专利名称：一种用于检测cyp2c19基因分型的pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒，特别涉及一种应用聚 合酶链式反应(PCR)方法检测影响临床常用药物代谢的细胞色素P450酶2C19基因的两个 位点的基因型，即CYP2C19 *1/ *2型(681G/A)与CYP2C19 *1/ *3型(636 G/A)的试剂盒， 属于生物医学领域中的临床分子检测技术。
背景技术：
细胞色素P450 (CytochromeP450，CYP450)是由一组结构和功能相关的超家族基 因(Superfamily gene)编码的同工酶，对于人类，其主要存在于肝细胞微粒体中。在CYP450 超家族中，CYP2是最大的家族，有15个亚家族(CYP2A到2Q)，它们代谢约20 %目前临床 使用的药物，其中CYP2A、CYP2C、CYP2D和CYP2E均具有遗传多态性和种族差异。人的肝脏 中CYP2C约占20%，现已克隆出CYP2C8、2C9/10、2C18和2C19。近年来CYP450的基因型与 不同个体的药物代谢酶活性的相关性的研究有很大进展，通过检测编码相关药物代谢酶的 基因型来判断不同个体对药物的代谢以及药效、不良反应情况，从而指导用药，达到个体化 医疗的目的。CYP2C19 (S-美芬妥英羟化酶)是CYP450的主要成分之一，代谢一系列临床上常 用药物，如美芬妥英、奥美拉唑、普奈洛尔、地西泮、去甲地西泮，舍曲林及氯吡格雷等，其活 性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而表现为血药浓度的个体差异。中国人常见 的两个CYP2C19等位基因多态性是CYP2C19*2/*2型和CYP2C19*3/*3型，分别为CYP2C19 基因的第5外显子G681A和第4外显子G636A的点突变。其中G681A点突变产生了一个异 常的拼接位点，使外显子5’端的前40bp碱基发生缺失，改变了随后的mRNA的阅读框，从而 使蛋白的合成过早终止，导致合成的酶缺乏血红素结合位点，使其失去活性。G636A点突变 使编码色氨酸的密码子突变为终止密码子，也导致了蛋白合成提前终止，使该蛋白因缺乏 血红素及底物结合区而无活性。这些点突变引起编码的酶的活性下降，代谢底物的能力减 弱，使血药浓度增高，从而引起与血药浓度相关的药物不良反应。研究表明，CYP2C19对药物代谢的能力随着等位基因的不同组合而呈现出一定 的规律性，表现为正常基因纯合子 > 正常基因与突变基因杂合子 > 突变基因纯合子或 杂合子，即通常所说的基因剂量效应。CYP2C19*1/*1野生纯合子代表的是强代谢者(EM， extensive metabolisers), CYP2C19*2/*2 或 CYP2C19*3/*3 突变纯合子代表的是弱代谢 者(PM，poor metabolisers)，CYP2C19*l/*2 或CYP2C19*l/*3 杂合子代表的是中间代谢者 (IM)，即杂合子强代谢者。CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3这两个点突变可以完全解释中国 人群弱代谢者(PM)。
奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂(PPI)之一，能抑制胃酸分泌，对H2受 体阻滞剂治疗无效的难治性溃疡也有突出疗效，其两条主要代谢途径为羟化代谢和S原子 氧化代谢。奥美拉唑羟化代谢受CYP2C19遗传基因调控。在CYP2C19 EM人群中，80%都是 由CYP2C19代谢，CYP3A介导的S原子氧化则是CYP2C19 PM人群中的主要代谢途径。奥美拉唑代谢存在显著的个体差异，CYP2C19的PM人群奥美拉唑的血药浓度高于EM人群的5倍左右，因而应用等量奥美拉唑的PM者疗效显著优于EM者。然而，值得注意的是，长期大 剂量使用PPI治疗会增加髋部骨折的危险，并且剂量越大，骨折危险性越高，这与质子泵抑制剂减少钙的吸收有关，因此根据CYP2C19基因型的多态性来选择最小有效剂量治疗有适 应证的患者有重要的临床意义。目前用于检测CYP2C19基因型的方法有很多种，常规是首先抽取人外周静脉血， 提取基因组DNA，扩增CYP2C19突变所在区域序列，然后进行DNA直接测序，从测序结果判断 相应位点的基因型，这种常规基因检测方法虽然可以达到检测的目的，但是直接测序的检 测周期长、操作步骤过于繁琐、不能及时得到结果报告；直接测序的成本较高，这给患者以 及医疗单位带来较大经济支出；另一种较为常见的检测方法为RFLP (限制性内切酶酶解片 段长度多态性)，这一方法具有简便、经济和可靠的特点，但其具有酶切位点局限性，并且难 以进行高通量平行分析；还有一种普通PCR技术，其采用一对普通引物和低保真聚合酶Taq 进行PCR扩增，得到的结果特异性不高，常常造成假阳性。上述三种方法都不能满足临床检 验科室进行CYP2C19基因型检测的要求。
