专利名称：透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高黑曲霉产糖化酶产量的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高 黑曲霉产糖化酶产量的方法。
背景技术：
葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，其氧化反应所释放出的热 量是人类生命活动所需能量的重要来源。工业生产中一般使用糖化酶-淀粉酶双酶法 生产葡萄糖，糖化酶是淀粉转化为葡萄糖过程的主要酶类之一，属于食品工业生产中常 用的一种酶制剂，又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，EC. 3. 2.1.3.)或淀粉葡萄糖苷酶 (Amyloglucosidase)、Y_淀粉酶(Y-amylase)。糖化酶是一种具有外切活性的酶，通过水解 淀粉、淀粉糊精、糖原等碳链上的1，4连接的非还原端，而得到终产物-D-葡萄糖。黑曲霉(Aspergillus niger)是国内外产糖化酶的常用菌种，属于好氧微生物，此 类微生物的生长及产物的形成受多种参数的影响，例如培养基、发酵PH值、温度、溶解氧的 浓度、真菌的形态等。在黑曲霉代谢过程中，对氧的需求主要是通过通风与搅拌来供给，因 供氧过程是一个高能耗的过程，而且氧往往也是制约产物产率水平的一个限制因素，所以 提高发酵过程中氧的利用率对发酵工业提高生产水平和节能降耗均有很大意义。只有溶解 于培养液中的氧才有可能为其中的微生物细胞所利用，发酵液中的溶氧水平变化取决于发 酵罐的供氧能力和微生物的耗氧速率。在好氧发酵中，将溶氧水平控制在临界氧浓度以上， 即可避免因供氧不足发生代谢异常，也可避免过度的供氧操作引起的能量消耗和对细胞可 能的伤害。因此，要提高氧传递和利用效率，除了必须配置合适的发酵通风设备外，还要充 分利用现有设备的供氧能力，同时根据不同的发酵过程合理控制溶氧水平。透明颤菌血红蛋白是至今唯一在原核生物中发现的血红蛋白，是目前研究的最清 楚的一种原核生物蛋白之一。血红蛋白能使透明颤菌这一专性好氧的革兰氏阴性菌在贫氧 环境中生长。目前透明颤菌血红蛋白(Vffi)基因已被克隆到多种异源好氧微生物体内，促 进了微生物发酵过程中同等条件下氧的利用率，尤其在限氧条件下，大大提高了菌体的生 长密度、促进有氧代谢、加快生物修复促进基因工程菌蛋白和相关代谢产物。由此可见，异 源表达透明颤菌血红蛋白可以提高细胞对溶氧的利用能力，促进细胞生长，提高产物的产 量和收率。目前，尚未见关于利用透明颤菌血红蛋白提高黑曲霉菌种限氧条件下的溶氧能 力，进而提高其产糖化酶能力的报道。
发明内容
为解决限氧条件下黑曲霉菌种溶氧不足的问题，本发明的第一个目的在于提供一 种透明颤菌血红蛋白基因表达盒，所述表达盒由透明颤菌血红蛋白基因、三磷酸甘油醛脱 氢酶基因的启动子和终止子组成。
所述三磷酸甘油醛脱氢酶基因为黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因。所述启动子由1261个碱基组成，如SEQ ID NO. 1所示。所述终止子由3 个碱基组成，如SEQ ID NO. 2所示。所述透明颤菌血红蛋白基因由441个碱基组成，如SEQ ID NO. 3所示。本发明的第二个目的在于提供一种含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑 曲霉菌。本发明的第三个目的在于提供一种含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑 曲霉菌的制备方法，包括以下步骤1)构建透明颤菌血红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd ；2)利用 Pgpd-vhb-Tgpd 表达盒构建质粒 pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd ；3)用质粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd和质粒pAN7-l共转化黑曲霉，获得含有透明颤菌 血红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的重组黑曲霉菌。