专利名称：针刺幼苗茎节法高效诱导紫草毛状根的产生及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种采用发根农杆菌侵染紫草幼苗茎节 诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物(如紫草宁及其衍生物等)。
背景技术：
紫草属于紫草科多年生草本植物，是名贵中药材，以根入药。紫草在我国分布 广泛，主要分布于新疆、西藏、内蒙、云南、贵州、四川、黑龙江、吉林、辽宁、河北、湖南等 地。紫草具有凉血，活血，清热，解毒的功效；用于清热凉血，透疹解毒，麻疹透发不畅，温 热斑疹，紫癜，吐血衄血，湿热黄疸；外用皮肤湿疹，疮毒痈肿、溃疡、小儿尿布皮炎等症 (Papageorgiou et al. , Angew Chem. Int. Ed. , 1999, 38: 270-300; Yoon et al., Plant Med. , 1999，65: 532-535)。另外，近年来，从紫草中提取出的紫草素、紫草油、亚麻 酸等已应用于化妆品、食品添加剂、保健用品、酒类及抗癌药品等，国内外市场需求量很大， 因此发展紫草种植与开发的社会及经济效益均极其显著(石书河等，中国油脂，2000， 25: 47-48)。然而天然紫草资源有限，生长周期长达几年；此外，野生的植物大量被采挖，资 源日趋枯竭。目前，当地政府已严禁采挖。随着科学的发展，采用愈伤组织细胞及悬浮细胞生产药用植物天然活性成分已成 为一种优良的替代生产体系。植物细胞培养进行有效成分的生产发展到现在，已经取得了 令人瞩目的成就。紫草也是世界上第一个采用细胞培养体系来商业化生产紫草药用次生 代谢产物的药用植物(Tabata and Fujita, Biotechnol. Plant Sci.，Zaitlin et al.， (Eds.)，Academic Press. Orlando, 1985，207-218)，然而在植物细胞培养过程中普遍存 在细胞系不稳定，细胞生长缓慢，不耐剪切及代谢物产量低等问题成为其实现规模化生产 的瓶颈(Hamill et al. , Bio. Technol. , 1987，5: 800-804)。毛状根体系的建立已成为另一个具有广泛应用前景的高效生产药用次生代谢产 物的生物技术体系，是由发根农杆菌(^ro如cteri rhizogenes)侵染植物后形成的一 种外形如根系的转基因体系。发根农杆菌是属于根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，能侵染 绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物及个别裸子植物，诱发植物被侵染受伤部位产生毛 状根。发根农杆菌之所以具有这种致根特性是由于它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒 (root-inducing plasmid)。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个大质粒，带有冠瘿碱等 合成基因和生长素合成基因(Chilton et al.，Nature, 1982，295: 432-434)。诱导产 生的毛状根具有很多的优点①毛状根培养不需要加外源激素的情况下即可生长迅速且分 枝多；②毛状根培养次生代谢物含量一般远高于细胞悬浮培养且含量稳定；③遗传性状稳 定； 1利用毛状根进行生物转化 研究可产生某些新奇的化合物，为制药提供新的试材。自1977年Ackermarm首先用发根农 杆菌转化高等植物以来，迄今已有160多种植物诱导出了毛状根，40多种植物建立了毛状 根培养系统，并且利用其进行药用次生代谢产物的生产(陈永芳等，西北植物学报，2008， 28:2423-2428)。