，显色信号 到一定循环数后就达到一个阈值，此时的循环数称为阈值循环数(Ct值)。Ct 值与PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，根据Ct值即可准 确推断起始DNA模板的拷贝数[参见Higuchi et al, Biotechkology， 11: 1026-1030(1993)]。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR具有以下几个方面 明显的优点(1)实时荧光定量PCR将DNA模板的扩增过程与结果显示过程结合 起来，省去了扩增后的分析步骤，同时减少了污染机会；(2)常规PCR只是分析 反应终末产物，而实时定量PCR则可以检测PCR反应的全过程，并以此作为推断 模板起始量的基础；(3)由于采用荧光物质检测显示反应进程，故提高了定量检 测的灵敏度。然而，对于以FQ-PCR方法检测靶DNA序列的单点突变而言，如果所使用的两 个模板之间只有一个碱基的差异，如果只依靠引物/探针与待测模板间的匹配程 度不同，将很难区分这两个模板。为此，有人试图改进探针以期达到检测单点突变的目的。例如MGB技术即是借助提高引物/探针与被检测序列的匹配稳定性(Tm 值提高)，以扩大与存在一个不配对碱基序列之间的Tm值差异，从而实现对单点 突变序列的检测准确性[参见U.S. Patent 6,312,894];另外，利用分子信标技 术同样可以成功检测核酸序列的单点突变[参见U.S. Patent 7,081,336]。但是， 这些方法的技术要求和成本均较高。再一种相对简单的方法是根据PCR扩增引物 与模板的匹配程度不同来区分单一位点突变型与野生型序列间的差异，例如基于 扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)的方 法[参见C.R. Newton et al, Nucleic Acids Res, 17: 2503-2516(1989)],该 方法设计扩增引物的3'端的最后一个碱基与突变型碱基对应，相应野生型模板就 不能有效扩增。在这种定性的ARMS基础上，结合TaqMan定量技术，又发展了一种 TaqMAMA方法(Taqman mismatch amplification mutation assay), 该技术进一 步将非特异扩增时引物与模板之间的引物不匹配程度从3'端的最后一个碱基扩 展到了倒数第二个，使得引物和模板之间的不匹配碱基数达到两个以上，从而大 大降低了扩增效率。而特异性引物与模板之间，尽管的3'端倒数第二个碱基仍互 不匹配，但是由于最后一个碱基相互匹配，所以扩增效率受影响不大，比较两种 引物扩增同一模板的表现，由此得以成功地辨别单一位点突变[Warren E. Glaab et al, Mutation Research, 430: 1-12(1999)]。 T叫MAMA技术较好实现了以定 量PCR方法检测基因单点突变的问题，同时也没有额外增加检测成本。然而，该 方法仍存在三个主要缺陷(1)对某些突变位点的特异性不高；(2)没有提供合 适的质量控制方式，检测准确性难以得到保障，故并不适合于临床应用；(3)对 野生型纯合子、突变型纯合子及杂合子等三类遗传疾病常见基因型的检测缺乏明 确的结果判断方式。因此，有必要对基于TaqMAMA技术的单点突变检测方法进行适当的改进。发明内容本发明的目的是提供一种使用引物特异性荧光定量聚合酶链式反应(PS-FQ-PCR)检测DNA单点突变，以提高TaqMan实时荧光定量PCR检测DNA单点突变的准确 性和稳定性的方法，该方法包括以下步骤(1)提供待检耙核酸样品；(2)利用 PS-FQ-PCR扩增体系扩增并检测靶DNA片段；(3)以PS-FQ-PCR方法的双重标准确定检测的有效性；(4)根据所测得的ACt值判断样品为野生型、突变型或杂合子， 特征在于-(1)针对一个待检测的突变位点，每一个样品，确定突变与否需同时进行两 次FQ-PCR; (2) FQ-PCR扩增过程分为两阶段进行；(3)使用附加质控品和被检 测样本自身质控，两个标准判定检测的有效性；以及(4)根据测得的^Ct值判 断检测结果。本说明书中使用的术语包括"DNA单点突变"是遗传学术语，指突变型DNA 序列中具有一个碱基的突变。遗传学术语"野生型DNA"是指正常人固有的，未发生突变的DNA序列。遗 传学术语"突变型DNA"是指野生型DNA受到自然或人为因素的压力或影响， 产生了至少一个碱基变异的DNA序列。遗传学术语"纯合子"是指两个等位基因都是野生型或突变型，前者称为野 生型纯合子，后者成为突变型纯合子；"杂合子"是指两个等位基因中一个是野 生型，而另一个是突变型。"野生型临界阳性质控品"是指能用本方法明确检测为野生型模板的最小质 量DNA;"突变型临界阳性质控品"是指能用本方法明确检测为突变型模板的最 小质量DNA。Ct值是指使用FQ-PCR反应方法检测DNA序列突变时，获得超过荧光信号阈 值所需的PCR循环数目。每次FQ-PCR反应的结果由英文縮写"Ct"表示；"CtA" 和"CtB"分别代表本方法用野生型引物和突变型引物检测同一个样本的Ct值； 英文縮写符号'、Ct"代表CtA值与CtB值的差值；纯合子阈值和杂合子阈值是 为判定检测结果而设定的两个不同的^t，其中纯合子阈值大于杂合子阈值。