专利名称：一株乳酸菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株乳酸菌及其应用。
背景技术：
全世界每年约有25%的粮油作物由于真菌毒素的污染而不能食用。发酵食品的 真菌污染也日益严重，主要为青霉和曲霉的某些菌种。在被污染的食品和饲料中可以检测 到青霉素、青霉酸、赭曲霉毒素A和桔霉素。青霉和曲霉是大量食品和饲料的主要腐败菌， 镰刀霉经常在谷物中出现，它们会导致大量真菌毒素的积累.。不同的霉菌会在不同食品 冷态储存中出现，P. roqueforti和P. commune经常会导致硬质干酪的腐败。近平滑假丝酵 母、粘红酵母和娄地青霉是酸奶和其他发酵乳制品中主要的腐败菌。目前农产品主要防止真菌及其毒素的方法有采取良好农业生产规范；选育抗真 菌性能良好的品种；收获后采取良好的储藏条件；添加化学农药或防腐剂等。食品主要采 用物理方法如辐照、超声、冷藏保存以及添加化学抗菌剂。如纳他霉素、苯甲酸钠、山梨酸 钾以及丙酸钙等。但防霉效果不是很理想，而且目前许多的霉菌对化学制剂产生了一定的 抗性，这存在很大的潜在危险。抗生素和防腐剂的广泛应用对微生物抗菌性的增加有很大 的风险；公众需要在食品和饲料中减少防腐剂和各种添加剂；消费者需要高质量、保存方 便、安全的适度加工但是有较长保质期的食品。另一方面，立法也会对现在不同食品中的添 加剂采取限制和控制措施。因此，以生物方法控制真菌的生长和真菌毒素的积累有重要的意义。目前，生物防 腐在延长食品货架期和加强食品安全方面起到了越来越重要的作用。生物防腐主要是通过 自然发酵、添加发酵剂、或添加代谢产物来起到保质的作用。乳酸菌用在食品和饲料中有着悠久的历史，它可以降低食品PH值并产生抑菌的 代谢物质，自古以来就用于食品发酵和保藏，现在被视为公认安全微生物(GRAS)。MRS液体培养基是现有技术中常用的培养基，具体制备方法如下将蛋白粉 10. 0g、牛肉膏10. 0g、酵母浸出粉5. 0g、葡萄糖20. 0g、醋酸钠5. 0g、磷酸氢二钾2. 0g、柠檬 酸二铵2. 0g、吐温-801g、硫酸镁0. 58g、硫酸锰0. 25g和碳酸钙5. Og混合，使用蒸馏水定容 至 IOOOmL, 121°C灭菌 15min。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株乳酸菌。本发明所提供的乳酸菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LLJ，其保藏编号为 CGMCCNo. 4352。本发明的另一个目的是提供一种生物防腐剂。本发明所提供的生物防腐剂，其活性成分为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) CGMCCNo. 4352。所述生物防腐剂按照包括如下步骤的方法制备得到将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) CGMCC No. 4352接种于灭菌MRS液体培养基中，37°C培养24h，得到 种子培养液；然后按接种量将所述种子培养液接入脱脂乳培养基中，37°C培养24h，得 到生物防腐剂；将发酵容器内的所有物质记作生物防腐剂；脱脂乳培养基按照包括如下步骤的方法制备得到将脱脂乳粉溶解于蒸馏水或去 离子水中，使脱脂乳粉在蒸馏水或去离子水中的浓度为100g/L，得到所述脱脂乳培养基。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) CGMCC No. 4352在抗真菌中的应用也属于本 发明的保护范围，所述应用为非疾病治疗方法。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) CGMCC No. 4352在制备具有抗真菌功能产品 中的应用也属于本发明的保护范围。上述生物防腐剂在抗真菌中的应用也属于本发明的保护范围，所述应用为非疾病 治疗方法。生物防腐剂在制备具有抗真菌功能产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述应用中，所述抗真菌为在食品的制备和/或食品的贮存中抗真菌。