专利名称：一种抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及抗葡萄糖醛酸苷酶抗体，尤其涉及一种抗葡萄糖醛酸苷酶兔 单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
^AS基因是从细菌中获得的一类报告基因，能编码葡萄糖醛酸苷酶，该酶在组织化 学染色中水解底物5-溴-4氯-3吲哚-葡萄糖醛酸苷，其水解产物呈蓝色。植株组织中不 存在内源gus活性，用gus组织化学检测法检测转化愈伤组织或者再生植物切片，若呈现 蓝色，就可以初步判断gM基因已转入到植株细胞并表达葡萄糖醛酸苷酶。gM基因就是
葡萄糖醛酸苷酶基因，即3-guSo通过组织染色法只能初步判断gM基因是否已经转 入到植株组织中基因中，因此这种方法对gM基因的判断会存在很大的误差，且其他干扰 性较大。基因抗体与抗原之间特异性结合的免疫技术具有极高的灵敏度，当组织所表达出 的葡萄糖醛酸苷酶极其微量时也能对其进行检测，且其他因素干扰性较小。因此开发 能够与葡萄糖醛酸苷酶特异性结合的单克隆抗体具有极大的意义。兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔比鼠能识别更多免 疫抗原的表位抗原决定簇。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的细胞融合实验，使得高 通量筛选阳性融合细胞成为可能。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗葡萄糖醛酸苷酶的兔单克 隆抗体的制备方法。抗A -葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法，的步骤如下
1)兔子免疫
将40(Γ600μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化 后，采用背部皮下3飞点注射2 3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别 用15(T250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；
2)细胞融合
选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8 10天后取无菌 脾脏，制备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对 数生长期的骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为48% 52%的聚乙二醇为融合剂，体积 百分比为189Γ22%的HAT作为选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为 0. 8 X 10_6 1. 2Χ lO—mol/L的次黄嘌呤，A是浓度为3. 5X10^4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤， T是浓度为1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)杂交瘤细胞的筛选
细胞融合后第圹12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进 行预筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15 19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周； 第2216天通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3飞株生长状态 最好且表达特异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存， 经重组获得的细胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养， Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。本发明制备的抗葡萄糖醛酸苷酶兔单克隆抗体可用于ELISA、Western Blotting等免疫学手段对β -葡萄糖醛酸苷酶的定性或定量研究。具体的实施方式 实施例1
1)兔子免疫
将400μβ的免疫抗原葡萄糖醛酸苷酶与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化 后，采用背部皮下3点注射2只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用 15(T250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；
2)细胞融合
选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8天后取无菌脾脏，制备 单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的骨 髓瘤细胞相融合，质量百分比为48%的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为18%的HAT作为选 择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为0. 8X 10_6mOl/L的次黄嘌呤，A是浓度 为3. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1. 4X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)杂交瘤细胞的筛选
细胞融合后第8天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预 筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是 阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周；第22天 通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3株生长状态最好且表达特 异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存，经重组获得的细 胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。经分析测定，该方法制备的单克隆抗体的免疫学类型为IgG，该方法制备的单克隆 抗体对葡萄糖醛酸苷酶的亲和常数为2. 07 X IO9M-1,其分子量为150KDa。实施例2
1)兔子免疫
将600μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采 用背部皮下6点注射3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用250mg 的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；
2)细胞融合
选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，10天后取无菌脾脏，制 备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的 骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为52%的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为2 的HAT作为 选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为1. 2 X 10_6mOl/L的次黄嘌呤，A是浓度为4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷； 3)杂交瘤细胞的筛选
细胞融合后第12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预 筛，确定是否需要更换细胞培养液；第19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是 阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周；第26天 通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定5株生长状态最好且表达特 异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存，经重组获得的细 胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。经分析测定，该方法制备的单克隆抗体的免疫学类型为IgG，该方法制备的单克隆 抗体对葡萄糖醛酸苷酶的亲和常数为2. 25 X IO9M-1,其分子量为150KDa。实施例3
1)兔子免疫
将500μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采 用背部皮下5点注射3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用200mg 的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；
2)细胞融合
选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，10天后取无菌脾脏，制 备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的 骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为50%的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为20%的HAT作为 选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为1. OX 10_6mOl/L的次黄嘌呤，A是浓 度为4. OX 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1. 6X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)杂交瘤细胞的筛选
细胞融合后第10天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预 筛，确定是否需要更换细胞培养液；第17天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是 阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周；第M天 通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3株生长状态最好且表达特 异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存，经重组获得的细 胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。经分析测定，该方法制备的单克隆抗体的免疫学类型为IgG，该方法制备的单克隆 抗体对葡萄糖醛酸苷酶的亲和常数为2. 13 X IO9Mi其分子量为150KDa。
权利要求
1. 一种抗葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于它的步骤如下1)兔子免疫将45(Γ600μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全 乳化后，采用背部皮下3飞点注射2 3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周， 分别用15(T250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；2)细胞融合选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8 10天后取无菌 脾脏，制备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对 数生长期的骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为48% 52%的聚乙二醇为融合剂，体积 百分比为189Γ22%的HAT作为选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为 0. 8 X 10_6 1. 2Χ lO—mol/L的次黄嘌呤，A是浓度为3. 5X10^4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤， T是浓度为1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；3)杂交瘤细胞的筛选细胞融合后第圹12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进 行预筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15 19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初 步确定是阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周； 第2216天通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3飞株生长状态 最好且表达特异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存， 经重组获得的细胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养， Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法。它包括高纯度β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白作为免疫抗原免疫兔子、多抗血清效价的测定、兔子B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合、以选择性培养基进行选择性培养，经预筛、初筛、复筛过程选择阳性克隆子并大量扩增，构建重组载体并体外培养，分离并纯化获得单克隆抗体，本发明可用于ELISA，WesternBlotting等免疫学手段对β-葡萄糖醛酸苷酶的定性或定量检测。
文档编号C12N5/16GK102120769SQ20101060112
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者倪庚, 冯劲松, 刘娜, 沈金儿, 郑晓冬, 陆蕾 申请人:浙江大学