根据本发明方法的优选实施方案，其中所说的FQ-PCR扩增过程分为两阶段 首先在褪火和扩增时间相对较短、条件相对严格的条件下完成的第一扩增阶段； 和在褪火和扩增时间相对较长、而且反应条件相对宽松的条件下完成的第二扩增 阶段。根据本发明方法的优选实施方案，其中用于判定检测方法的有效性的双重标 准是标准l:每次检鑭都需检测临界质控品，使用野生型PCR反应液(含野生型 引物)和突变型PCR反应液(含突变型引物)分别检测野生型临界阳性质控品和突变型临界阳性质控品，并且都正确；标准2:对每份样品均需同时使用野生 型引物(A)和突变型引物(B)完成两次FQ-PCR反应，然后根据两次FQ-PCR 所得出的ACt值(绝对值)作为质量控制标准，ACt值应大于纯合子阈值或小于 杂合子阈值。
根据本发明方法的优选实施方案,按照下述标准判定被检序列是纯合子或是 杂合子1)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果CtZ小于Cti ，则该样品即可 判定野生型纯合子；2)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果Ct5小于CtA则 该样品即可判定为突变型纯合子；3)在ACt小于杂合子阈值的情况下，则该样 品即应是杂合子。
众所周知，基于PCR技术检测DNA单点突变方法的准确性和特异性，取决于 方法中所使用的引物或者探针与被扩增模板之间的配对程度。然而，目前普遍使 用的TaqMan荧光探针FQ-PCR技术，不能保证检测的准确性和特异性。单点突变 的特点就是突变型模版与野生型模板之间只有一个碱基的差异，而所使用的引物 或探针通常至少都有十几个以上碱基， 一个碱基的改变对配对程度的影响有限。 本发明人在现有技术的基础上，方法在原有FQ-PCR方法的基础上改进，成为 PS-FQ-PCR方法，保留了定量PCR简便和高效的优点，提高了它检测DNA点突变 的准确性和稳定性。
根据本发明的PS-FQ-PCR方法，针对待检测的点突变位点，设计并合成野生 型和突变型两对引物，其中的正向引物3'端的最后一个碱基位于突变位点，而 倒数第二位碱基则与模板不匹配。正向引物的最后一个碱基分别与野生型模板和 突变型模板匹配，前者称野生型引物(A)，后者则是突变型引物(B)。两对引物 使用同一条引物作为反向引物。或者，也可以将反向引物与正向引物的位置互换。 荧光探针通常是共用的，并且探针序列的位置应是位于一对引物之间的区域。探 针属于Taqman探针。
根据本发明的检测方法，其特征在于对同一个待检目的序列，需要使用一对 野生型引物(A)进行一次FQ-PCR检测，同时使用另一对突变型引物(B)进行 另一次FQ-PCR检测。
待检靶梭酸样晶包括被检者的血液、组织、羊水细胞和精液等。 在本发明的PS-FQ-PCR方法中，发明人优化了定量PCR反应体系的配制和组成，使FQ-PCR反应中各组份构成比例最佳化，保证特异性的定量扩增曲线呈"S"， 并且每次扩增后，除目的扩增条带以外没有其他非特异条带。每5(V1PCR反应 体系中，基本上包含下列组成成分正向、反向扩增引物(各10pmol4il); TaqMan 荧光探针(10pmol/nl)， 1.5^1; dNTPs(10mM)， 1.0 pi; 10XPCR反应缓冲液， 5.0^1; Taq酶 (lU/pl), 2.0 UNG酶(崎1)， 0.5pl;模板，5雞1;双蒸 水(ddH20)， 33.0 nl。可根据反应总体积的大小，按照比例适当地增加或减少 体系总各成分的加入量。
本发明PS-FQ-PCR方法中，FQ-PCR反应所使用的缓冲液是(NH4) 2S04缓 冲液(由750mMTris-HCl(pH8.8在25。C)、200mM (NH4)2S04、 0.1% Tween20、 50 mM MgCl2组成)，可以根据所扩增序列的特殊情况例如CG碱基含量高和/或 重复序列多等，在反应混合物中加入甜菜碱、甲酰胺和二甲基亚砜等PCR反应添 加剂，以减少二级结构和高CG含量对PCR反应的影响。
根据本发明的方法，其中所使用的野生型PCR反应液(含野生型引物)由 野生型引物、TaqMan荧光探针、dNTPs、 PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、 模板等组成;所使用的突变型PCR反应液(含突变型引物)由突变型引物、TaqMan 荧光探针、dNTPs、 PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、模板组成。
按照本发明的PS-FQ-PCR方法，我们将FQ-PCR反应过程分为四个阶段"阶 段1"，是UNG酶作用阶段；"阶段2"，是模板变性阶段；"阶段3"和"阶段4" 是温度循环阶段(参见图1)。
如众所周知，"阶段l"是在大约5(TC作用几分钟，以消除前次PCR产物污 染；"阶段2"是在大约94'C高温作用几分钟，打开DNA模版双链，以利于模版 的扩增。