上述任一所述应用中，所述抗真菌为在饲料的制备和/或饲料的贮存中抗真菌。上述任一所述应用中，所述食品为乳制品。上述任一所述应用中，所述乳制品为酸乳。 上述任一所述应用中，所述真菌为引起腐败的真菌。上述任一所述应用中，所述引起腐败的真菌为霉菌或酵母菌。上述任一所述应用中，所述霉菌具体可为青霉(Penicillium sp.)，所述酵母菌具 体可为红酵母(Rhodotorula sp.)。本发明的最后一个目的是提供一种制备酸乳的方法。本发明所提供的制备酸乳的方法，包括如下步骤(1)向生牛乳中加入蔗糖混勻，高温灭菌，再降温至40°C ；(2)在步骤(1)的基础上加入酸奶发酵剂和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) CGMCC No. 4352或加入酸奶发酵剂和权利要求2或3所述生物防腐剂，42°C培养至容器内所 有物质凝结；(3)在步骤⑵的基础上，将容器内所有物质置于4°C保持16h，得到酸乳。上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述生牛乳和所述蔗糖的配比为生 牛乳蔗糖=IOOrnl 4mg。上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述生牛乳和所述酸奶发酵剂的配 比为生牛乳酸奶发酵剂=IOOrnl 0. Sgo上述任一所述制备方法中，所述步骤(2)中，所述生牛乳和权利要求2或3所述生 物防腐剂的配比为生牛乳生物防腐剂=IOOml 2mg-8mg或100ml 2mg或100ml 4mg 或 IOOrnl 6mg 或 IOOrnl 8mg。上述任一所述制备方法中，所述步骤(1)中，所述高温灭菌的方法为115°C灭菌 7min。本试验中，干酪乳杆菌LLJ作为生物防腐剂可有效抑制酸乳中霉菌生长，延长酸 乳货架期。对酸乳产品风味、感官品质等无显著影响。LLJ作为一种新型、安全的生物防腐 剂，在发酵食品及青贮饲料生产中将具有良好的应用前景，可减少或替代化学防腐剂的使用。本发明菌株具有生态安全、应用简易、贮藏效果良好等优点；菌株活性保持时间长，性能 稳定，对人和动物安全。
图1为不同保鲜菌添加量酸乳感官鉴评。图2为添加2% LLJ酸乳样品与空白样品4°C货架期保存实验(第21天)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。分离培养基(MRS琼脂培养基)蛋白粉lO.Og、牛肉膏lO.Og、酵母浸出粉5.0g、葡 萄糖20. 0g、醋酸钠5. 0g、磷酸氢二钾2. 0g、柠檬酸二铵2. Og,吐温_801g、硫酸镁0. 58g、硫 酸锰0. 25g、碳酸钙5.0，使用蒸馏水定容至IOOOmL,加入1.2% 1. 5%琼脂，80°C水浴溶 解，121°C 灭菌 15min。牛肉膏购自北京奥博星生物技术有限公司，产品目录号为01-009。酵母浸出粉购 自北京奥博星生物技术有限公司，产品目录号为01-012。实施例1、菌株的分离与鉴定一、分离1、样品稀释液的制备及细菌分离样品取自实验室自制切达干酪，切达干酪是采集北京某畜牧场的生牛乳，再进行 发酵制备得到的。将Ig样品用IOml无菌生理盐水溶解制成样品液，用Iml无菌枪头吸取样品液 lml，放入9ml灭菌生理盐水中，震荡混勻即成ICT1稀释液。依次类推，连续稀释至10_8。在 10_6、10_7、10_8梯度分别吸Iml稀释液至于培养皿中，并到入45°C左右上述MRS琼脂培养基， 混勻。37°C培养48h。该分离的菌株是乳制品发酵过程中的非发酵菌，是环境中的菌，即该 菌株是从环境中分离得到的菌株。2、菌株初步纯化用接种针挑取平皿表面及底部圆形或梭形的乳酸菌疑似单菌落，在MRS平板培养 中划线接种，37°C培养48h。平板纯化四代，镜检后转斜面贮藏。3、菌株筛选3. 1 初筛1)菌体形态观察培养24h后，挑取单菌落，做革兰氏染色实验，在光学显微镜下 观察并记录现象。2)过氧化氢酶试验用接种环挑取固体培养基上菌落滴加3%过氧化氢溶液2mL， 观察结果，不发生气泡者为阴性。3)葡萄糖产气试验在装有液体MRS培养基的试管中倒置一杜氏小管，接入疑似 菌株37 °C培养24h，观察杜氏小管内有无气泡的生成。