专利名称：胃癌发病风险评估试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，具体地，本实用新型涉及胃癌发病风险评估试剂盒。
背景技术：
与癌症发生密切相关的三大因素中，遗传因素占10% 15%。人的出生不能选 择，个体的基因一般不会改变，体内携带的家族或种族聚性癌症易感基因也不会随岁月而 脱离。现在医学已经发展到了基因时代，检测人体细胞基因信息成为现实。因此开展易感 人群基因多态性分析，可为这类人群的个体进行个性化预防，大大减少癌症发生。随着物质生活的快速改善，人们生活方式也随着发生了变化，由此引起致癌因素 升至60% 67%。如由不良生活行为引起的肥胖是多种癌症的诱发因素，可使结肠癌、乳 腺癌等癌症发生几率大大增加。癌症特别“偏爱”那些生活方式不良的富人。因此倡导适 量脂肪饮食、戒烟、适量饮酒、戒除不良个人卫生习惯、适量运动量，远离癌症。环境、水、食品污染因素占癌症发生的4% _6%。因此，预防性基因检测，改变不良 生活方式和饮食习惯，食用绿色食品保持均衡营养摄入，选择舒适卫生的居住环境，保持健 康心态，这样可将癌症拒之千里，保持健康。在人类的基因组中，有很多基因与胃癌的发生有着密切的关系，这些基因的突变 可能直接影响胃癌发生的几率。以rsl801133位点为例说明胃癌与遗传的关系。rsl801133 是MTHFR基因的一个突变位点，该基因编码的亚甲基四氢叶酸还原酶是叶酸代谢的关键 酶，在胃的癌变过程中起重要作用。因此利用这些与胃癌相关的基因，可以判断一个人胃癌 发病的风险有多大。个人基因信息服务是一个崭新的行业，随着人类基因组计划的完成和人类基因组 密码的逐渐破译，开始在美国兴起，因此，可以通过个人基因服务，提供成熟的评估肿瘤发 病风险的试剂盒。
发明内容本实用新型的发明人为了使基因组学、基因技术更方便、快捷地应用于日常生活 提出并完成了本实用新型。本实用新型的目的是提供胃癌发病风险评估试剂盒。根据本实用新型的胃癌发病风险评估试剂盒包括1)DNA 提取卡；2)胃癌相关基因分析试剂盒；3)胃癌发病风险评估卡。根据本实用新型的试剂盒，其中，所述胃癌相关基因分析试剂盒包括以下胃癌相 关基因的分析引物基因rsl801133，其碱基序列如SEQ ID No. 1所示[0015]tcatgagcccagccactcactgttttagttcaggctgtgctgtgctgttggaaggtgcaa60[0016]gatcagagcccccaaagcagaggactctctctgcccagtccctgtggtctcttcatccct120[0017]cgccttgaacaggtggaggccagcctctcctgactgtcatccctattggcaggttacccc180[0018]aaaggccaccccgaagcagggagctttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtg240[0019]tctgcgggagycgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacacattcttccgc300[0020]tttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatcacttgccccatcgtccccgggatctttccc360[0021]atccaggtgaggggcccaggagagcccataagctccctccaccccactctcaccgcaccg420[0022]tcctcgcacaggctgggggctctgggtggagtgctgagttcgctgagttcttcccagatc480[0023]tcctctcaggtccagaacttg501[0024]rs2294008,其碱基序列如SEQ ID No.2所示[0025]gtttcagccctcagcccggggtggctgagatatggccctgggtaggctctgtcctccaga60[0026]ggtggaaagaaggacaaagggagagggaggtgcaggtcgctcagggaggagactcggacc120[0027]tgcccagccccggggccctcactggctccaggaaacccgctggtgttgactgtgggcagt180[0028]ccagcctctccccatttgaggccatataaagtcacctgaggccctctccaccacagccca240[0029]ccagtgaccaygaaggctgtgctgcttgccctgttgatggcaggcttggccctgcagcca300[0030]ggtgaggccttggctggcccccagcagggaagggagcaggggtgagccggggaggccaga360[0031]gggatacctgcagggcacacggagaggaggggaaggaaggaggaagggagaggaaggggg420[0032]tgaggctcttgccctagcctccgctcctccagggaagctcttggcacgaccaggcagcga480[0033]cctgttccctgccgtcccctg501根据本实用新型的试剂盒，其中，所述各胃癌相关基因的分析引物如下表所示，
