专利名称：番茄生长素受体同源基因s1tir1在果实单性结实中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物生长素受体同源蛋白SlTIRl及其编码基因的应用。
背景技术：
无籽果实是指果实中没有种子或只有败育的种子，根据是否受精可分为两类一类是单性结实，子房不经过授粉而发育成果实称为天然单性结实或自发性单性结实；虽经授粉，但并未受精，或直接受到其它物质的刺激而发育成的果实称为刺激性单性结实或人工单性结实。另一类无籽果实是子房受精后，胚珠在发育过程中败育，长成的果实内没有种子。无籽果实具有许多优点其一，果实品质高、口味好。研究表明，无籽番茄比有籽番茄干物质含量高，且糖分较多，而酸和纤维素含量较少，因而口味更佳。其二，无籽果实的产量相对稳定。授粉是形成果实一系列过程中最薄弱的环节。自然条件下，影响授粉过程的因素很多，比如温度过高或过低都会导致作物不能够成功授粉，从而影响作物产量。而单性结实不需要授粉，在不利授粉的条件下，也能保持产量稳定。事实上单性结实的番茄在低温下的座果率和产量均高于有籽品种。这样，单性结实品种在冬季也可结果。其三，无籽果实的保鲜贮藏期更长。种子代谢产生的激素能引起果实腐烂变质。无籽果实因无种子，其变质腐烂明显减慢。例如无籽西瓜的过熟、腐烂比有籽西瓜明显减少。生长素在调节果实发育过程中起着重要作用。坐果是指静止状态的子房向快速生长状态的幼果的转变过程。自然条件下，大多数农作物的坐果依赖于成功的授粉。坐果过程也可以由人工施加激素来诱导其发生，例如施加生长素和赤霉素。对番茄子房施加生长素或子房、胚珠中表达生长素合成相关基因能够引起不依赖于授粉的坐果，最终产生单性结实果实。迄今为止，几个生长素信号相关基因S1ARF7、SlIAA9、AtARFS参与了果实坐果过程，影响他们在植物体内的表达水平能够引起单性结实果实的发生。说明生长素信号在果实单性结实过程中起着重要作用。生长素及其信号转导过程直接调控果实单性结实。随着植物基因工程的发展，最近几年人们开始利用与生长素信号相关基因来生产无籽果实。这可能也是生产无籽果实的好方法，因为它对种子公司和消费者均具有一定的吸引力。但目前还没有关于番茄生长素受体同源基因SlTIRl对单性结实影响的相关报道。我们利用构建的番茄SlTIRl基因的超表达载体转化番茄，结果表明，SlTIRl在番茄中的超表达导致番茄单性结实。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供番茄生长素受体SlTIRl基因的用途。利用该基因可以产生单性结实的番茄果实。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种番茄生长素受体同源基因S1I1R1，其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；其用途是使用该基因所得的转基因农作物具有单性结实的能力。
本发明还提供了一种DNA质粒，该质粒含有上述生长素受体同源基因SlTIRl或者其中的基因片段所构建得到的超表达框。作为本发明DNA质粒的改进超表达的核苷酸序列为SEQ ID NO :2.本发明还提供了一种转基因番茄细胞含有上述质粒。本发明还提供了一种转基因番茄的制备方法将上述转基因番茄组织培养成植株。本发明还提供了上述DNA质粒的用途利用该DNA质粒所得的转基因农作物产生的单性结实果实。本发明首先提供一种番茄生长素受体同源基因S1I1R1，该基因的cDNA核苷酸序列为SEQ ID NO :1，编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO :3.用于扩增所述基因或所述基因中的任一 DNA片段的引物对均属于本发明的保护范围。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有SlTIRl基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其他参与mRNA加工或基因表达的 DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。SlTIRl基因可以和一个启动子和一个终止子功能性的连接而组成表达框。启动子可以是花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMU35S)、或者水稻或者玉米泛素^biquitin)启动子、或者水稻Actin启动子、或者其他有活性的启动子；终止子可以利用功能基因的天然终止子。