专利名称：猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法
技术领域：
本发明涉及一种内置生物人工肝支持系统，特别涉及猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法
背景技术：
生物人工肝主要包括外置和内置生物人工肝两种类型。其基本原理是将体外培养增殖的肝细胞置于循环装置或者直接置于体内，患者血液/体液通过生物纤维半透膜与培养的肝细胞进行物质交换，从而达到理想的人工肝支持作用。肝细胞是生物人工肝的核心材料，生物人工肝对肝功能衰竭患者的支持作用依赖于所用肝细胞的功能。当前，原代猪肝细胞因其解剖结构、生理特点、合成代谢功能均与人类最为相似，来源丰富，细胞分离技术成熟简单，故在生物人工肝研究中应用甚广。随着免疫隔离技术的飞速发展，由生物材料制成的半透膜如微囊膜可有效阻止免疫细胞、免疫球蛋白和补体的进入，使异种异体细胞构建生物人工肝的免疫排斥问题迎刃而解。内置生物人工肝治疗肝功能衰竭的效果主要取决于内置细胞材料的活性状态和功能表现。在本发明之前，生物人工肝的治疗效果并不令人满意，究其原因系所用肝细胞的活性及功能无法长期高效维持。原代肝细胞是一种高分化细胞，正常生理状态下处于静止期，很难分化增殖。成熟肝细胞一旦失去体内生理微环境，在体外传统培养过程中极易丧失其结构特征和分化再生能力，呈“去分化”状态。特别是在进入内稳态紊乱的肝衰患者体内后，内置细胞通常无法长期存活，增殖能力极度有限，严重影响移植物对宿主肝功能的支持作用。同时，输注的肝细胞产生各种促肝再生刺激因子的功能也随之受到抑制。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供一种猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝装置。本发明的技术方案如下猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法，其主要技术步骤在于(1)建立猪骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系从成年健康实验用小型猪髂骨抽取骨髓，制备单细胞悬浮液，密度梯度离心后收集单核细胞层，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，随后放置于37°C、5% CO2培养箱中培养；(2)两步胶原酶法原位灌注分离猪原代肝细胞将健康猪麻醉成功后外周静脉全身肝素化，结扎门静脉和肝下下腔静脉远心端， 近侧插管分别作为灌注流入道和流出道，阻断肝上下腔静脉，使用D-Hanks液灌注肝脏直到血色完全褪去，0. 05%胶原酶缓慢持续原位灌注肝脏，收集肝细胞悬液，台盼蓝拒染试验计算细胞活力>95% ；(3)藻酸盐-聚左旋赖氨酸制备微囊包被肝细胞和骨髓间充质干细胞肝细 胞与骨髓间充质干细胞混合成单细胞悬液，将上述单细胞悬液悬于2%海藻酸钠溶液，微囊静电液滴发生器滴入到lOOmmol/L的CaCl2中，形成海藻酸钙珠；0. 05%多聚赖氨酸和0. 14%海藻酸钠分别包裹海藻酸钙珠，以形成微胶囊；再用lmmol/L柠檬酸钠液化微胶囊核心。本发明的优点和效果在于将骨髓间充质干细胞引入内置生物人工肝系统，通过异质细胞间相互作用，包括可溶性细胞因子、细胞功能性接触以及细胞_细胞外基质作用，充分模拟肝细胞在体微环境，有效延长肝细胞的生存时间，促进肝细胞增殖分化，并保持肝细胞特有的生物学功能，从而显著改善内置生物人工肝治疗肝功能衰竭的治疗效果。
图1——骨髓间充质干细胞光镜图。图2——骨髓间充质干细胞流式鉴定图。图3——原代肝细胞光镜图。图4——内置生物人工肝细胞材料光镜图。图5——内置生物人工肝细胞材料扫描电镜图。图6——内置生物人工肝细胞材料透射电镜图。图7——内置生物人工肝细胞材料糖原染色图。图8——内置生物人工肝细胞材料白蛋白免疫细胞化学染色图。