基因引物和探针序列(5’ -3’)rsl801133上游引物GGCTGACCTGAAGCACTTGAA 下游引物AAAGAAAAGCTGCGTGATGATG野生型探针TCTGCGGGAGTCG 突变性探针CTGCGGGAGCCGArs2294008上游引物CTCCCCATTTGAGGCCATATAA 下游引物CCAAGCCTGCCATCAACAG 野生型探针CACCAGTGACCATGAA 突变性探针CACCAGTGACCACGAA本实用新型的试剂盒能够快速评估个体胃癌发病风险，本实用新型的试剂盒使用 方便、快捷，成本低，且环保。
图1为据本实用新型的试剂盒的结构图，1 盒体；2 :DNA提取卡；3 胃癌相关基因 分析试剂盒；4 胃癌发病风险评估卡；5 拭子。
具体实施方式
实施例1随机选取8名中国汉族人作为检测对象，其中男性4人，女性4人；年龄12-65岁， 应用本实用新型试剂盒进行检测。1、利用DNA提取卡采集检测标本如图1所示，按说明用DNA提取卡2采集标本，采集完毕，放入标本采集袋中密封， 保证样本不会污染。采用试剂提取标本基因组DNA。按比例混合PCR预混液、Taq酶、引物\探针和标本DNA模板，进行检测。1)组装8个标本DNA提取卡，每个DNA提取卡包括，检测袋(盒)、条形码(3个)、 标本采集说明书\知情同意书、标本采集袋、口腔拭子(2个)、标本保存管(2个)；2)采集口腔粘膜标本；3)应用商用试剂盒提取口腔拭子标本基因组DNA。2、利用胃癌相关基因分析试剂盒分析样本基因型1)确定候选基因从数据库筛选与胃癌发病相关的基因及单核苷酸多态性(SNP)位点，rsl801133, rs2294008。2)设计特异性的探针和引物 从数据库获取上述2个基因的序列，应用生物信息软件分析技术，针对每个SNP位 点分别设计上游引物、下游引物和野生型探针以及突变型的Taqman-MGB探针，见表1。表1. SNP位点检测的特异性探针和引物序列
基因引物和探针序列(5’ -3’)rsl801133上游引物GGCTGACCTGAAGCACTTGAA 下游引物AAAGAAAAGCTGCGTGATGATG 野生型探针TCTGCGGGAGTCG 突变性探针CTGCGGGAGCCGArs2294008上游引物CTCCCCATTTGAGGCCATATAA 下游引物CCAAGCCTGCCATCAACAG 野生型探针CACCAGTGACCATGAA 突变性探针CACCAGTGACCACGAA3)合成探针和引物按表1中列出的序列合成探针和引物，其中探针的5'端带有VIC标记，3'端带有 NFQ标记，并加MGB修饰。4) Real-time PCR 扩增使用Real-time PCR试剂盒分析基因型，每人份PCR反应体系(50uL)包括，正、反 向引物(10pmol/uL)各 l.Oul ；荧光探针(15pmol/uL) 1. 5ul ；dNTPS(lOmM) 1. Oul ； 10XPCR 反应缓冲液 5uL ；MgCL2(10mM) 10uL ；ddH20 23. OuL ；DNA 模板 5uL ；Taq 酶(lU/uL)2ul ；UNG 酶(1U/uL)0. 5uL。每份样本分为两份检测。一份含有野生型引物的反应液，另一份含有突变型引物反应液，分别在两管中加入5uL样本DNA模板，混勻、离心，然后在ABI7300型荧光PCR仪进 行检测，反应参数如下PCR反应参数设置预变性95°C，10分钟；变性92°C，15秒；延伸/退火59°C，90秒。5)基因型判读[0061]应用基因分型分析软件，根据设定的荧光阈值判断基因型[0062]当样本检测图谱显示[0063]l)rsl801133[0064]有效的扩增曲线的荧光信号为C，则样本为纯合野生型CC[0065]有效的扩增曲线的荧光信号为T，则样本为纯合突变型TT[0066]有效的扩增曲线的荧光信号为C、T，则样本为杂合型CT，[0067]2)rs2294008[0068]有效的扩增曲线的荧光信号为C，则样本为纯合野生型CC[0069]有效的扩增曲线的荧光信号为T，则样本为纯合突变型TT[0070]有效的扩增曲线的荧光信号为C、T，则样本为杂合型CT。[0071]3、利用胃癌发病风险评估卡对结果进行分析[0072]8个样本的基因型分析结果如下[0073]l)rsl801133[0074]样本1基因型CT；表型患胃癌风险0.955 ；[0075]样本2基因型CC；表型患胃癌风险0.82 ；[0076]样本3基因型CC；表型患胃癌风险0.82 ；[0077]样本4基因型CT；表型患胃癌风险0.955 ；[0078]样本5基因型CT；表型患胃癌风险0.955 ；[0079]样本6基因型TT；表型患胃癌风险1.24 ；[0080]样本7基因型TT；表型患胃癌风险1.24 ；[0081]样本8基因型CT；表型患胃癌风险0.955 ；[0082]2)rs2294008[0083]样本1基因型CC；表型患胃癌风险0.75 ；[0084]样本2基因型CT；表型患胃癌风险1.22 ；[0085]样本3基因型CC；表型患胃癌风险0.75 ；[0086]样本4基因型CC；表型患胃癌风险0.75 ；[0087]样本5基因型CT；表型患胃癌风险1.22 ；[0088]样本6基因型CT；表型患胃癌风险1.22 ；[0089]样本7基因型CC；表型患胃癌风险0.75 ；[0090]样本8基因型CT；表型患胃癌风险1.22 ；[0091]使用胃癌发病风险评估卡分析。