4)葡萄糖产酸试验在装有液体MRS培养基的试管中加入浓度为1. 6g/100mL的 溴甲酚紫作为指示剂，添加量为1. 4mL/L，接入疑似菌株，37°C培养24h，若培养基由紫色变为黄色，则证明有酸产生。3. 2 复筛1)乳酸菌无菌体发酵液制备按2%的接种量，将活化后的乳酸菌接种于MRS液体培养基，37°C培养48h，经离心 (4000 Xg, IOmin)收集上清液。将上清液用0. 22 μ m无菌滤膜过滤。2)霉菌孢子悬浮液制备将指示菌Penicillium sp.于PDA(马铃薯琼脂培养基)斜面培养基30°C培养7d， 直至孢子生成。用含有0.05% (v\v)吐温-80的无菌水冲洗斜面，用无菌纱布过滤，并利用 血球计数板将孢子浓度调制为IO6HiLA3)琼脂平板扩散法测定抑菌能力将20mL PDA培养基注入培养皿中，待凝固后将100 μ L制备好的霉菌孢子悬浮液 涂布于培养基上，将牛津杯轻置于平板上，静置5min后取200 μ L无菌体发酵液注入牛津杯 中。30°C培养2d，测定抑菌圈直径。结果得到一株菌的抗真菌效果好，将其命名为LLJ。二、鉴定1、形态菌体形态观察将菌株LLJ接种于MRS琼脂培养基，培养24h后，挑取单菌落，做革 兰氏染色实验，在光学显微镜下观察并记录现象。结果菌落乳白色，小，表面光滑；显微镜 观察细胞呈杆状，长度约2-6 μ m,直径约为0. 7-1. 2 μ m,呈对或链状出现；无鞭毛，不运动， 无孢子。革兰氏染色阳性，兼性厌氧。2、生理生化鉴定1)过氧化氢酶试验用接种环挑取固体培养基上菌落滴加3%过氧化氢溶液2mL， 观察结果，不发生气泡者为阴性。LLJ检测结果为过氧化氢酶阴性。2)葡萄糖产气试验在装有液体MRS培养基的试管中倒置一杜氏小管，接入疑似 菌株37°C培养24h，观察杜氏小管内有无气泡的生成。LLJ检测结果为葡萄糖产气阴性。3)葡萄糖产酸试验在装有液体MRS培养基的试管中加入浓度为1. 6g/100mL的 溴甲酚紫作为指示剂，添加量为1.4mL/L，接入菌株，37°C培养24h，若培养基由紫色变为黄 色，则证明有酸产生。LLJ检测结果为葡萄糖产酸阳性。3、16s rDNA检测菌株LLJ的16s rDNA序列。采用北京天根生化科技有限公司的TIANnamp Bacteria细菌基因组DNA提取试剂 盒提取本发明筛选的LLJ菌株基因组DNA，PCR扩增引物为上海宝生物技术有限公司所提 供，引物序列如下Primers 16S. S(5__GGTGTAGCGGGTGAAATGCGAA_3_)16S. R(5_-CAGCCTACAATCCGAGCTGAG-3_)PCR反应条件94 0C 5.OminIcycle
94 0C l.Omin 、
55 °C l.Omin >- 30cycles
72 °C 1.5min ^
72 °C 5.OminlcyclePCR产物检测及纯化预先制备1.0%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后，取5μ L的PCR产物与 1 μ L6XLoading buffer混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电压5V/cm。电泳后， 用溴化乙锭染色20-30分钟，紫外灯下观察。如果PCR成功，则可见到约为1500bp的条带。 采用宝生物公司的切胶回收试剂盒(TaKaRa Code :DV805A)纯化回收PCR扩增产物。将PCR扩增产物用上述的引物进行DNA测序。测得的菌株LLJ的16s rDNA序列 中第1-600位核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。用BLAST程序与美国国立生物技术信息中心数据库中已报道的细菌16s rDNA序 列进行相似性比较分析。结果将菌株LLJ的16s rDNA序列中第1-600位核苷酸序列与 美国国家菌种保藏中心标准菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 334同源性为 99%。综合以上鉴定结果，菌株LLJ为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。该菌株已于 2010年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号 为 CGMCC No. 4352。实施例2、菌株LLJ抗真菌