由于重要药用有效成分大多在根部，而Ri质粒诱导产生的毛状根具有根的特性，且具有生长速度快、激素自养、分化程度高，以及遗传性状相对稳定等优点，因此， 毛状根较细胞培养更有利于药用次生代谢物的大量生产。随着生物工程技术的不断提高，利用农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对毛状 根进行离体培养快速大量高效生产有效成分，已成为药用植物资源可持续发展的有效途径之一。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种用发根农杆菌侵染紫草幼苗茎节处，快速、高 效、稳定诱导紫草毛状根产生的方法，并对获得的紫草毛状根选用适宜的培养基，大量繁殖 并应用于生产药用次生代谢产物(如紫草宁及其衍生物等)。(1)本发明的技术方案为
采用“针刺幼苗茎节法”，即用蘸有发根农杆菌的针尖穿刺侵染紫草幼苗茎节处，快速 诱导紫草毛状根的产生，然后将诱导的毛状根从诱导部位剪下，除菌培养两周后，转到适宜 培养基上大量生长繁殖，并用来生产紫草药用次生代谢产物。紫草无菌苗来源于经低温层 积30天后萌发的紫草种子，无菌处理并培养在1/2 MS培养基上。发根农杆菌在侵染紫草 幼苗茎节前，先在YEB固体培养基中28°C培养两天，然后选取单菌落到YEB液体培养基中振 荡培养，测得菌液OD6tltl M在0. 8-1. 0时用于侵染用(在菌液浓度达到此OD值范围内之前的 12小时向菌液中添加乙酰丁香酮至终浓度100 μ Μ,以提高菌液的侵染效率)。本发明所提供的紫草毛状根的r^C基因片段，是具有SEQ ID Nol的DNA序列
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(2)本发明与现有技术相比，其有益效果是
如前所述，通过紫草细胞培养体系生产药用次生代谢产物是药用次生代谢物商业化生 产的典型代表，但通过紫草毛状根培养生产次生代谢物并进行大规模的商业化生产并未见 有相关的文献报道。尽管我国的紫草品种较多，但毛状根诱导成功的还较少，而且诱导毛状 根时主要采用农杆菌与外植体共培养的方法，转化率也较低(4. 5%)(陈永芳等，西北植物 学报，2008，28 2423-2428)；国外对紫草的毛状根诱导则主要是对半黄化无菌幼苗的下胚 轴进行侵染，转化效率在 20-50%(Yazaki et al.，Plant Cell Rep. , 1998,18:214-219)。 紫草毛状根的诱导已成了通过应用毛状根体系生产紫草药用活性成分的一个限制因素，并 制约了运用生物工程技术研究紫草合成紫草宁的分子机理及紫草转基因技术的相关研究。 本发明首次以“针刺幼苗茎节法”侵染紫草幼苗茎段节间处，实现了紫草毛状根的快速高效诱导，诱导培养1-2周即可出现发根，转化效率高达60%以上，为利用紫草毛状根生产紫草 药用次生代谢产物奠定了良好基础，具有重要的理论和应用价值。
图1 “针刺幼苗茎节法”诱导紫草毛状根的产生及大量繁殖 A 紫草种子层积处理后发芽
B 将发芽的种子去掉胚根消毒处理后转至MS培养基中子叶变绿时期的照片 C 在MS培养基中生长至长出4片真叶时用ATCC15834发根农杆菌侵染幼苗的茎段节 间位点
D 受侵染的节间位点长出白色突起 E 白色突起位点先形成绒毛状 F 绒毛状侵染位点长出一条毛状根 G 绒毛状侵染位点长出多条毛状根 H 将长出的毛状根切下后转至MS培养基中快繁培养 I 大量快繁后的照片 J 扩大培养的毛状根 图2紫草毛状根中rolC基因的PCR扩增
1、DNAmarker
2、以紫草细胞基因组DNA为模板扩增rolC基因的结果
3、以诱导出的紫草毛状根基因组DNA为模板扩增r^C基因的结果 图3紫草毛状根rolC基因PCR扩增产物的测序图谱
图4所获得r^C基因序列的Blastn比对分析鉴定
图5毛状根在M9 (A)与RC (B)液体培养基及RC固体培养基(C)中生产药用次生代 谢产物(如紫草宁及其衍生物等)。
