专利名称：一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种Bcr-Abl 基因突变检测液相芯片。
背景技术：
Bcr-Abl融合基因是人体细胞第9号染色体上的Abl原癌基因与第22号染色体 上的Bcr基因相互易位形成的融合基因。此基因产生一种新的mRNA，编码的蛋白为P210， P210可引起蛋白激酶持续性激活，使白细胞过分增殖而出现慢性粒细胞白血病(CML)。酪 氨酸激酶在CML的发生中起了关键作用，抑制其活性成分成为CML治疗的一个新途径。治 疗CML的一线药物伊马替尼就是一种特异的Abl酪氨酸激酶抑制剂，它能选择性地结合于 Bcr-Abl受体，阻止磷酸基团从三磷酸腺苷向蛋白质底物的转移，使之不能催化底物酪氨酸 残基的磷酸化而激活下游效应分子的信号转导，从而抑制细胞增殖而诱导细胞凋亡。研究表明，Bcr-Abl基因突变可使CML患者对伊马替尼产生继发性耐药，其中， 耐药性最强的突变位点主要有T315I突变和P-环簇突变中的Y253F/H、E255K/V、G250E、 F486S，具有这些突变类型患者的生存期较其他突变类型显著降低；而其他位点M244V、 L248V、D276G、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R等耐药程度不高，可以通过提高剂量来 抵抗耐药。目前对Bcr-Abl的检测产品一般是基于PCR技术的荧光定量PCR法、FRET法和DNA 测序法等，存在样品易污染、假阳性率高、灵敏度低等缺点，同时由于检测通量的局限性，不 能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，该液相芯片用于 检测 Bcr-Abl 基因的 M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255K/V、D276G、T315I、F317L、E355G、 F359V、V379I、H396P/R和F486S的野生型和突变型。一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，主要包括有(A)针对Bcr-Abl基因每种突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对每 种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所 述特异性引物序列选自SEQ ID NO. 32 及 SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34 及 SEQ ID NO. 35、 SEQ ID NO. 36 及 SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38 及 SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41 及 SEQ ID NO. 42 和 SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44 及 SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46 及 SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48 及 SEQ ID NO. 49 和 SEQ ID NO. 50 和 SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52 及 SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54 及 SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56 及 SEQ ID NO. 57、 SEQ ID NO. 58 及 SEQ ID NO. 59 和 SEQ ID NO. 60、和 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 中的 一对或多对；所述tag序列选自SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 31中的序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列、每种微球具有不同颜色编码的微球；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 63 SEQ ID NO. 93中的序列，所述anti-tag序列能相应地 与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序 列；(C).用于扩增具有 M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255K/V、D276G、T3151、F317L、 E355G、F359V、V379I、H396P/R、和F486S中的一个或多个突变位点的Bcr-Abl基因目标序 列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为针对M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K和D276G突 变位点的SEQ ID NO. 94及SEQ ID NO. 95、针对T315I、F317L、E355G、F359V、V379I和H396P/ R突变位点的SEQ ID NO. 96及SEQ ID N0. 97、和针对F486S突变位点的SEQ ID N0. 98及 SEQ ID N0. 99中的一对或多对。 优选地，所述ASPE弓丨物对为针对M244V突变位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 32组成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 33组成的序列；针对L248V突变位点的 由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 34组成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 35组成的序 列；针对G250E突变位点的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 36组成的序列及由SEQ ID N0. 6 和SEQ ID N0. 37组成的序列；针对Y253F/H突变位点的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 38组 成的序列、由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 39组成的序列及由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 40 组成的序列；针对E255K/V突变位点的由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0. 41组成的序列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 42组成的序列及由SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 43组成的序列；针 对D276G突变位点的由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 44组成的序列及由SEQ ID N0. 14和 SEQ ID N0. 45组成的序列；针对T315I突变位点的由SEQ ID N0. 15和SEQ ID N0. 46组成 的序列及由SEQ ID N0. 16和SEQ ID N0. 47组成的序列；针对F317L突变位点的由SEQ ID N0. 17和SEQ ID N0. 48组成的序列、由SEQ ID N0. 18和SEQ ID N0. 49组成的序列、由SEQ ID N0. 19和SEQ ID N0. 50组成的序列及由SEQ ID N0. 20和SEQ ID N0. 51组成的序列； 针对E355G突变位点的由SEQ ID N0. 21和SEQ ID N0. 52组成的序列及由SEQ ID N0. 22 和SEQ ID N0. 53组成的序列；针对F359V突变位点的由SEQ ID N0. 23和SEQ ID N0. 54组 成的序列及由SEQ ID N0. 24和SEQ ID N0. 55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID N0. 25和SEQ ID N0. 56组成的序列及由SEQ ID N0. 26和SEQ ID N0. 57组成的序列； 针对H396P/R突变位点的由SEQ ID N0. 27和SEQ ID N0. 58组成的序列、由SEQ ID N0. 28 和SEQ ID N0. 59组成的序列及由SEQ ID N0. 29和SEQ ID N0. 60组成的序列；和/或针对 F486S突变位点的由SEQ ID N0. 30和SEQ ID N0. 61组成的序列及由SEQ ID N0. 31和SEQ ID N0. 62组成的序列中的一对或多对。