1、菌株LLJ无菌体发酵液制备按2%的接种量，将活化后的菌株LLJ接种于MRS液体培养基，37°C培养48h，离心 (4000 X g，IOmin)，收集上清液。将上清液用0. 22 μ m无菌滤膜过滤，得到菌株LLJ无菌体 发酵液。2、霉菌孢子悬浮液制备指示菌青霉(Penicillium sp.)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)， 产品目录号为ACCC 31506。将指示菌(Penicillium sp.)于PDA(马铃薯琼脂培养基)斜面培养基30°C培养 7d，直至孢子生成。用含有0.05% (v\v)吐温-80的无菌水冲洗斜面，用无菌纱布过滤，并 利用血球计数板将孢子浓度调制为IO6HiLA3、琼脂平板扩散法测定抑菌能力将20mL PDA培养基注入培养皿中，待凝固后将100 μ L制备好的霉菌孢子悬浮液 涂布于培养基上，将牛津杯轻置于平板上，静置5min后取200 μ L菌株LLJ无菌体发酵液注 入牛津杯中。30°C培养2d，测定抑菌圈直径。实验设3次重复，结果取平均数。结果抑菌圈直径为20. 83mm。实施例3、菌株LLJ抗真菌性能在制备和贮存酸乳中的应用
一、酸乳制备酸奶发酵剂购自科汉森(天津)食品添加剂有限公司，产品目录号为YF-L822。脱脂乳粉为新西兰恒天然脱脂乳粉，购自恒天然商贸(上海)有限公司，产品目 录号为F0993。脱脂乳培养基的制备将脱脂乳粉溶解于蒸馏水中，脱脂乳粉在培养基中的浓度 为100g/L。脱脂乳培养基经115°C，7min高压灭菌。1、干酪乳杆菌LLJ生物防腐剂的制作将菌株LLJ接于5ml灭菌MRS液体培养基中，37°C培养24h，得到种子培养液；然 后按接种量将种子培养液接入脱脂乳培养基中，37°C培养24h，得到发酵物(即为生物 防腐剂)；容器内的所有物质记作发酵物。2、酸乳的制作生牛乳中加入蔗糖混勻(100ml生牛乳4mg蔗糖)，115°C灭菌7min，待温度降到 40°C时，加入酸奶发酵剂(100ml生牛乳0.8g酸奶发酵剂)及生物防腐剂(100ml生牛 乳2mg生物防腐剂)，42°C培养至容器内所有物质凝结(pH 4. 5 5)时取出，置于4°C保 持16h，得到酸乳。以未添加干酪乳杆菌LLJ生物防腐剂的酸乳作为空白对照。3、酸乳理化指标测定1)酸乳pH值的测定样品pH值由校准的酸度计(梅特勒-托利多上海有限公司) 直接测定，测定时间与滴定酸度同步。2)酸乳滴定酸度的测定将IOmL待测酸乳样品与等体积蒸馏水混合，滴入1 2 滴浓度为5%的酒精酚酞指示剂，用标定过的0. Imol · L4NaOH标准溶液滴定至微红并纪录 滴定量。酸乳的滴定酸度以吉尔涅尔度(OT)表示。3)酸乳黏度的测定样品的黏度由旋转粘度计(美国博力飞公司)直接测定，将 水浴锅温度调整为25°C，取待测酸乳样品约50mL倾入同一型号烧杯中，选用仪器所配64号 转子，转速为50 X g，每5秒取值一次，连续测定60s。4、酸乳感官评定根据《中国乳制品工业行业规范_酸牛乳感官质量评鉴细则》进行。实验设3次重复，结果取平均值。二、效果检测将步骤一得到的酸乳根据《中国乳制品工业行业规范-酸牛乳感官质量评鉴细 则》进行感官鉴评，在第1天、第7天、第14天、第21天测定PH值、滴定酸度、黏度，并观察 酸乳微生物污染状况。(一 )贮藏期间酸乳ρ H及滴定酸度变化实验结果如下见表1、表2。在4°C贮藏期间，酸乳样品随时间延长pH逐渐降低， 实验组(100ml生牛乳2mg生物防腐剂)同空白样相比，在发酵过程中pH差异不显著(P >0.05)，在保藏期内pH均保持在4.0以上。干酪乳杆菌LLJ后酸化能力较弱。至货架期 终止，实验组酸乳比空白样PH高0. 14。表1贮藏期间PH值变化
权利要求
1.干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LLJ，其保藏编号为 CGMCC No. 4352。