本发明的技术路线为1、利用分子生物学方法克隆黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的强启动子和终止 子序列；2、利用上述强启动子和终止子，通过重叠PCR方法，构建透明颤菌血红蛋白基因 (vhb)表达盒 Pgpd-vhb-Tgpd 和质粒 pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd ；3、用质粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd和质粒pAN7-l共转化黑曲霉，获得含有透明颤菌 血红蛋白基因(vhb)表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的重组黑曲霉；4、贫氧条件下，验证重组黑曲霉产糖化酶的能力有所提高。本发明针对黑曲霉菌株实施分子改造，从分子水平解决限氧条件下黑曲霉菌种溶 氧不足的问题，为黑曲霉液体深层发酵产糖化酶降低能耗。
图1是黑曲霉GAPDH基因启动子序列电泳检测图，M :250bp marker，1为黑曲霉 GAPDH启动子序列；图2是黑曲霉GAPDH基因终止子序列电泳检测图，M :250bp marker, 1为黑曲霉 GAPDH终止子序列；图3是透明颤菌血红蛋白基因电泳检测图，M :250bp marker ;1，2为透明颤菌血红 蛋白基因序列；图4是overlap PCR连接GAPDH的启动子序列及vtib序列电泳检测图，M :250bp marker ；1为GAPDH的启动子序列及vtib序列连接后片段；图 5 是重叠延伸 PCR 构建 vhb 表达盒(Pgpd-vhb-Tgpd)，M :250bp marker ；1 为表 达盒 Pgpd-vhb-Tgpd ；图6是含vhb基因阳性转化子电泳检测图，M :250bp marker ； 1，2，3，4，5，9为阳性
转化子图7是重组菌与对照菌的SDS-PAGE电泳检测图，M 蛋白质marker ；0为对照菌；1 为阳性重组菌；2为阴性重组菌；图8是质粒pPICZ α A-vhb构建流程图9是质粒pMD19-Pgpd-vhb_Tgpd构建流程图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。实施例1透明颤菌血红蛋白基因(vhb)表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的构建(一 )菌种、质粒及培养基黑曲霉(Aspergillus niger)购于中国工业微生物菌种保藏中心，CICC编 号40125 ；含vtib基因的质粒pPICZaA-vhb，其构建流程参见图8。质粒pPICZaA购自 Invitrogen 公司。黑曲霉的培养固体复苏采用PDA培养基，培养温度；液体扩增培养采用YPD或玉米浆粉培 养基(玉米浆粉1 %，麦芽糊精12%，硫酸铵2 %。)，培养温度为，转速为200rpm。黑曲霉发酵产糖化酶培养基配方玉米淀粉8%，药媒4. 3%，麦麸1 %。其中玉米 淀粉在配制的过程中需要经高温α-淀粉酶液化。(二)vtib基因、启动子和终止子的克隆根据NCBI公布的黑曲霉的三磷酸甘油醛脱氢酶基因序列，找到三磷酸甘油醛脱 氢酶基因的启动子序列(U61bp)和终止子序列(3^bp)。分别设计三磷酸甘油醛脱氢酶 基因的启动子序列的上下游引物Pgpdl、Pgpd2和终止子序列上下游引物Tgpdl、Tgpd2，以 黑曲霉HEOl基因组DNA为模板，以Pgpdl、Pgpd2引物扩增的三磷酸甘油醛脱氢酶基因启 动子序列；以Tgpdl、Tgpd2引物扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子序列。取上述5yL 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图1和图2。用TaKaRa Agarose Gel DNA Pufification Kit 回收PCR产物。连接TaKaRa公司的pMD19_T simple vector，转入大肠杆 菌Ε. coliToplOF'，通过验证获得阳性克隆，并送至^witrogen公司测序验证，对比分析 测序结果，对含有启动子和终止子序列的质粒分别命名pMD19-T-Pgpd和pMD19-T-Tgpd，。提取质粒pPICZ α -vhb作为PCR扩增vhb的模板，根据GeneBank中vtib基因的核 苷酸序列设计引物vhbB l、vhbB2，扩增vtib基因序列，取上述5 μ L扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测，电泳结果见图3。