例如NOS终止子。SlTIRl基因表达框可以通过基因枪方法和农杆菌介导等方法导入农作物基因组。含有SlTIRl基因的转基因农作物，能够具有单性结实的能力。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 荧光素酶基因)、具有抗性的抗生素标记物(卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因 (如抗除莠剂基因)等。所述的重组表达载体具体为图3所示的重组表达载体。图3所示的表达载体骨架为PCAMBIA1301，在载体骨架中先插入含有35S启动子和NOS终止子的框架序列，再插入所述外源基因，外源基因由35S启动子启动。本发明还提供了一种产生单性结实的方法，是将所述基因导入植物细胞中，得到单性结实的转基因植物。
图1为番茄SlTIRl基因结构示意图。图2为野生型番茄SlTIRl基因组织特异性表达分析图。图3为重组表达载体中表达框结构简4番茄SlTIRl果实建立及形成单性结实果实图。图5为SlTIRl超表达转基因植株中生长素应答因子的定量PCR图。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明做进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的TO代表示由愈伤组织得到的植株。实施例1 番茄SlTIRl基因cDNA克隆对番茄EST数据库的比对分析结果表明，EST序列(SGN-U327259)与拟南芥 AtTIRl序列具有很高的同源性。SGN-U327259与AtTIRl核苷酸序列比较结果显示，该EST 已经包含了 5’端DNA序列。于是这条EST被选用于克隆生长素受体同源基因cDNA。根据 EST 序列，我们设计了一条序列特异性引物 Pl :5，-GAAGCCTCATTTTGCTGATTTCA-3，(SEQ ID NO 4)。使用 TRIZOL(invitrogen，USA)法提取番茄(Micro-Tom)幼苗总 RNA，取 2 μ g 总 RNA，采用 Fermentas Reverse Transcription Kit (Fermentas, UK)制备 cDNA，整个操作均按照试剂盒说明进行。根据3’_Full Race Core试剂盒说明，Pl引物与试剂盒中另外三条引物被用于扩增cDNA3’端序列。对PCR产物进行电泳检测、回收后连入pMD-T载体中，经测序确定为 3，端序列。经过拼接得到SlTIRl基因cDNA序列。实施例2 番茄SlTIRl基因全序列的获得利用获得的cDNA序列，在番茄数据库(SGN)进行比对，从而获取到番茄SlTIRl基因全序列。该基因由3849个脱氧核糖核苷酸组成(见序列表序列1)。SlTIRl基因组从5’ 端起始密码子ATG开始至3’终止密码子TAG，全长3849个核苷酸，包括3个外显子，2个内含子。SlTIRl基因的结构(见图1).实施例3 =SlTIRl基因在植株不同组织的表达分析取番茄不同组织的材料(根、茎、叶、花、未成熟绿果、成熟绿果、破色期果实、成熟果实)进行半定量分析。分析结果表明SlTIRl在花中的表达量较高，说明SlTIRl可能在花器官发育过程中发挥着重要的作用。为了进一步研究SlTIRl在花器官发育过程中作用，我们用不同时期花器官不同部位的材料(开花前1天萼片、雄蕊、雌蕊、子房；开花前萼片、雄蕊、雌蕊、子房；开花后4天)进行定量分析。定量PCR结果表明，从开花前到开花期，SlIlRl 在萼片中的表达量上升，在雄蕊中表达量明显下降。从开花期到开花后4天，即果实建立的关键时期，SlTIRl在萼片及子房中的表达量呈下降趋势(图2)。说明SlTIRl可能在花发育过程，特别是从花到果实的转变过程中起着重要作用。实施例4 农杆菌转化SlTIRl基因的T-DNA超表达载体的构建根据SlTIRl cDNA 序列设计引物F :5，-TACACTTTTGCCCTTCCCACC_3，(SEQ ID NO 5)，R :5’-CGCTAATACCTGCCCATCTTT-3’ (SEQ ID NO :6)，扩增出包含编码框在内的一段序列， PCR扩增条件是95° Cys 30秒，55° Cys 30秒，72° Cys 2分钟，进行30个循环。