具体实施例方式实施例1、紫草无菌苗的培养
将紫草种子表面清洗干净，低温浸泡在自来水中两天，此间换水2-3次，然后用湿砂和 种子混勻后放入4°C冰箱层积处理约1个月左右，种子出芽后(图1 A)，用自来水冲洗掉沙 子，用0. 1%升汞消毒发芽的种子5分钟，然后用无菌水冲洗5-7次，将水吸干去掉部分胚轴 后接种在1/2 MS无激素的固体培养基上，于25°C，16小时光照8小时暗培养2周(图1 B)。 待幼苗长至2-4 cm高度并伸展出第2-3对真叶时用作被侵染材料(图1 C)。
实施例2发根农杆菌培养
将发根农杆菌ATCC15834 (该菌株含Ri质粒无抗性标记)划线接种在YEB固体培养基 上，于28°C下活化，挑取平板上的单菌落，接种于25 mL YEB液体培养基中，28°C 120 rpm 黑暗下摇床振荡培养，在发根农杆菌菌液0D_ 值达到0. 8-1. 0时(之前的12小时之前向 菌液中添加乙酰丁香酮至终浓度100 μ M用于提高菌液的侵染效率)用来侵染紫草。
实施例3 “针刺幼苗茎节法”诱导紫草毛状根的产生
用无菌针蘸上述活化的具有侵染特性的菌液，用针尖穿刺紫草幼苗的第1-2对真叶的茎节处，针尖每浸蘸菌液一次，穿刺茎节处一下，共穿刺2-3次(图1 C)。然后将侵染的幼苗 转移到MS固体培养基上于25°C弱散射光培养。一周左右即可发现侵染部位出现白色突起 (图1 D)，随后在侵染部位的白色突起首先长出绒毛状根系(图1 E)，然后长出一条或多条 白色的毛状根(图1 F、G)。将诱发的毛状根从侵染部位剪切下来，培养在含有头孢霉素250 mg/L的MS培养基上，每周转接一次，直至除完菌后，移到不含抗生素MS培养基上培养(图 1 H)。实施例4紫草毛状根的快速大量繁殖
将除菌彻底、分支多、生长快的毛状根剪下长1-3 cm左右，移入到无激素的 B5固体培养基上生长，发现毛状根迅速大量繁殖，分支多，生长旺盛，2-3周以后，整个平板 即全被毛状根覆盖(图1 I)。将生长旺盛的毛状根用于继代及大量培养(图1 J)。实施例5紫草毛状根的分子鉴定
1、毛状根基因组DNA的微量提取(采用CTAB法)
(1)0.1 g材料+少量PVP，液氮研磨；
(2)加入1700uL预冷的提取介质和17 uL巯基乙醇，混勻后0°C放置10 min,7000 rpm 离心10 min，弃上清；
(3)重复(2)—次；
(4)加入1300 uL 65°C预热的 2XCTAB (0.1 M Tris-HCl pH=8,0. 02 M EDTA pH=8, 1.4 M NaCl,2% CTAB)提取液，再加入370 uL 4 M NaCl，65°C水浴1小时，期间摇动混勻；
(5)稍冷却后加入280uL无水乙醇，轻微混勻后再加入650 uL的氯仿，轻微混勻后， 40C 12000 rpm 离心 10 min，取上清；
(6)加入3 uL RNase，37°C水浴消化 20 min ；
(7)用等体积1:1的酚氯仿抽提一次，等体积氯仿抽提2次，每次取上清，(4°C，12000 r/min 10 min)；
(8)取上清，加入1/10体积的3M醋酸钠和等体积预冷的异丙醇；
(9)4°C 12000 rpm 离心 20 min，弃上清;
(10)沉淀加1 mL 70% 乙醇洗 2 次(4°C 12000 rpm 离心 10 min)；
(11)沉淀溶于450uL ddH20中，转入2 mL离心管;
(12)用等体积1:1的酚氯仿抽提一次，等体积氯仿抽提2次，每次取上清，最后一次 洗涤完毕后转入1. 5 mL离心管；
(13)加入1/10体积的3M醋酸钠和2体积的95%乙醇，沉淀20min, 4°C，12000 rpm, 20min ；
(14)沉淀加1 mL 70% 预冷的酒精 1 mL 洗 2 次(4°C，12000 rpm IOmin)；
(15)沉淀风干后溶于25uL ddH20中；