本发明方法的温度循环使用双温度循环，并且由3和4两个阶段组成，其 中阶段3的循环数相对较少，褪火时间相对较短，而且条件相对严格，目的在于 提高检测的特异性；阶段4中扩增的循环数相对较多，褪火和扩增时间相对较长， 而且反应条件相对宽松，目的在于借以保证检测的灵敏度。
可以使用ABI系列定量PCR装置完成本发明的方法。
本发明PS-FQ-PCR方法中，使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)系统(由尿 嘧啶DNA糖基化酶和四种脱氧核糖核酸(NTP)组成)防止PCR反应混合物的污染。在四种脱氧核糖核酸(dATP:dCTP:dGTP:dUTP)的摩尔数之比为1:1:1:2情 况下，UNG酶的加入量通常为0.5U/PCR反应。
按照本发明的方法，按照本领域专业技术人员熟知的人类基因组DNA质量判 定标准，其中被检测基因组DNA模板的下限为25ng。
总之，本发明建立了检测人类基因组DNA中单点突变的PS-FQ-PCR检测系统 和检测DNA单点突变的方法。本发明的方法显著地提高了使用TaqMan探针实时 荧光定量PCR技术检测人类基因组DNA中单点突变的准确性和稳定性，可广泛用 于基因单点突变的检测。本发明借助对发生了单点突变的CYP2C9、 FACTOR 2、 Apo B和TPMT四个基因的检测，证明本发明的方法是具有普遍适用性的。与已 知的FQ-PCR方法相比，本发明方法的优点在于操作简单、准确可靠、并且更适 于临床应用。
图1显示在实时荧光定量PCR仪运行的反应条件和荧光采集位置的设置。在 图中，黄色直方图部分表示荧光信号采集时段；1、 10、 30代表该步骤的重复次 数；98、 58代表摄氏温度；4:00、 0:30、 0:45、 0:15、 l:00表示时间。
图2显示CYP2C9*1纯合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct值)， 纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是CYP2C9W PCR反应液管生成的曲线， 靠右边的'S'型曲线是CYP2CW3PCR反应液管生成的曲线。可见CYP2C9*1 PCR 反应液管Ct值远低于CYP2C9*3PCR反应液管Ct值。
图3显示CYP2C9*3纯合子的PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct值)， 纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是CYP2CW3PCR反应液管生成的曲线， 靠右边的'S'型曲线是CYP2C9+1 PCR反应液管生成的曲线。可见CYP2C9*3 PCR 反应液管Ct值远低于CYP2C9*1PCR反应液管Ct值。
图4显示CYP2C9*l/*3杂合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct 值)，纵轴表示荧光强度；两条'S'型曲线分别表示CYP2C9*1 PCR反应液管和 CYP2C9*3 PCR反应液管生成的曲线。可见CYP2C9*1 PCR反应液管和CYP2C9*3PCR 反应液管Ct值接近。
图5显示FACTOR II野生型纯合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是野生型PCR反应液管生
成的曲线，靠右边的'S'型曲线是突变型PCR反应液管生成的曲线。可见野生 型PCR反应液管Ct值远低于突变型PCR反应液管Ct值。
图6显示FACTOR II突变型纯合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct 值)，纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是突变型PCR反应液管生成的 曲线，靠右边的'S'型曲线是野生型PCR反应液管生成的曲线。可见突变型PCR 反应液管Ct值远低于野生型PCR反应液管Ct值。
图7显示FACTOR II杂合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct值)， 纵轴表示荧光强度；两条'S'型曲线分别表示野生型PCR反应液管和突变型PCR 反应液管生成的曲线。可见野生型PCR反应液管与突变型PCR反应液管的Ct值 接近。
图8显示TPMT野生型纯合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct值)， 纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是野生型PCR反应液管生成的曲线， 靠右边的'S'型曲线是突变型PCR反应液管生成的曲线。可见野生型PCR反应 液管Ct值远低于突变型PCR反应液管Ct值。
图9显示TPMT3C突变型纯合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct 值)，纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是突变型PCR反应液管生成的 曲线，靠右边的'S'型曲线是野生型PCR反应液管生成的曲线。可见突变型PCR 反应液管Ct值远低于野生型PCR反应液管Ct值。
