专利名称：纯化丙酮酸激酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种丙酮酸激酶的纯化方法。
背景技术：
在钾离子存在的条件下，丙酮酸激酶可催化磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸 (见下式，其中，PEP、ADP, Pyruvate、ATP分别为磷酸烯醇式丙酮酸、腺嘌呤二核苷 酸磷酸、丙酮酸、三磷酸腺苷)，该酶的活性在一定条件下和钾离子的浓度呈线性相关， 可用于检测人血清中钾离子的浓度，从而可用于在血钾试剂盒，因此该酶生产制备工艺 研究有重要的实用意义。
丙酮酸激酶
PEP+ADP^ Pyruvate+ATP通常，存在于丙酮酸激酶中的杂酶和一价离子(如钾离子、钠离子、铵离子)对 酶法检测试剂盒的使用性能有干扰，因此必须将这些干扰因素排除，才可用于试剂盒的 配制。中国专利申请CN101698837公开了一种丙酮酸激酶及其核苷酸序列，并具体公 开了该酶的纯化方法，即发酵液经过勻浆、亲和吸附并洗脱、脱盐、冻干后获得符合要 求的产品。本方法在具体实施过程中涉及亲和吸附柱以及脱盐柱的制备，并涉及纯化系 统等设备，柱填料的成本和柱的维护成本比较高。而且，如果大规模生产该酶，柱前需 要对粗酶液进行过滤处理(一般如果使用100微米直径的柱填料则要求样品过0.45微米的 膜)，否则亲和吸附柱或脱盐柱容易被堵塞，这也是必须面对的问题。鉴于以上状况，改进工艺，避开过滤、上柱纯化等工序，用简易的方法去掉其 中一些杂的蛋白并脱除其中的一些杂离子，制备出适合于血钾试剂盒要求的产品有重大 的实用意义。本发明将针对以上问题，提供一种新的纯化诊断用丙酮酸激酶的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的简单有效的纯化丙酮酸激酶的方法，该方法不需 要将所述的丙酮酸激酶进行亲和吸附，也不需要凝胶脱盐，即可获得符合血钾试剂盒要 求的酶。其中，血钾试剂盒对丙酮酸激酶的要求是用该酶配成的试剂盒和公知的可靠 的试剂盒测定血清中的钾离子浓度，测定结果要相近(偏离不得超过士 10%，相对标准 偏差不得超过5%)。所述的方法包括如下步骤(1)将发酵液勻浆，得粗酶液；(2)对粗酶液进行稳定化处理；(3)对进行稳定化处理后的粗酶液进行热冷处理；(4)对步骤(3)所得粗酶液进行酸碱处理；
(5)用PEG(聚乙二醇)沉淀法将酶从含杂离子的粗酶中沉淀出来，将沉淀重 悬，继续用PEG沉淀法洗去其中残余的杂离子，得酶泥；(6)将步骤(5)所得的酶泥重悬，加入单宁酸使全部或绝大部分PEG和单宁酸结 合生成沉淀并离心除去，上清液经冷冻升华干燥获得符合试剂盒纯度要求的诊断用酶。所述步骤(1)中，所述的发酵液可以购买得到，或通过现有技术制备而得，例 如按照专利申请CN101698837中的方法进行制备；所述的勻浆可采用本领域常规的高压 均质机按常规操作进行，例如控制工作压力在85士5个标准大气压，酶液在此连续均质 机上勻浆一次(即一个循环)。所述步骤(2)中，对粗酶液进行稳定化处理包括调节粗酶液的pH，同时加入 适当浓度的稳定剂，以提高酶的稳定性。pH优选调节至4.00-10.50，可采用盐酸、醋 酸、硝酸、磷酸、硫酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、丙酸、丁酸、丙二酸、丁二酸、乳酸 进行调节。所述的稳定剂优选为钾盐、镁盐和丙酮酸，进一步优选为在粗酶液中同时加 入终浓度为l_50mmol/l的钾盐、l_200mmol/l的镁盐和2_50mmol/l的丙酮酸。所述的 钾盐包括但不限于硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、醋酸钾中的一种或几种，所述的镁盐包括 但不限于氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、醋酸镁的一种或几种。加入稳定剂后，所述的粗酶 液在50°C加热60分钟不失活，在pH为4.00时，可在25°C保存8小时而不失活，在pH 为10.50时，可在25°C保存20小时而不失活。所述步骤(3)中，所述的热冷处理包括将粗酶液在50°C -60°C加热10-60 分钟，使部分杂蛋白沉淀；之后，将酶液在-20°C--40°C冻结16-20小时，然后在 25°C-30°C下解冻3-5小时使融化，可采用水浴进行解冻。经过该步骤，粗酶液中有大量 的杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，此沉淀可用离心的方法去除。