(三)Pgpd-vhb-Tgpd表达盒的构建1.以pMD19-T_Pgpd为模板，gpdAl和gpdA2为上、下游引物，采用 TaKaRaPrimeSTAR HS DNA Polymerase进行扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。 琼脂糖凝胶电泳后切胶回收1261bp大小的片段，命名为Pgpd，取上述5 μ L扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图4。2.以pMD 19-T-Tgpd为模板，gpdCl和gpdC2为上、下游引物，采用 TaKaRaPrimeSTAR HS DNA Polymerase进行扩增三磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子序列。 琼脂糖凝胶电泳后切胶回收329bp大小的片段，命名为Tgpd，取上述5μ L扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图4。3.以 Pgpd、vhb 为模板，gpdAl 和 vhbB2 为上、下游引物，采用 TaKaRaPrimeSTAR HS DNA Polymerase进行overlap PCR扩增便可将三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列 和νΙΛ拼接起来。琼脂糖凝胶电泳后切胶回收约1702bp大小的片段，命名为Pgpd-vhb。
4.以 Pgpd-vhb、Tgpd 为模板，gpdAl 和 gpdC2 为上、下游引物，采用 TaKaRaEx TaqTM进行overlap PCR扩增便可将三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列、vtib及三磷酸 甘油醛脱氢酶基因的终止子序列拼接起来。琼脂糖凝胶电泳后切胶回收约2031bp大小的 片段，命名为Pgpd-vhb-Tgpd，取上述5 μ L扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见 图5。5.上述回收产物连接TaKaRa公司的pMD19T质粒simple vector，转入大肠杆菌 E. coli ToplOF'，通过验证获得阳性克隆，命名为pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd，构建流程参见图 9，并送去hvitrogen公司测序，比对分析测序结果。
本实施例所用引物序列见表1. 表1序列扩增及表达盒构建中所需的引物
引物名称
引物序列(5，-3’)
Pgpdl Pgpd2 Tgpdl Tgpd2
gpdAl gpdA2 vhbBl
GCG TTT AAA ACA GAG GCC AGA GCA TCA CCA ACA TGG TGC GAA TTC TGT TTA GAT GTG TCTATG TGG CGG GG GTG TCT AGA GAA TCA GGA CGG CAA ACT G ATA GGA TCC CTG CAG AGC TTA GTC AC
ACA GAG GCC AGA GCA TCA CCA ACA TGG TAC CCT CAG CAA TAA TAT GCA
TAC GGT TTG TTG GTC TAA CAT TGT TTA GAT GTG TCT ATG TGG CGG GG
CCC CGC CAC ATA GAC ACA TCT AAA CAA TGT TAG ACC AAC AAA CCG TA
vhbB2CCT GAT TCT TAT TCA GCG TCT TGA GCG TAC AAA TCC GCT TCC
Γ TGT ACG CTC AAG ACG CTG AAT AAG AAT CAG GAC GGC AAAgpdClCTG AAT