图10显示TPMT3C杂合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示循环数(Ct值)， 纵轴表示荧光强度；两条'S'型曲线分别表示野生型PCR反应液管和突变型PCR 反应液管生成的曲线。可见野生型PCR反应液管和突变型PCR反应液管Ct值接 近。
图11显示Apo B基因G10658A位点野生型纯合子PS-FQ-PCR分型结果。横 轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是野生型PCR 反应液管生成的曲线，靠右边的'S'型曲线是突变型PCR反应液管生成的曲线。 可见野生型PCR反应液管Ct值远低于突变型PCR反应液管Ct值。
图12显示Apo B基因G10658A位点突变型纯合子PS-FQ-PCR分型荧光定量 结果。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度；靠左边的'S'型曲线是突变型PCR反应液管生成的曲线，靠右边的'S'型曲线是野生型PCR反应液管 生成的曲线。可见突变型PCR反应液管Ct值远低于野生型PCR反应液管Ct值。 图13显示Apo B基因G10658A位点杂合子PS-FQ-PCR分型结果。横轴表示 循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度；两条'S'型曲线分别表示野生型PCR反 应液管和突变型PCR反应液管生成的曲线。可见野生型PCR反应液管和突变型 PCR反应液管Ct值接近。
发明的
具体实施例方式
以下通过对检测四个基因的点突变的描述，举例描述本发明。 实施例l: CYP2C9基因*1和*3分型
1、 引物和荧光探针设计
从GenBank数据库中调出CYP2C9基因全顺序AL359672，找出包含CYP2C9*3 突变位点所在的第七外显子的基因组DNA序列。找到CYP2C9+3的突变位点，即 外显子A1075G突变位点，该点如果是碱基"A"则该模板是CYP2C9*1型(野生 型)，如果是碱基"G"则该模板是CYP2CW3型。
应用ABI Primer Express 3. 0软件设计Taqman探针FQ-PCR分析所需引物 和探针。并在引物设计软件OLIGO的辅助下，评价所设计的引物和探针可用性。 引物和探针的序列如下
引物序列-
CYP2C9-3W-F (野生型正向引物)5'GTGCACGAGGTCCAGAGATAGA3， (SEQIDN0:1) CYP2C9-3M-F (突变型正向引物)5'TGCACGAGGTCCAGAGATAAC3' (SEQ ID N0:2) CYP2C9-3-R (反向引物)5'TTTCTGAATTTAATGTCACAGGTCACT3' (SEQ ID NO:3) 荧光探针序列
CYP2C9-3-P (探针)5， TGACCTTCTCCCCACCAGCCTGC 3'(SEQ ID N0:4)
被扩增区DNA片段位于CYP2C9基因3'端非翻译区，由于正向引物的位置野 生型引物靠前一位，所以，使用野生型引物所得到的扩增产物全长79bps，使用 突变型引物所得到的PCR扩增产物全长为78bps。
2、 样品的准备和处理
取全血lml加至干燥玻璃试管中，并向其中加入生理盐水lml轻摇混匀。然后，向另一干燥的玻璃试管加入lml淋巴细胞分离液，并将稀释好的全血缓慢 加入到含有淋巴细胞分离液的试管中。2,000 rpm离心20分钟后，吸取白细胞 层加入1. 5ml离心管中并用生理盐水补足体积到lml，混匀。再以4, 000rpm离 心5分钟洗细胞后，加入50 u 1 DNA提取液(20mMNaOH、 10mMTris-Hcl (PH8. 0)、 l%TritonX-100、 1%NP-40、 2%Chelex-100、 0. 5mMEDTA, pH8.0)充分混匀，常规 提取得到所需的DNA备用。
3、 FQ-PCR反应
每人份PS-FQ-PCR反应液(50u l)包含正、反向引物(10pmol/y l)各1.0 yl;荧光探针(10pmol/iil) 1.5nl: dNTPs (10mM) lyl; IOXPCR反应缓冲 液5ul; MgC12 (25mM) 10ul; ddH20 23.0yl; DNA模板5ul; Taq酶2ul (1U/ul)和UNG酶0.5ul (lU/yl)。
将10yl待检DNA样本分为两等份，将样品分别加入两个PCR反应管内并进 行FQ-PCR检测。两反应管分别装有含野生型引物的PCR反应液A，和含有突变 型引物的PCR反应液B。
本检测采用ABI7300荧光定量PCR仪。PCR扩增及检测条件如图1所示。
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Ampplot窗口。选择分 析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start: l至4 stop: 8至12, 并打开manual设定Threshold: 100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings 窗口 ，将Post Run Settings中Log改为Linear,OK后打开Analysis preferences 窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果,得到每次检测的Ct值。