发明内容
本发明提供一种应用高保真DNA聚合酶介导的聚合酶链式反应(PCR) CYP2C19基 因分型的PCR试剂盒，包含检测CYP2C19*l/*2型和CYP2C19*l/*3型，分别为CYP2C19基因 的第5外显子G681A和第4外显子G636A的点突变。目的是解决现有用PCR扩增方法检测 CYP2C19的基因型时价格昂贵、低效率、低通量以及假阳性高的问题。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种用于检测CYP2C19基因分型的 PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括检测基因CYP2C19*l/*2型(即681 G/A位点)的 两条正向引物以及一条反向引物，和/或检测基因CYP2C19*l/*3型(即636 G/A位点)的两 条反向引物以及一条正向引物
所述检测基因CYP2C19*l/*2型(即681 G/A位点)的两条正向引物以及一条反向引物 的碱基序列如下所示 正向引物
CYP2C19 681G:5， -TCCCACTATCATTGATTATTTCTCG-3‘； CYP2C19 681A:5， -TCCCACTATCATTGATTATTTCTCA-3‘； 反向引物
CYP2C19 681R:5，- TGAATCACAAATACGCAAGCAGTC-3，；
所述检测基因CYP2C19*l/*3型(即636 G/A位点)的两条反向引物以及一条正向引物 的碱基序列如下所示 反向引物
CYP2C19 636G:5’ -ACTTGGCCTTACCTGGATC-3’ ； CYP2C19 636A:5’ -ACTTGGCCTTACCTGGATT-3’ ； 正向引物
CYP2C19 636F:5’ -TAGCTTCACCCTGTGATCC-3’。上述技术方案中的有关内容解释如下1、上述方案中，所述正向引物的3’端-1与-2位碱基之间采用耐3’ 一 5’核酸外切酶 活性的修饰。2、上述方案中，所述耐3’ 一 5’核酸外切酶活性的修饰为硫代磷酸化修饰。3、上述方案中，所述反向引物的3’端-1与-2位碱基之间采用耐3’ 一 5’核酸外 切酶活性的修饰。4、上述方案中，所述耐3’ 一 5’核酸外切酶活性的修饰为硫代磷酸化修饰。5、上述方案中所述引物(primer)是PCR (聚合酶链式反应)技术中重要的组成 部分，它是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸 链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3' -0H上，核苷酸以二酯键形式进 行合成，因此引物的3' -0H必须是游离的。6、上述方案中，所述硫代磷酸化修饰是指在普通弓|物合成的基础上，3 ‘端两个单 核苷酸之间磷酸二酯键上的-0H被-SH所取代，从而达到耐核酸外切酶消化的效果。7、本发明工作原理是PCR (polymerase chain reaction)扩增是一种体外扩增 DNA片段的方法，即聚合酶链式反应方法。采用这种方法，在反应系统中只要有一个拷贝的 待扩增DNA片段，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段。该方法广泛应用 于基因检测。PCR扩增的基本原理是模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链聚合 反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA (待扩增DNA) —侧的互补序列退火复性、耐 热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。由于上 一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链，所以每循环一次，底物DNA 的拷贝数增加一倍，因此PCR经过n次循环后，理论上，待扩增的特异性DNA片段可达到2n 个拷贝数。Touchdown PCR，即降落PCR。是优化和改良后的一种PCR方法，指每一个(或n 个)循环降低1°C (或n°C)退火温度，直至达到一个较低的退火温度(touchdown退火温度)。 然后以此温度进行多个循环。正确和非正确退火温度1°C差异将造成PCR产物量4倍的差 异，如果相差n°C，就会产生4的n次方倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得 到大量的富集。退火温度起始在高于计算的Tm值15°C左右，再接下来的循环中，退火温度 以每次1-2°C逐渐降低，直到Tm值以下5°C，当达到特异的引物-模板结合的Tm值时，扩增 就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争 中胜出，成为主导的扩增产物避免非特异扩增产物的出现。此扩增方法有利于PCR产物的 纯化和假阳性的降低。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果