2.一种生物防腐剂，其活性成分为干酪乳杆菌(LactcAacillus casei) CGMCC No.4352。
3.根据权利要求2所述的生物防腐剂，其特征在于所述生物防腐剂按照包括如下步 骤的方法制备得到将干酪乳杆菌(LactcAacillus casei) CGMCC No. 4352接种于灭菌MRS 液体培养基中，37°C培养Mh，得到种子培养液；然后按接种量将所述种子培养液接入 脱脂乳培养基中，37°C培养Mh，得到生物防腐剂；将发酵容器内的所有物质记作生物防腐 剂；脱脂乳培养基按照包括如下步骤的方法制备得到将脱脂乳粉溶解于蒸馏水或去离子 水中，使脱脂乳粉在蒸馏水或去离子水中的浓度为100g/L，得到所述脱脂乳培养基。
4.权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CGMCC No. 4352在抗真菌中 的应用，所述应用为非疾病治疗方法；或，权利要求1所述的干酪乳杆菌(LactcAacillus casei) CGMCC No. 4352在制备具有 抗真菌功能产品中的应用；或，权利要求2或3所述的生物防腐剂在抗真菌中的应用，所述应用为非疾病治疗方法；或，权利要求2或3所述的生物防腐剂在制备具有抗真菌功能产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述抗真菌为在食品的制备和/或食品 的贮存中抗真菌，或所述抗真菌为在饲料的制备和/或饲料的贮存中抗真菌。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述食品为乳制品；和/或所述乳制 品为酸乳。
7.根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于所述真菌为引起腐败的真菌；所 述引起腐败的真菌为霉菌或酵母菌；所述霉菌为青霉(Penicillium sp.)，所述酵母菌为红 酵母(Rhodotorula sp.)。
8.一种制备酸乳的方法，包括如下步骤(1)向生牛乳中加入蔗糖混勻，高温灭菌，再降温至40°C；(2)在步骤(1)的基础上加入酸奶发酵剂和干酪乳杆菌(LactcAacilluscasei) CGMCC No. 4352或加入酸奶发酵剂和权利要求2或3所述生物防腐剂，42°C培养至容器内所有物质 凝结；(3)在步骤的基础上，将容器内所有物质置于4°C保持16h，得到酸乳。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述生牛乳和所述蔗糖 的配比为生牛乳蔗糖=IOOml 4mg ；和/或，所述步骤( 中，所述生牛乳和所述酸奶发酵剂的配比为生牛乳酸奶发酵剂 =IOOml 0. 8g ；和/或，所述步骤⑵中，所述生牛乳和权利要求2或3所述生物防腐剂的配比为生 牛乳生物防腐剂=IOOml 2mg-8mg 或 IOOml 2mg 或 IOOml 4mg 或 IOOml 6mg 或 IOOml 8mg。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述高温灭菌的方法为115°C灭菌 7min。
全文摘要
本发明公开了一株乳酸菌及其应用。该菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LLJ，其保藏编号为CGMCC No.4352。干酪乳杆菌LLJ作为生物防腐剂可有效抑制酸乳中霉菌生长，延长酸乳货架期。对酸乳产品风味、感官品质等无显著影响。LLJ作为一种新型、安全的生物防腐剂，在发酵食品及青贮饲料生产中将具有良好的应用前景，可减少或替代化学防腐剂的使用。本发明菌株具有生态安全、应用简易、贮藏效果良好等优点；菌株活性保持时间长，性能稳定，对人和动物安全。
文档编号A23C9/12GK102093965SQ201010568459
公开日2011年6月15日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者刘鹭, 吕加平, 孔凡丕, 孙卓, 孙洁, 张书文, 李红娟 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所