4、 判断实验有效性
1) 野生型模板临界质控品和突变型模板临界质控品均分别检测为野生型纯 合子和突变型纯合子；
2) 对每一样品，用PCR反应液A和PCR反应液B同时进行FQ-PCR检测，两 者Ct值相减得到ACt， ACt绝对值大于等于纯合子阈值(5)或小于等于杂合子 阈值(3)表示对该样品的检测有效。如果ACt值在3到5之间，说明被检样品 的检测无效，应检査样品DNA浓度、试剂、仪器、反应条件等方面的误差。
5、 CYP2C9分型结果判定
在满足实验有效性标准的条件下，每份待检测样品可能是以下三种结果之一1)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果Ct力小于CtA则该样品即可判定
CYP2C9W纯合子(参见图2); 2)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果Ct5小 于CtA则该样品即可判定为CYP2C9+3纯合子(参见图3); 3)在ACt小于杂合 子阈值的情况下，则该样品即应是杂合子(参见图4)。
实施例2: FACTOR II基因分型 一、引物和荧光探针设计
从GenBank数据库中调出FACTOR II基因全顺序AF478696,找出包含FACTOR II突变位点所在的基因组DNA序列。找到突变位点，即G20210A突变位点，如 果该位点是碱基"G"则该序列是野生型；如果是碱基"A"则该序列是突变型。
应用ABI Primer Express 3. 0设计Taqman PCR分析所需引物和探针，在引 物设计软件OLIGO的辅助下，评价设计出的两对、三条引物和一条荧光探针。引 物和探针的序列如下
引物序列
FFII1 (野生型正向引物):5' ATA磁GTGACTCTCAGTG 3' (SEQ ID NO:5) FFII2 (突变型正向引物):5' ATAAAAGTGACTCTCAGTA 3' (SEQ ID NO:6) FFII3 (反向引物)5' GTGGTGGATTCTTAAGTCTT 3' (SEQ ID NO:7)
荧光探针序列
FPFII: 5， cctcaatgctcccagtgctattcatgggca 3， (SEQ ID N0:8)
被扩增区位于FACTOR II基因3'端非翻译区，全长104bps。 二、样品的准备和处理 同"实施例1"。 三、PS-FQ-PCR反应体系设置，仪器及反应条件设置 每人份PS-FQ-PCR反应液(50ul)包含正、反向引物(10pmol/ul)各1.0 Pi;荧光探针(10pmol/p 1) L5ul; dNTPs (10mM) lul; IOXPCR反应缓 冲液5ul; MgC12 (25mM) 10 nl; ddH20 23.0ul; DNA模板5nl; Taq酶2 (lU/ul)和UNG酶0.5ul (lU/ul)。
每个样本同时用两个PCR反应管检测，其中一管含野生型引物称PCR反应液 A，另一管含突变型引物称PCR反应液B。本检测采用ABI7300荧光定量PCR仪。 PCR扩增及检测条件见图l。反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开A卿plot窗口。选择分 析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start: l至4 stop: 8至12， 并打开manual设定Threshold: 100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings 窗口 ，将Post Run Settings中Log改为Linear,OK后打开Analysis preferences 窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果,得到每次检测的Ct值。4、 判断实验有效性1) 野生型模板临界质控品和突变型模板临界质控品均分别检测为野生型纯 合子和突变型纯合子；2) 对每一样品，用PCR反应液A和PCR反应液B同时进行FQ-PCR检测，两 者Ct值相减得到ACt， ACt绝对值大于等于纯合子阈值(5)或小于等于杂合子 阈值(3)则表示对该样品的分型检测有效，这个值在3到5之间，则对该样品 分型检测无效，应检査样品DNA浓度、试剂、仪器、反应条件等方面的误差。5、 检测结果判定在满足实验有效性标准的条件下，每份待检测样品可能是以下三种结果之 一1)在ACt大于纯合子阙值的情况下，如果CW小于CtA则该样品即可判定 野生型纯合子(参见图5); 2)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果CtS小于 CtA则该样品即可判定为突变型纯合子(参见图6); 3)在ACt小于杂合子阈值 的情况下，则该样品即应是杂合子(参见图7)。