具体实施例方式猪骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系的建立从成年健康实验用小型猪髂骨抽取骨髓组织约5ml，移入离心管中吹打混勻，而后沿管壁按照1 :1体积比缓慢加入含采5ml淋巴细胞分离液的离心管中，采用离心机离心后小心吸取中间云雾状细胞层，用磷酸盐缓冲液洗涤，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基， 随后放置于37°C、5% CO2培养箱中培养。用单层细胞贴壁培养法弃去未贴壁细胞，胰蛋白酶消化传代培养，观察细胞生长情况。猪原代肝细胞的分离纯化采用两步胶原酶原位灌注法分离猪肝细胞。将健康猪麻醉成功后外周静脉全身肝素化，结扎门静脉和肝下下腔静脉远心端，近侧插管分别作为灌注流入道和流出道，阻断肝上下腔静脉，使用D-Hanks液灌注肝脏直到血色完全褪去，0. 05%胶原酶缓慢持续原位灌注肝脏，收集肝细胞悬液，台盼蓝拒染试验计算细胞活力> 95%者符合要求。细胞计数板计算细胞浓度。内置生物人工肝的制作每5 X IO6个肝细胞与2. 5 X IO6个骨髓间充质干细胞混合成单细胞悬液，将上述细胞悬于2%海藻酸钠溶液，微囊静电液滴发生器滴入到lOOmmol/L的CaCl2中，形成海藻酸钙珠；0. 05%多聚赖氨酸和0. 14%海藻酸钠分别包裹海藻酸钙珠，以形成微胶囊；再用 lmmol/L柠檬酸钠液化微胶囊核心。将上述制备的微囊，0. 9%氯化钠溶液洗涤2_5次后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，随后放置于37°C、5% CO2培养箱中培养，每3天换液。 当需要使用来治疗肝功能衰竭时，收集上述培养的微囊用0. 9%氯化钠溶液洗涤2-5次后植入受体腹腔内，即完成内置生物人工肝的制作。本发明 构建的猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝，其肝细胞形态与功能均较传统单纯肝细胞组建的生物人工肝有显著改善，下述多种检测结果足以表明完全符合治疗肝功能衰竭的要求一、骨髓间充质干细胞的鉴定(1)倒置显微镜观察200倍镜下观察发现贴壁细胞高度均一，外观呈梭形或纤维状，分布均勻，杂质细胞极少(见图1)。(2)流式细胞仪检测培养细胞胰酶消化，PBS洗涤3次，加入荧光标记的⑶29、 ⑶44、⑶45和⑶90抗体。室温下避光孵育15分钟，PBS洗去未标记抗体，应用FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。检测结果表明⑶29+CD45—、⑶44+^45—、⑶90+CD45—细胞比例均大于95%，证明细胞为非造血组织来源(见图2)。二、原代猪肝细胞的鉴定(1)倒置显微镜观察200倍镜下观察发现肝细胞贴壁良好，形态不规则，呈多角形，胞体变平伸展(见图3)。(2)台盼兰染色按照1 1体积比将肝细胞悬液与台盼兰染液混勻，100倍镜下计算胞核未蓝染的细胞比例大于95%。三、内置生物人工肝细胞材料的形态学检测(1)倒置显微镜观察200倍镜下观察发现肝细胞紧密黏附于骨髓间充质干细胞表面，几个至十几个肝细胞呈团聚性生长(见图4)。(2)扫描电镜观察3%戊二醛4°C固定过夜，依次置于30%、50%、70%、80%、 90%、95%、100%的乙醇溶液中脱水，扫描电镜下观察发现肝细胞形态完整，成团黏附于骨髓间充质干细胞表面，肝脏细胞间以及肝细胞与骨髓间充质干细胞间有大量细胞外基质存在(见图5)。(3)透射电镜观察3%戊二醛4°C固定过夜，PBS清洗2次。4°C避光条件下用