将其片段插入到改造过的植物表达载体pCAMBIA-1301(由于潮霉素对番茄转化后的分化过程具有抑制作用，为了降低抑制作用，用卡那霉素抗性基因将PCAMBIA-1301载体上的潮霉素抗性基因进行替换)，构建出pCAMBIA-SlTIRl超表达载体(图3)。利用冻融法转入到农杆菌C58中。实施例5 转基因番茄的获得番茄种子经过表面消毒75%的乙醇处理1分30秒，无菌水冲洗3-4遍。再用4%的NaClO处理15分钟，无菌水冲洗5遍后将种子置于1/2MS培养基中萌发。待第一片真叶出现后，将子叶切下并去掉两端，置于MS+2，4-D+KT的培养基中预培养M小时，同时在28 V 活化农杆菌。次日，当农杆菌0D600 = 1. 0时，去Iml菌液离心，用KCMS培养基重悬菌体， 使0D600 = ο. 05-0. 5之间，然后用其侵染外植体30分钟，用滤纸吸去多余的菌液，将外植体置于KCMS固体培养基中共培养48小时。再将外植体转入2Z培养基中进行分化。经过大约2-3周左右分化，待到分化苗出现后，将其转导继代培养基中培养2周，将2-3cm的苗切下置于生根培养基中生根，将生根的幼苗移栽到温室。经过⑶S染色和PCR方法检测后， 阳性植株用于进一步的研究。实施例6 =SlTIRl超表达导致番茄单性结实通过对转基因植株的表型分析发现，SlTIRl超表达导致番茄单性结实果实的形成。野生型番茄的果实坐果始于授粉受精过程，之后子房逐渐增大。而在SlTIRl超表达植株中，果实坐果过程在授粉前就已经发生，开花前的花中的子房已经膨大，到开花期，子房已经明显突出雄蕊(图4)。利用定量PCR方法，我们检测了几个与单性结实及生长素信号相关的生长素信号因子的表达情况，结果表明，SlTIRl超表达导致了 S1IAA9，S1ARF6，S1ARF7 等基因的表达下降，S1IAA3的表达量上升(图5)。说明SlTIRl对生长素信号起着正调节作用，从而影响了果实建立过程。
权利要求
1.一种番茄生长素受体同源基因S1I1R1，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其用途是使用该基因所得的转基因弄作用具有单性结实的能力。
2.—种DNA质粒，其特征在于含有权利要求1所述的SlTIRl基因或者其中的基因片段所构建得到的表达框。
3.根据权利要求2所述的DNA质粒，其特征是1)其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子。2)或与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
4.用于扩增权利要求2或3所述基因或所述基因中的任一DNA片段的引物对。
5.含有权利2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体如图3所示。
7.一种培养单性结实植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入植物细胞中，得到单性结实植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求5 或6所述的重组表达载体导入植物细胞中。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述植物为番茄。
全文摘要
本发明公开了一种番茄生长素受体同源基因SlTIR1，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；使用该基因cDNA编码框序列转化所得的转基因农作物能够产生单性结实果实。本发明还公开了一种DNA质粒，其含有上述番茄生长素受体SlTIR1基因或者其中编码框序列所构建得到的超表达框。将本发明基因的编码序列通过重组超表达载体导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培养成植株，可以得到单性结实的转基因植株。本发明的基因对于单性结实机制的研究，提高植物的单性结实相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在作物的改良工作中具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/82GK102533779SQ20101059117
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者任振新, 李正国, 杨迎伍, 邓伟 申请人:重庆大学