实施例3: TPMT基因3C突变检测试剂盒 一、引物和荧光探针设计过程从GenBank数据库中调出TPMT基因全顺序NM—000367，找出包含TPMT3C突 变位点所在的基因组DNA序列。找到突变位点，即A719G突变位点，该点如果是 碱基"A"则该序列是野生型，如果是碱基"G"则该序列是TPMT3C突变型。应用ABI Primer Express 3.0设计Taqman PCR分析所需引物和探针，在引 物设计软件0LIG0的辅助下，评价设计出的两对、三条引物和一条荧光探针。引 物和探针的序列如下引物序列-T10-wr(野生型反向引物)5' GTCTCATTTACTTTTCTGTAAGTAGTT 3' (SEQIDN0:9) T10-mr(突变型反向引物)5' GTCTCATTTACTTTTCTGTAAGTAGTC 3' (SEQ IDNO:IO) T10-f (正向引物) 5'TTCTTGTTTCAGGTAAAATATGC 3' (SEQIDNO:ll) 荧光探针序列T10-p: 5, CGTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTTTTGAAGAAC 3' (SEQIDNO:12) 被扩增区位于TPMT基因第10个外显子，全长132bps。 二、样品的准备和处理 同"实施例1"。 三、PS-FQ-PCR反应体系设置，仪器及反应条件设置每人份PS-FQ-PCR反应液(50ul)包含正、反向引物(10pmol/"l)各 1.0 wl;荧光探针(10pmol/yl) 1.5ul; dNTPs "0mM) IOXPCR反应缓冲 液5ul; MgC12 (25mM) 10yl; ddH20 23.0ul; DNA模板5ul; Taq酶2yl (lU/ul)和UNG酶0.5ul (1U/ul)。每个样本同时用两个PCR反应管检测，其中一管含野生型引物称PCR反应液 A，另一管含突变型引物称PCR反应液B。本检测采用ABI7300荧光定量PCR仪。PCR扩增及检测条件见图1。反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Ampplot窗口。选择分 析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start: l至4 stop: 8至12， 并打开manual设定Threshold: 100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings 窗口，将Post Run Settings中k)g改为U廳r，OK后打开Analysis preferences 窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果，，得到每次检测的Ct值。4、判断实验有效性1) 野生型模板临界质控品和突变型模板临界质控品均分别检测为野生型纯 合子和突变型纯合子；2) 对每一样品，用PCR反应液A和PCR反应液B同时进行FQ-PCR检测，两 者Ct值相减得到ACt， ACt绝对值大于等于纯合子阈值(5)或小于等于杂合子 阈值(3)则表示对该样品的分型检测有效，这个值在3到5之间，则对该样品 分型检测无效，应检査样品DNA浓度、试剂、仪器、反应条件等方面的误差。5、检测结果判定在满足实验有效性标准的条件下，每份待检测样品可能是以下三种结果之 一1)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果"/1小于(;1:&则该样品即可判定 野生型纯合子(参见图8); 2)在^Ct大于纯合子阈值的情况下，如果Ct5小于 CtA则该样品即可判定为突变型纯合子(参见图9); 3)在ACt小于杂合子阈值 的情况下，则该样品即应是杂合子(参见图10)。实施例4: Apo B基因突变检测试剂盒一、 引物和荧光探针设计从GenBank数据库中调出Apo B基因全顺序AB045146,找出包含Apo B突变 位点所在的基因组DNA序列。找到突变位点，即G10658A突变位点，该点如果是 碱基"G"则该序列是野生型，如果是碱基"A"则该序列是Apo B基因突变型。应用ABI Primer Express 3. 0设计Taqman PCR分析所需引物和探针，在引 物设计软件OLIGO的辅助下，评价设计出的两对、三条引物和一条荧光探针。引 物和探针的序列如下引物序列ApoBQ-wf(野生型正向引物)5' TTACTTGAATTCCAAGAGCACATG 3' (SEQIDN0:13) ApoBQ-mf (突变型正向引物)5' CTTACTTGAATTCCAAGAGCACAGA 3' (SEQ ID NO: 14)ApoBQ-r4 (反向引物)5' GCCCTCTAGCTGTAAGTGGTTTTT 3' (SEQ ID NO: 15)荧光探针序列ApoBQ-p:5 ， AGAAGCCACACTCCAACGGATATATGGTCT 3' (SEQ ID NO:16)被扩增区全长169bps 。