所述步骤(4)中，所述的酸碱处理包括将以上粗酶液在25°C -30°C下调节 pH4.0,保存4-10小时，将pH调节10.5，在25°C _30°C保温20-50小时，杂蛋白发生变 性失活并沉淀下来，此沉淀可用离心的方法去除。所述步骤(5)包括在以上粗酶液中，加入粗酶液体积25-50% (此处的“％” 指“重量占体积的百分比”，若重量单位为克，体积单位则取毫升)的PEG溶解，静 置，目的蛋白发生沉淀，离心，将含有杂离子的上清液弃除，收集沉淀；此沉淀用3倍 体积的Tris-HCl缓冲液(Tris为三羟甲基氨基甲烷，HCl为氯化氢)重悬，重复以上步 骤1次洗去沉淀中的少量杂离子，收集沉淀，即为酶泥。其中所述PEG的分子量优选为 1000-20000，进一步优选为 2000-10000，最优选为 PEG2000、PEG6000 或 PEG10000。 重悬指将沉淀加入缓冲也中进行搅拌，成为悬浮液。经过该步骤，去除了酶液中影响试 剂和测值的杂离子(如钠离子、钾离子、铵离子等)。所述步骤(6)包括将去除盐离子的酶泥用3倍体积的Tris-HCl悬起，加入酶 泥体积0.5-30% (此处的“％”指“重量占体积的百分比”，若重量单位为克，体积 单位则取毫升)的丹宁酸，优选为1-20%;聚乙二醇和单宁酸形成沉淀，将此沉淀离心 去除，收集上清液；此上清液经过真空冷冻升华获得适合血钾检测的原料酶。在该步骤 中，去除了酶中影响产品比活性的PEG。实施例下面通过具体的实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。1、实施例所用的仪器设备10升发酵罐(包括空压机、空气过滤器、蒸气发生器等配套设施)、1000毫升 三角瓶5只、天平、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、沸水浴、电炉、-20°C冰箱、 冷冻干燥机、高压均质机、落地式离心机、灭菌锅、细菌培养透气膜、分光光度计、pH 计、制冰机。2、实施例中所用的试剂盒材料菌种培养基(LB培养基)1升10克蛋白胨、5克酵母粉、10克氯化钠逐次加入 并溶解到800毫升水中，用盐酸或氢氧化钠调节pH到7.0，加水到1000毫升，将此培养 基均分到3个1000毫升的三角瓶中用透气膜封口，在灭菌锅中于121°C按常规操作要求灭 菌15分钟。冷却待用。酶表达培养基(LB培养基)6升60克蛋白胨、30克酵母粉、60克氯化钠逐次 加入并溶解于5升水中，用盐酸或氢氧化钠调节pH到7.0，将其加入到10升发酵罐中按 常规操作要求在121°C灭菌15分钟，控制冷凝水的量，使灭菌后总体积的达到大约6升。氨水将浓氨水中加入等倍体积的去离子水，将此稀释后的氨水装于250毫升 的补料瓶中(补料瓶不必灭菌，通过氨水即可将其中的杂菌杀灭)，共配制100毫升。此 氨水在使用前连接碱管(也用氨水将管道中的气体排出同时对管道起消毒作用)。硫酸配制浓度大约为2摩尔/升的硫酸，装于已经灭菌(此补料瓶和补料管提 前在121°C空灭15分钟)的补料瓶中，共配制100毫升。冰醋酸配制成20%浓度，共配制100毫升。1 %氢氧化钾溶液称取5克氢氧化钾溶解于500毫升去离子水中。重悬缓冲液2升(Tris-HCl，浓度50毫摩尔，pH7.5)称取12.1克Tris，加入到 1.6升水中，加热到25°C，在不断搅拌下用IM的盐酸调节pH到7.5，将此溶液加去离子 水到2升，继续用Tris或盐酸微调节pH到7.5。单宁酸分析纯，分子量1700道尔顿。菌种按照专利申请CN101698837的方法，获得重组宿主细胞——大肠杆菌 BL21 (DE3)-PET286PK。卡那霉素取卡那霉素0.5克，用10克去离子水溶解，此液体用无菌滤膜过滤 后分装于1毫升的无菌塑料小管中。冷冻保存。IPTG(异丙基_0"0-硫代半乳糖吡喃糖苷)取2.38克，用10克去离子水溶解， 此液体用无菌滤膜过滤后分装于1毫升的无菌塑料小管中。冷冻保存。使用前解冻。聚乙二醇分子量2000-10000道尔顿。磷酸。3、丙酮酸激酶的检测方法(1)定义酶活一定条件下，1分钟氧化1微摩尔NADH (还原型辅酶I，烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸)的酶量，定义为1U。 IKU = 1000U。比活力每克(或每升)蛋白所含的酶活力单位。
(2)检测原理
权利要求