1、本发明的试剂盒采用特殊设计的引物，并且在其引物的3'端采用硫代磷酸化修饰， 其PCR产物特异性非常高。利用本发明的系列检测引物，在PCR结束并进行凝胶电泳后，可 通过直接观察产物的有无来快速判断CYP2C19的基因型，包含CYP2C19基因的第5外显子 G681A和第4外显子G636A的点突变的碱基类型。2、本发明的试剂盒采用特殊的“降落PCR”程序，大大减少了由于Tm值太低而导致 的引物与模板在错误位点的结合，从而提高了 PCR效率和灵敏度，为准确检测CYP2C19的基 因型提供了技术支持。3、本发明的试剂盒的核心成分(检测引物)价格低廉，而且在实验过程中不需测 序，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。
4、本发明的试剂盒和实时荧光定量PCR结合，可以实现高通量检测CYP2C19的基 因型。
附图1为采用试剂盒中的检测基因CYP2C19 *1/*2型(即681 G/A位点)的两条正 向引物以及一条反向引物检测三个人类基因组DNA样品得到的琼脂糖凝胶电泳图。附图2为附图1中所示的样品1 (左侧)的DNA测序图。附图3为附图1中所示的样品2 (中间)的DNA测序图。附图4为附图1中所示的样品3 (右侧)的DNA测序图。附图5为采用试剂盒中的检测基因CYP2C19 *1/*3型(即636 G/A位点)的两条反 向引物以及一条正向引物检测两个人类基因组DNA样品得到的琼脂糖凝胶电泳图。附图6为附图5中所示的样品4 (左侧)的DNA测序图。附图7为附图5中所示的样品5 (右侧)的DNA测序图。附图8为PCR温度循环条件。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例一一种用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒
一种用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒包含
10XPCR Buffer ；
dNTP (2. 5mM)；
Pfu DNA 聚合酶(2. 5U/ ii 1)；
引物(各10mM)；
检测基因CYP2C19 *1/*2型(即681 G/A位点)的两条正向引物以及一条反向引物的碱 基序列如下所示 正向引物
CYP2C19 681G: 5' - TCCCACTATCATTGATTATTTCTCG - 3'； CYP2C19 681A: 5' - TCCCACTATCATTGATTATTTCTCA - 3'； 反向引物
CYP2C19 681R: 5' - TGAATCACAAATACGCAAGCAGTC - 3'； 上述正向引物的3’端-1，-2位碱基之间硫代磷酸化修饰。检测基因CYP2C19 *1/*3型(即636 G/A位点)的两条反向引物以及一条正向引物 如下所示
反向引物
CYP2C19 636G: 5' - ACTTGGCCTTACCTGGATC - 3'； CYP2C19 636A: 5， - ACTTGGCCTTACCTGGATT - 3，； 正向引物
CYP2C19 636F: 5' - TAGCTTCACCCTGTGATCC - 3'； 上述反向引物的3’端-1，-2位碱基之间硫代磷酸化修饰。
采用该试剂盒进行实验包括下列步骤 第一步准备DNA
(1)、从待检测者抽取血液样本，得到样品1 5。(2)、从血液样本中获取DNA，我们采用上海生工生产的UNIQ-10试剂盒进行提取。从待检测者的血样中获取DNA过程
a.取 500ul 已加入 ACD (0. 48%Citric Acid (柠檬酸)；1. 32%SodiumCitrate (柠檬酸 钠)；1.47%Glucose (葡萄糖))抗凝剂的血样。b. 500ul血样中加入1ml无菌水，5000转/分，离心两分钟去上清，用200ul TE