优选地，所述液相芯片主要包括有(A)ASPE引物对为针对M244V突变位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 32组成 的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 33组成的序列；针对L248V突变位点的由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 34组成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 35组成的序列；针对 G250E突变位点的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 36组成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 37组成的序列；针对Y253F/H突变位点的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 38组成的 序列、由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 39组成的序列及由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 40组 成的序列；针对E255K/V突变位点的由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0. 41组成的序列、由SEQID NO. 11和SEQ ID NO. 42组成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 43组成的序列；针 对D276G突变位点的由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 44组成的序列及由SEQ ID NO. 14和 SEQ ID NO. 45组成的序列；针对T315I突变位点的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 46组成 的序列及由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 47组成的序列；针对F317L突变位点的由SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 48组成的序列、由SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 49组成的序列、由SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 50组成的序列及由SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 51组成的序列； 针对E355G突变位点的由SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 52组成的序列及由SEQ ID NO. 22 和SEQ ID NO. 53组成的序列；针对F359V突变位点的由SEQ ID NO. 23和SEQ ID NO. 54组 成的序列及由SEQ ID NO. 24和SEQ ID NO. 55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID NO. 25和SEQ ID NO. 56组成的序列及由SEQ ID NO. 26和SEQ ID NO. 57组成的序列； 针对H396P/R突变位点的由SEQ ID NO. 27和SEQ ID NO. 58组成的序列、由SEQ ID NO. 28 和SEQ ID NO. 59组成的序列及由SEQ ID NO. 29和SEQ ID NO. 60组成的序列；以及针对 F486S突变位点的由SEQ ID N0. 30和SEQ ID N0. 61组成的序列及由SEQ ID N0. 31和SEQ ID N0. 62组成的序列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；所述 anti-tag序列选自SEQ ID N0. 63 SEQ ID N0. 93中的序列，所述anti-tag序列能相应地 与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序 列；(C).扩增引物为针对 M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K 和 D276G 突变位点 的 SEQ ID N0. 94 及 SEQ ID N0. 95、针对 T315I、F317L、E355G、F359V、V379I 和 H396P/R 突 变位点的SEQ ID N0. 96及SEQ ID N0. 97、和针对F486S突变位点的SEQ ID N0. 98及SEQ ID N0. 99。优选地，所述间隔臂序列为5-10个T。本发明的主要优点在于(1)本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%。所制 备的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片具有很好的信号_噪声比，并且所涉及的探针以及 anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti_TAG标签序列的选取以及 TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检 测；(2)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的基 因型；(3)本发明的检测方法步骤简单，16种突变检测可通过一步多重PCR即可完成含 有16个突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不 确定因素，因而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征；(4)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同 时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具有很 强的拓展性，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比 增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例IBcr-Abl基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对Bcr-Abl 基因的 16 种常见突变位点 M244V、L248V、D276G、G250E、Y253F/H、 E255K/V、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、F486S，分别设计特异性引物序列。 ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
一种Bcr Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，主要包括有(A)针对Bcr Abl基因每种突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自SEQ ID NO.32及SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36及SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38及SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44及SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46及SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52及SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54及SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58及SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、和SEQ ID NO.61及SEQ ID NO.62中的一对或多对；所述tag序列选自SEQ IDNO.1～SEQ IDNO.31中的序列；(B).分别包被有特异的anti tag序列的、具有不同颜色编码的微球；所述anti tag序列选自SEQ ID NO.63～SEQ ID NO.93中的序列，所述anti tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C).用于扩增具有M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255K/V、D276G、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、和F486S中的一个或多个突变位点的Bcr Abl基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述扩增引物 为针对 M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K 和 D276G 突变位点的 SEQ ID N0. 94 及 SEQ ID N0. 95、针对 T315I、F317L、E355G、F359V、V379I 和 H396P/R 突变位点的 SEQ ID N0. 96 及SEQ ID N0. 97、和针对F486S突变位点的SEQ ID N0. 98及SEQ ID N0. 99中的一对或多对。