二、 样品的准备和处理 同"实施例l"三、 PS-FQ-PCR反应体系和反应条件每人份PS-FQ-PCR反应液(50ul)包含正、反向引物(lOpmol/ul) 各 l.Oul;荧光探针(10pmol/ul) 1.5p1; dNTPs (10mM) lul; 10XPCR 反应缓冲液5ul; MgC12 (25mM) 10ul; ddH20 23, 0 p 1; DNA模板5ul; Taq 酶2ul (lU/ul)和UNG酶0.5ul (lU/ul)。每个样本同时用两个PCR反应管检测，其中一管含野生型引物称PCR反应液，另一管含突变型引物称PCR反应液B。 本检测采用ABI7300荧光定量PCR仪。 PCR扩增及检测条件见图1。反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开A即plot窗口。选择分 析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start: l至4 stop: 8至12, 并打开manual设定Threshold: 100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings 窗口，将Post Run Settings中Log改为Uneax，OK后打开Analysis preferences 窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果，得到每次检测的Ct值。4、 判断实验有效性1) 野生型模板临界质控品和突变型模板临界质控品均分别检测为野生型纯 合子和突变型纯合子；；2) 对每一样品，用PCR反应液A和PCR反应液B同时进行FQ-PCR检测，两 者Ct值相减得到ACt， ACt绝对值大于等于纯合子阈值(5)或小于等于杂合子 阈值(3)则表示对该样品的分型检测有效，这个值在3到5之间，则对该样品 分型检测无效，应检查样品DNA浓度、试剂、仪器、反应条件等方面的误差。5、 Apo B分型结果判定在满足实验有效性标准的条件下，每份待检测样品可能是以下三种结果之 一1)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果Ct^小于CtA则该样品即可判定 野生型纯合子(参见图11); 2)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果Ct5小于 CtA则该样品即可判定为突变型纯合子(参见图12); 3)在ACt小于杂合子阈 值的情况下，则该样品即应是杂合子(参见图13)。序列表〈110>中山大学安达基因股份有限公司<120>以TaqMan探针定量多聚酶链反应技术检测基因单点突变的方法<藩<141><160> 16<210> 1 <211> 22 <212> ■ <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷^序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 1GTGCACGAGGTCCAGAGATAGA〈210> 2 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 2TGCACGAGGTCCAGAGATAAC<210〉 3 <211> 27 <212>腿 <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 3TTTCTGAATTTAATGTCACAGGTCACT<210> 4<211> 23<212> DNA 〈213>人工序列 <220〉<223>根據待定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。<400〉 4TGACCTTCTCCCCACCAGCCTGC<210〉 5 〈211〉 19 <212〉腿 <213〉人工序列 <220><223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 5ATAAAAGTGACTCTCAGTG<210> 6 <211〉 19 <212> DNA 〈213>人工序列 <220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 6ATAAMGTGA CTCTCAGTA〈210〉 7 <211> 20 〈212> DNA <213>人工序列 〈220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 ■> 7GTGGTGGATT CTTMGTCTT<210> 8 <211> 30 〈212> DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷^序列设计，以用作PCR扩增的探针。 