CTG CAG AGC TTA GTC ACC ACC GCA GCA TTG CAT CTG GGG gpdC2_CCG ACG TCT___实施例2制备含有Pgpd-vhb-Tgpd表达盒的重组黑曲霉菌(一)黑曲霉菌原生质体制备1)吸取1. 5mL无菌水从PDA培养平板上新鲜且成熟的黑曲霉孢子，制备成浓度为 0. 8 1. OX IO8个/mL的孢子悬浮液，接种于40 50mL的YPD/Mandels液体基础培养基 中，28°C，250rpm 培养 Ilh 左右。2)取培养Ilh左右的菌液在光学显微镜下观察，大部分孢子已萌发时，将培养液 转入25mL大离心管，8000rpm，离心7min，去上清，用IM MgSO4IOmL洗涤两次，8000rpm,离心 IOmin,去上清。3)酶解液的制备和酶解反应准确称取IOOmg溶壁酶(Sigma)锡纸包裹，酒精灭 菌送入超净工作台，加入IOmLlM MgSO4溶解后，用一次性过滤器过滤除菌。将上述菌体沉 淀中加入到装有IOmL酶解液的三角瓶中，置于^°C，70rpm摇床酶解2 2.证。4)将酶解溶液转移至25mL大离心管中，用STC溶液补满，8000rpm，离心20min，去 上清，用IOmL STC溶液洗涤两次，8000rpm，离心lOmin，去上清。5)将沉淀用500 600 μ LSTC溶液重悬，取少许悬浊液在光学显微镜下计数，并用 STC溶液将其稀释到1. 0 X IO8个/mL。( 二)质粒 pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd 和 pAN7_l 的转化
1)取上述方法(一)制备的原生质体悬浊液200yL，加入10 15yL质粒 pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd (约 10 μ g)和 pAN7_l (约 10 μ g)，轻轻混勻。温控板上热激2min，立即加入60% PEG400050 μ L，室温静置20min。3)加入4mL STC溶液吹打混勻，8000rpm离心20min，去上清，加入ImLSTC溶液重
悬沉淀。4)将ImL原生质体悬浊液加到IOmL原生质体再生培养基中，观°C，70rpm培养 24h。5) 8000rpm,离心15min，去上清，加入再生培养基重悬，取100 200 μ L涂布到含 有潮霉素100 μ g/mL的PDA培养平板上，培养观察3 5天。待平板上长出菌丝，用灭 菌牙签挖取单菌落菌丝，接种到新鲜PDA(hph+)培养小平板上，28°C培养7天左右。质粒pAN7_l购自Biovector Science Lab公司，地址为北京市西直门外大街19号。(三)阳性转化子的筛选与验证将筛选平板上长出的潮霉素抗性转化子分别转接到含100 μ g/mL潮霉素B的小 PDA平板上进行进一步筛选培养；一周后用无菌水刮洗各转化子的菌丝并分别接种于含 100 μ g/mL潮霉素B的液体培养基中，，250rpm培养3_4天，用65%甘油保种；提取各 转化子的基因组DNA作为模板，用vtib引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检 测，取上述5 μ L扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图6，有符合预期大小的转 化子即为阳性转化子。由于VHB为胞内蛋白，将上述阳性转化子离心收集菌体，经液氮破壁后，用缓冲 液PBS抽提获得VHB粗蛋白，SDS-PAGE分析按照分子生物学实验指南进行(Sam-brook et al.，1989)。所使用的凝胶浓度15 %，上样量为25 μ L (20 μ L培养液加5 μ L载样液)，电泳 检测结果见图7。在16kd左右有蛋白条带的为vtib基因正确表达的重组菌株。实施例3重组黑曲霉产糖化酶能力的验证(一)发酵分别对实施例2得到的重组黑曲霉菌与原始对照菌株黑曲霉HEOl进行发酵，通过 测定在正常条件下及贫氧条件下重组菌和原始对照菌的糖化酶酶活力，以检测VHB在贫氧 条件下对重组菌产糖化酶酶活力的影响。通过调节摇床的转速来控制贫氧条件，具体实验方法如下菌种种子培养阶段将甘油保种的重组菌及对照原始菌种分别接入黑曲霉种子 培养基中活化3-4天左右，28-3(TC，2(K)r/min。待菌种生长旺盛，再重新接入种子培养基， 进行二次活化，生长约3天左右，各个菌种生长一致，有大量菌丝体，便可以6 %的接种量 (25mL/250mL 发酵培养基/三角瓶容量)接入发酵培养基中进行发酵培养。菌种发酵培养阶段将上述接入到发酵培养基中的重组菌种和原始菌种(每个样 分别转接三瓶)分别放入100rpm、150rpm及200rpm 3个不同转速的摇床中，发酵培 养，5天左右达到产酶高峰，开始测定糖化酶酶活。