1. 一种纯化丙酮酸激酶的方法，其包括如下步骤(1)将发酵液勻浆，得粗酶液；(2)对粗酶液进行稳定化处理；(3)对进行稳定化处理后的粗酶液进行热冷处理；(4)对步骤(3)所得粗酶液进行酸碱处理；(5)用PEG沉淀法将酶从含杂离子的粗酶中沉淀出来，将沉淀重悬，继续用PEG沉 淀法洗去其中残余的杂离子，得酶泥；(6)将步骤(5)所得的酶泥重悬，加入单宁酸使PEG和单宁酸结合生成沉淀并离心除 去，上清液经冷冻升华干燥获得符合试剂盒纯度要求的诊断用酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中，对粗酶液进行稳定化处理包 括调节粗酶液的pH，同时加入适当浓度的稳定剂，以提高酶的稳定性。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，调节粗酶液的pH至4.00-10.50。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的稳定剂为钾盐、镁盐和丙酮酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述的钾盐包括硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、醋 酸钾中的一种或两种以上，所述的镁盐包括氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、醋酸镁中的一种 或两种以上。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，在粗酶液中同时加入终浓度为l-50mmOl/ 1的钾盐、l_200mmol/l的镁盐和2_50mmol/l的丙酮酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述的热冷处理包括将 步骤(2)所得的粗酶液在50°C-6(TC加热10-60分钟，使部分杂蛋白沉淀；之后，将酶液 在-20°C —40°C冻结16-20小时，然后在25°C _30°C解冻3_5小时，粗酶液中有大量的杂 蛋白发生变性失活并沉淀下来，在室温下5000G离心40-60分钟，去除此沉淀。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述的酸碱处理包括将步 骤(3)所得到的粗酶液在25°C -30°C下调节pH4.00，保存4_10小时，将pH调节10.50， 在25°C-30°C保温20-50小时，杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，此沉淀用离心的方法去 除。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(5)包括在步骤(4)所得的粗酶液 中，加入粗酶液体积25-50%的PEG溶解，静置，目的蛋白发生沉淀，离心，将含有杂 离子的上清液弃除，收集沉淀；此沉淀用3倍体积的Tris-HCl缓冲液重悬，重复以上步 骤1次，洗去沉淀中的少量杂离子，收集沉淀，即为酶泥。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述PEG的分子量为1000-20000。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(6)包括将去除盐离子的酶泥用 3倍体积的Tris-HCl悬起，加入酶泥体积0.5-30%的丹宁酸；聚乙二醇和单宁酸形成沉 淀，将此沉淀离心去除，收集上清液；此上清液经过真空冷冻升华获得适合血钾检测的 原料酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，加入的单宁酸的量为酶泥体积的1_20%。
全文摘要
本发明提供一种纯化诊断用丙酮酸激酶的方法，其包括如下步骤(1)将发酵液调节pH、匀浆，(2)稳定化处理，(3)热冷处理，(4)加酸碱处理，(5)用PEG(聚乙二醇)沉淀法将酶从含有杂离子的酶中沉淀出来，将沉淀重悬，继续用PEG沉淀法洗去其中残余的杂离子，(6)酶沉淀经重悬，加入单宁酸使残留的部分PEG和单宁酸结合生成沉淀并离心除去，上清经冷冻升华干燥获得符合试剂盒纯度要求的诊断酶。该方法简单易行，可以很方便地从含有钠、钾、氨等离子和杂蛋白的发酵粗酶液中将酶提纯出来，获得符合诊断原料要求的酶。该方法酶的得率高，杂离子水平可控制，无需上柱脱盐，无需透析，易于扩大生产。
文档编号C12N9/12GK102010854SQ201010532789
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司研发中心