2、毛状根的rolC基因PCR扩增、测序及序列分析
取100 ng毛状根的基因组DNA为模板，以紫草细胞的基因组DNA为对照，进 行 PCR 扩增。ro/C基因的引物序列为Forward Primer 5' CTCCTGACATCAAACTCGTC 3，， Reverse Primer :5，TGCTTCGAGTTATGGGTACA 3，。PCR扩增体系为10 X PCR buffer 5 μ L、 10 mM dNTP mix 1 μ L、25 mM MgCl2 3 μ LUO μ M上游引物和下游引物各1 μ L、基因组 DNAl μ L>Taqg|(TaKaRa Biotech. Co. , Ltd, Dalian, China) 0. 5 μ L、灭菌水补齐至Ij50 μ L。PCR扩增程序为95°C预变性 5 min，然后 95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 30 sec 共30个循环，72°C延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳结果表明，只有毛状根的DNA可PCR扩增 得到约600 bp的片段，而对照却没有扩增产物(图2)，初步说明毛状根确实为发根农杆菌 侵染后产生的。为进一步验证所扩增得到的确实为r^C基因，我们对PCR产物进行了测序 获得了测序图谱(图3)，并通过Blastn分析证实了 PCR产物扩增到得确实为r^C基因(图 4)，说明r^C基因已插入紫草基因组中，所得到的毛状根确实为发根农杆菌ATCC15834侵 染紫草后形成的。 实施例6毛状根诱发紫草宁生产培养基的筛选
挑取在无激素B5固体培养基上生长一周的毛状根0. 1 g，转移到M9 (Fujita et al., Plant Cell Rep. 1981，1:61-63)(图 5 Α)与 RC (Shimomura et al. , Plant Cell Rep. 1991，10: 282 - 285)液体培养基(图5 B)与RC固体培养基上(图5 C)，3天以后即发现 有红色的紫草宁产生，时间越长紫草宁的产量越高。因此，M9和RC培养基均可作为毛状根 高效产生紫草宁及其衍生物等药用次生代谢产物的生产培养基。
权利要求
一种高效诱导紫草毛状根产生的方法，其特征是针刺幼苗茎节法，具体步骤为用蘸有发根农杆菌ATCC15834的针尖穿刺侵染紫草幼苗的第1 2对真叶处的茎节位点，然后将侵染的幼苗转移到MS固体培养基上于25℃弱散射光培养，1 2周左右即可长出一条或多条白色的毛状根。
2.根据权利要求1所述的高效诱导紫草毛状根产生的方法所获得的毛状根在生产紫 草药用次生代谢产物中的应用方法，其特征是挑取生长良好的毛状根，接种到M9或RC液体 或固体培养基上，于25°C黑暗处培养，液体培养基需120rpm摇动，即可大量产生紫草宁及 其衍生物。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种采用发根农杆菌侵染紫草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物(如紫草宁及其衍生物等)。具体内容涉及紫草无菌苗的获得、发根农杆菌ATCC15834菌株的活化及侵染方法、毛状根除菌培养、毛状根的分子鉴定及大量繁殖、应用此毛状根在M9和RC培养基中大量生产药用次生代谢产物。本发明为紫草毛状根的产生提供了一种高效快速的诱导方法，并为利用此毛状根大量商业化生产药用次生代谢产物提供了一种新的途径。
文档编号C12N15/82GK101979603SQ20101053603
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者丁燕雯, 刘洪昌, 夏红梅, 戚金亮, 朱煜, 杨永华, 赵胡, 邹爱兰 申请人:南京大学