〈 8CCTCMTGCT CCCAGTGCTA TTCATGGGCA<210> 9 <211> 27 <212> DNA <213〉人工序列 <220><223>根掘特定核苷BI序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400> 9GTCTCATTTACTTTTCTGTMGTAGTT<210> 10 <211> 27 〈212> DNA <213>人工序列 <220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PC財广增的引物。 <400> 10GTCTCATTTACTTTTCTGTAAGTAGTC<210> 11 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <柳> 11TTCMCTTTCAGGTMATATTCG<210> 12 <211> 34 <212> ■ <213>人工序列 〈220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 ■> 12CGTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTTTTGAAGAAC<210> 13 <211> 24 <212> ■ <213>人工序列 <220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 13TTACTTGMTTCCMGAGCACATG〈210> 14 <211> 25 <212〉 DNA <213>人工序列 <220><223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 14CTTACTTGAATTCCAAGAGCACAGA<210> 15 <211> 24 <212〉 ■ <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 15GCCCTCTAGCTGTMGTGGTTTTT<210> 16 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400〉 16AGMGCCACA CTCCMCGGA TATATGGTCT
权利要求
1. 一种使用引物特异性荧光定量聚合酶链式反应(PS-FQ-PCR)检测DNA单点突变的方法，该方法包括以下步骤(1)提供待检靶核酸样品；(2)利用PS-FQ-PCR扩增体系扩增并检测靶DNA片段；(3)以PS-FQ-PCR方法的标准确定检测的有效性；(4)根据所测得的ΔCt值判断野生型、突变型和杂合子。特征在于(a)针对一个待检测的突变位点，每一个样品，确定突变与否需同时进行两次FQ-PCR；(b)FQ-PCR扩增过程分为两阶段进行；(c)使用附加质控品和被检测样本自身质控两个标准判定检测的有效性；以及(d)根据每个样品两次FQ-PCR测得的ΔCt值判断检测结果。
2、 根据权利要求l的方法，其中所说对一个待检测突变位点， 一个样品需要 做两次FQ-PCR检测，即用野生型PCR反应液(含野生型引物)和突变型PCR反应 液(含突变型引物)分别进行FQ-PCR检测。
3、 根据权利要求1的方法，其中所说的FQ-PCR扩增过程分为两阶段包括首 先在褪火和扩增时间相对较短，而且条件相对严格的条件下扩增，然后在褪火和 扩增时间相对较长，而且反应条件相对宽松的条件下扩增。
4、 根据权利要求1的方法，其中用于判定检测的有效性的双重标准是标准 1:每次检测样品同时需分别检测野生型临界阳性质控品和突变型临界阳性质控 品，每个质控品需检测准确；和标准2:对每份样品均需同时使用野生型引物(A) 和突变型引物(B)完成两次FQ-PCR反应，两次FQ-PCR所得出的ACt值绝对值 需大于纯合子阈值或小于杂合子阈值。
5、 根据权利要求1的方法，按照下述标准判定被检序列是纯合子或是杂合 子1)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果CU小于Ct5，被检标本可判定为 野生型纯合子；2)在ACt大于纯合子阈值的情况下，如果CtS小于CtA标本即 判定为突变型纯合子；3)在ACt小于杂合子阈值的情况下，被检标本即判定为 杂合子。
6、 根据权利要求l的方法，其中待检靶核酸样品来自被检者的血液、组织、 羊水细胞和精液。
全文摘要
本发明提供了一种使用TaqMan探针的实时荧光定量多聚酶链反应(FQ-PCR)技术。该方法针对一个待测DNA点突变位点，对一个待测样品，分别用特异引物和非特异引物进行FQ-PCR检测，通过两次反应Ct值大小的比较及两者差值△Ct的大小，判断该突变位点是野生型纯合子、突变型纯合子和杂合子三者之一。本发明方法的特点在于，使用特殊的PCR体系，独特的PCR反应过程，特征性的检测有效性标准，以及明确的结果判断方式，提高了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测单点突变的准确性和稳定性，适合临床实验室使用。
文档编号C12Q1/68GK101235415SQ20071002660
公开日2008年8月6日 申请日期2007年1月30日 优先权日2007年1月30日
发明者何蕴韶, 刘维瑜, 莹 王, 王伟毅, 钢 程, 耕 邱, 陈嘉昌, 陈梓榕 申请人:中山大学达安基因股份有限公司