( 二)糖化酶活性测定标准曲线绘制准确称取1克葡萄糖，用蒸馏水溶解，定容至500毫升容量瓶中，分 别按顺序在试管中加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8毫升葡萄糖溶液，和1、0. 9、0.8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2毫升蒸馏水。塞上塞子，沸水浴10分钟，冷却后，加入蒸馏 水，摇勻，于550nm比色测定。酶活力测定定义在40°C，pH4. 6条件下，每小时水解淀粉产生1毫克葡萄糖作 为一个酶活力单位(1个酶活力单位用IU表示)。方法称取酶液2. OOml定容至IOOml 摇勻，供测定用。于甲、乙两支25ml比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液5. Oml及缓冲液
1.OOml摇勻后，于40 士 0. 2°C恒温水浴中预热5min。在甲管(样品)中加入待测酶液0. 4ml， 立刻摇勻，在此温度下准确反应30min，立即各加200g/L氢氧化钠溶液0. (Mml，将两管取出 迅速冷却，并于乙管(空白)中补加待测酶液0.細1。准确反应30分钟，取0.2毫升反应液 于有3毫升DNS (3，5- 二硝基水杨酸)的试管中，沸水浴10分钟，冷却后加入蒸馏水，摇勻， 550nm测定吸光值。糖化酶活力计算公式如下糖化酶活力=AXKXNX2X6.44+ (ΜΧ0. 4)A 为样品OD平均值；K 为比色常数；N 为稀释倍数；M 酶液质量6. 44:反应液体积；2 为将30min的反应时间换算成一个小时；0.4:稀释酶液体积。不同转速下发酵不同时间黑曲霉糖化酶活力测定结果见表2。表2出发菌与重组菌正常及限氧条件下糖化酶酶活测定
不同转速下菌种酶活测定(酶活单位为U/g)
时间 144h168h192h
权利要求
1.一种透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于所述表达盒由透明颤菌血红蛋白 基因、三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子组成。
2.根据权利要求1所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于所述三磷酸甘 油醛脱氢酶基因为黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因。
3.根据权利要求1或2所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于所述启动 子由1261个碱基组成，如SEQ ID NO. 1所示。
4.根据权利要求1所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于所述终止子由 329个碱基组成，如SEQ ID NO. 2所示。
5.根据权利要求1所述的透明颤菌血红蛋白基因表达盒，其特征在于所述透明颤菌 血红蛋白基因由441个碱基组成，如SEQ ID NO. 3所示。
6.一种含有权利要求1-5任意一项所述透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑曲霉菌。
7.含有透明颤菌血红蛋白基因表达盒的重组黑曲霉菌的制备方法，包括以下步骤1)构建透明颤菌血红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd；2)利用Pgpd-vhb-Tgpd 表达盒构建质粒 pMD19-T-Pgpd-vhb-Tgpd ；3)用质粒pMD19-T-Pgpd-vhb-Tgpd和质粒pAN7-l共转化黑曲霉，获得含有透明颤菌血 红蛋白基因表达盒Pgpd-vhb-Tgpd的重组黑曲霉菌。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，公开了一种透明颤菌血红蛋白基因表达盒及其提高黑曲霉产糖化酶产量的方法，所述表达盒由透明颤菌血红蛋白基因、三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子组成。本发明针对黑曲霉菌株实施分子改造，从分子水平解决限氧条件下黑曲霉菌种溶氧不足的问题，为黑曲霉液体深层发酵产糖化酶降低能耗。
文档编号C12R1/685GK102061295SQ20101028815
公开日2011年5月18日 申请日期2010年9月20日 优先权日2010年9月20日
发明者余少文, 王娟, 胡萍 申请人:深圳大学