3.根据权利要求1或2所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述ASPE 引物对为针对M244V突变位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 32组成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 33组成的序列；针对L248V突变位点的由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 34 组成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 35组成的序列；针对G250E突变位点的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 36组成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 37组成的序列；针对 Y253F/H突变位点的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 38组成的序列、由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 39组成的序列及由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 40组成的序列；针对E255K/V突变位 点的由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0. 41 组成的序列、由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 42 组 成的序列及由SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 43组成的序列；针对D276G突变位点的由SEQ ID N0. 13和SEQID N0. 44组成的序列及由SEQ ID N0. 14和SEQ ID N0. 45组成的序列；针 对T315I突变位点的由SEQ ID N0. 15和SEQ ID N0. 46组成的序列及由SEQ ID N0. 16和 SEQ ID N0. 47组成的序列；针对F317L突变位点的由SEQ ID N0. 17和SEQ ID N0. 48组成 的序列、由 SEQ ID N0. 18 和 SEQ ID N0. 49 组成的序列、由 SEQ ID N0. 19 和 SEQ ID N0. 50 组成的序列及由SEQ ID N0. 20和SEQ ID N0. 51组成的序列；针对E355G突变位点的由SEQ ID N0. 21和SEQ ID N0. 52组成的序列及由SEQ ID N0. 22和SEQ ID N0. 53组成的序歹Ij ；针 对F359V突变位点的由SEQ ID N0. 23和SEQ ID N0. 54组成的序列及由SEQ ID N0. 24和 SEQ ID N0. 55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID N0. 25和SEQ ID N0. 56组成 的序列及由SEQ ID N0. 26和SEQ ID N0. 57组成的序列；针对H396P/R突变位点的由SEQID NO. 27和SEQ ID NO. 58组成的序列、由SEQ ID NO. 28和SEQ ID NO. 59组成的序列及由 SEQ ID NO. 29和SEQ ID NO. 60组成的序列；和/或针对F486S突变位点的由SEQ ID NO. 30 和SEQ ID NO. 61组成的序列及由SEQ ID NO. 31和SEQ ID NO. 62组成的序列中的一对或多对。
4.根据权利要求3所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，主要包括有(A)ASPE引物对为针对M244V突变位点的由SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 32组成的序 列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 33组成的序列；针对L248V突变位点的由SEQ ID NO. 3 和SEQ ID NO. 34组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 35组成的序列；针对G250E突 变位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 36组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 37 组成的序列；针对Y253F/H突变位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 38组成的序列、由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 39组成的序列及由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 40组成的序歹Ij ；针对 E255K/V突变位点的由SEQ ID NO. 10和SEQ ID N0. 41组成的序列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 42组成的序列及由SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 43组成的序列；针对D276G突变位 点的由 SEQ ID N0. 13 和 SEQ ID N0. 44 组成的序列及由 SEQ ID N0. 14 和 SEQ ID N0. 45 组 成的序列；针对T315I突变位点的由SEQ ID N0. 15和SEQ ID N0. 46组成的序列及由SEQ ID N0. 16和SEQ ID N0. 47组成的序歹Ij ；针对F317L突变位点的由SEQ ID N0. 17和SEQ ID N0. 48组成的序列、由SEQ ID N0. 18和SEQ ID N0. 49组成的序列、由SEQ ID N0. 19和SEQ ID N0. 50组成的序列及由SEQ ID N0. 20和SEQ ID N0. 51组成的序列；针对E355G突变位 点的由 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 52 组成的序列及由 SEQ ID N0. 22 和 SEQ ID N0. 53 组 成的序列；针对F359V突变位点的由SEQ ID N0. 23和SEQ ID N0. 54组成的序列及由SEQ ID N0.24和SEQ ID N0. 55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID N0. 25和SEQ ID N0. 56组成的序列及由SEQ ID N0. 26和SEQ ID N0. 57组成的序列；针对H396P/R突变位 点的由 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 58 组成的序列、由 SEQ ID N0. 28 和 SEQ ID N0. 59 组 成的序列及由SEQ ID N0. 29和SEQ ID N0. 60组成的序列；以及针对F486S突变位点的由 SEQ ID N0. 30 和 SEQ ID N0. 61 组成的序列及由 SEQ ID N0. 31 和 SEQ ID N0. 62 组成的序 列；(B).分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；所述anti-tag 序列选自SEQ ID N0. 63 SEQ ID N0. 93中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)·扩增引物为针对 M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K 和 D276G 突变位点的 SEQ ID N0. 94 及 SEQ ID N0. 95、针对 T315I、F317L、E355G、F359V、V379I 和 H396P/R 突变 位点的 SEQ ID N0. 96 及 SEQ ID N0. 97、和针对 F486S 突变位点的 SEQ ID N0. 98 及 SEQ ID N0. 99。
5.根据权利要求1所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列 为5-10个T。
全文摘要
本发明公开了Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，所述液相芯片包括针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对、分别包被有特异的anti-tag序列的微球，和用于分别扩增具有M244V、L248V、D276G、G250E、Y253F/H、E255K/V、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、和/或F486S突变位点的Bcr-Abl基因目标序列的引物。所制备的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。所述检测方法步骤简单，16种突变位点可以一步检测完成，操作方便，并且避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。
文档编号C12Q1/68GK101984071SQ201010292620
公开日2011年3月9日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者余刚, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司