锇酸固定2小时，双蒸水冲洗。依次置于30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中脱水，包埋制作超薄切片，乙酸双铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜下观察发现内置生物人工肝细胞材料与单纯培养肝细胞相比较，细胞膜结构完整，胞内的线粒体和内质网极少萎缩或空泡化，细胞核清晰可见，异质细胞间见紧密连接形成(见图6)。四、内置生物人工肝细胞材料的功能学检测(1)糖原染色4%多聚甲醛固定20分钟，过碘酸氧化5分钟，蒸馏水漂洗3次， 希夫试剂处理15分钟，蒸馏水洗10分钟，苏木精染色1分钟，蒸馏水漂洗，常规脱水，中性树胶封片。结果显示内置生物人工肝细胞材料糖原染色呈强阳性，提示肝细胞合成糖原功能增强(见图7)。(2)白蛋白免疫细胞化学染色4%多聚甲醛固定20分钟，蒸馏水冲洗，3% H2O2室温孵育5分钟，一抗工作液37°C孵育1小时，PBS冲洗后二抗37°C孵育半小时，DAB显色，中性树胶封片。镜下观察发现肝细胞内白蛋白染色呈强阳性，提示该内置生物人工肝细胞材料合成白蛋白功能显著改善(见图8)。
综上所述，用 猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化构建的内置生物人工肝符合治疗肝功能衰竭的要求。
权利要求
1.猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法，其步骤在于(1)建立猪骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系从成年健康实验用小型猪髂骨抽取骨髓，制备单细胞悬浮液，密度梯度离心后收集单核细胞层，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，随后放置于37°C、5% CO2培养箱中培养；(2)两步胶原酶法原位灌注分离猪原代肝细胞将健康猪麻醉成功后外周静脉全身肝素化，结扎门静脉和肝下下腔静脉远心端，近侧插管分别作为灌注流入道和流出道，阻断肝上下腔静脉，使用D-Hanks液灌注肝脏直到血色完全褪去，0. 05%胶原酶缓慢持续原位灌注肝脏，收集肝细胞悬液，台盼蓝拒染试验计算细胞活力> 95% ；(3)藻酸盐-聚左旋赖氨酸制备微囊包被肝细胞和骨髓间充质干细胞肝细胞与骨髓间充质干细胞混合成单细胞悬液，将上述单细胞悬液悬于2%海藻酸钠溶液，微囊静电液滴发生器滴入到lOOmmol/L的CaCl2中，形成海藻酸钙珠；0. 05%多聚赖氨酸和0. 14%海藻酸钠分别包裹海藻酸钙珠，以形成微胶囊；再用lmmol/L柠檬酸钠液化微胶囊核心。
2.根据权利要求1中所述的猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法，其特征在于步骤(3)中控制截流量为小于110KD，微囊内细胞密度IO6个细胞/ml。
3.根据权利要求1中所述的猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法，其特征在于步骤(3)中肝细胞与骨髓间充质干细胞的比例为2 1。
全文摘要
本发明涉及一种猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法。本发明先建立猪骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系，再采用两步胶原酶法原位灌注分离猪原代肝细胞，然后藻酸盐-聚左旋赖氨酸制备微囊包被肝细胞和骨髓间充质干细胞。本发明克服了内置细胞通常无法长期存活，增殖能力极度有限，输注的肝细胞产生各种促肝再生刺激因子的功能也随之受到抑制等缺陷。本发明将骨髓间充质干细胞引入内置生物人工肝系统，通过异质细胞间相互作用，充分模拟肝细胞在体微环境，有效延长肝细胞的生存时间，促进肝细胞增殖分化，并保持肝细胞特有的生物学功能，从而显著改善内置生物人工肝治疗肝功能衰竭的治疗效果。
文档编号C12N5/071GK102218161SQ201010591170
公开日2011年10月19日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者丁义涛, 施晓雷, 顾劲扬 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院