将白细胞悬浮起来。c.在b步骤制备的200ul样品中，加入200ul Digestion Buffer混勻，再加入 20ul 的 Proteinase K (蛋白酶 K) (10mg/ml)，混勻，55°C保存 30 分钟。d.加入 200ul BD Buffer，70°C 孵育 10 分钟。e.加入200ul无水乙醇，混勻，然后用1-ml Tip头将样品全部转移到UNIQ-10柱， 柱子放入 2.0-ml Collection Tube。f.用台式离心机，10000转/分，室温离心1分钟。g.取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根 Collection Tube 中，加入 500ul Pff Solution，10000 转 / 分，室温离心 1 分钟。h. 取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根 Collection Tube 中，加入 500ul Wash Solution, 10000 转 / 分，室温离心 1 分钟。i.取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的全部废液。将柱子放回同一根 Collection Tube中，10000转/分，室温离心1分钟以除去残留的Wash Solution。j.将柱子放入新的无菌的1.5ml离心管中，在柱子中央加入50ul 60度预热的 Elution Buffer，室温放置5分钟。k. 10000转/分，室温离心1分钟，离心管中的液体即为血液中基因组DNA。第二步对DNA进行扩增
PCR扩增进行两次，分别采用检测基因CYP2C19 *1/*2型(即681 G/A位点)和/或 CYP2C19 *1/*3型(S卩636 G/A位点)的引物，PCR扩增的程序相同 采用40ng/50ul的反应体系，具体操作为
1、将上述一系列检测引物分别与获取的六个样品的基因组DNA、4种脱氧核糖核苷酸、 PCR反应缓冲液、高保真Pfu DNA聚合酶、去离子水按一定比例混合构成单独的反应体系， 具体见下表
权利要求
一种用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括检测基因CYP2C19*1/*2型的两条正向引物以及一条反向引物，和/或检测基因CYP2C19*1/*3型的两条反向引物以及一条正向引物所述检测基因CYP2C19*1/*2型的两条正向引物以及一条反向引物的碱基序列如下所示正向引物5’ TCCCACTATCATTGATTATTTCTCG 3’；5’ TCCCACTATCATTGATTATTTCTCA 3’；反向引物5’–TGAATCACAAATACGCAAGCAGTC 3’；所述检测基因CYP2C19*1/*3型的两条反向引物以及一条正向引物的碱基序列如下所示反向引物5’ ACTTGGCCTTACCTGGATC 3’；5’ ACTTGGCCTTACCTGGATT 3’；正向引物5’ TAGCTTCACCCTGTGATCC 3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒，其特征在于所 述正向引物的3’端-1与-2位碱基之间采用耐3’ 一 5’核酸外切酶活性的修饰。
3.根据权利要求2所述的用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒，其特征在于所 述耐3’ 一 5’核酸外切酶活性的修饰为硫代磷酸化修饰。
4.根据权利要求1所述的用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒，其特征在于所 述反向引物的3’端-1与-2位碱基之间采用耐3’ 一 5’核酸外切酶活性的修饰。
5.根据权利要求4所述的用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂盒，其特征在于所 述耐3’ 一 5’核酸外切酶活性的修饰为硫代磷酸化修饰。
全文摘要
一种用于CYP2C19基因分型的PCR试剂盒，采用一系列经修饰的检测引物以及高保真DNA聚合酶介导的聚合酶链式反应，检测基因CYP2C19*1/*2型(即681G/A位点)和/或CYP2C19*1/*3型(即636G/A位点)。本发明的试剂盒，可以实现低成本、高效率、高通量检测CYP2C19基因中影响其编码的药物代谢酶活性的两个位点的碱基类型。这两个位点的突变可以解释中国人群相关药物的弱代谢者，本发明的试剂盒的检测结果可以用于指导个体化用药。
文档编号C12Q1/68GK101988128SQ201010591109
公开日2011年3月23日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者何晓辉, 杨舒婷, 王进, 秦正红 申请人:苏州大学;苏州旷远生物分子技术有限公司