[0092]样本1的基因分析结果如下[0093]rsl801133基因型CT，患胃癌风险0.955 ；rs2294008基因型CC，患胃癌风险0. 75，综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高0. 72倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1. 37%。样本2的基因分析结果如下rsl801133基因型CC，患胃癌风险0. 82 ；rs2294008基因型CT，患胃癌风险1. 22 ；综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高1倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1.9%。样本3的基因分析结果如下rsl801133基因型CC，患胃癌风险0. 82 ；rs2294008基因型CC，患胃癌风险0. 75，综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高0. 62倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1. 18%。样本4的基因分析结果如下rsl801133基因型CT，患胃癌风险0.955 ；rs2294008基因型CC，患胃癌风险0. 75，综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高0. 72倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1. 37%。样本5的基因分析结果如下rsl801133基因型CT，患胃癌风险0.955 ；rs2294008基因型CT，患胃癌风险1. 22 ；综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高1. 17倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险2. 23%。样本6的基因分析结果如下rsl801133基因型TT，患胃癌风险1. 24 ；rs2294008基因型CT，患胃癌风险1. 22 ；综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高1.52倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险2. 89%。样本7的基因分析结果如下rsl801133基因型TT，患胃癌风险1. 24 ；rs2294008基因型CC，患胃癌风险0. 75，综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高0.93倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1. 77%。样本8的基因分析结果如下rsl801133基因型CT，患胃癌风险0.955 ；rs2294008基因型CT，患胃癌风险1. 22 ；综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高1. 17倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险2. 23%。[0124]实施例2随机选取5名欧美白人作为检测对象，其中男性3人，女性2人；年龄8-62岁，应 用本实用新型试剂盒进行检测。1、利用DNA提取卡采集检测标本1)组装5个标本DNA提取卡，每个DNA提取卡包括，检测袋(盒)、条形码(3个)、 标本采集说明书\知情同意书、标本采集袋、口腔拭子(2个)、标本保存管(2个)；2)按标本采集说明书的指示，采集口腔粘膜标本；3)应用商用试剂盒提取口腔拭子标本基因组DNA。2、利用胃癌相关基因分析试剂盒分析样本基因型1)确定候选基因从数据库筛选与胃癌发病相关的基因及单核苷酸多态性(SNP)位点，rsl801133, rs2294008。2)设计特异性的探针和引物同实施例1。3)合成探针和引物同实施例1。4) Real-time PCR 扩增同实施例1。5)基因型判读应用基因分型分析软件，根据设定的荧光阈值判断基因型样本检测图谱显示l)rsl801133有效的扩增曲线的荧光信号为C，则样本为纯合野生型CC ；有效的扩增曲线的荧光信号为T，则样本为纯合突变型TT ；有效的扩增曲线的荧光信号为C、T，则样本为杂合型CT，2)rs2294008有效的扩增曲线的荧光信号为C，则样本为纯合野生型CC ；有效的扩增曲线的荧光信号为T，则样本为纯合突变型TT ；有效的扩增曲线的荧光信号为C、T，则样本为杂合型CT。3、利用胃癌发病风险评估卡对结果进行分析5个样本的基因分析结果如下l)rsl801133样本1 基因型CT ；表型患胃癌风险0.955 ；样本2 基因型CC ；表型患胃癌风险0.82 ；样本3 基因型CC ；表型患胃癌风险0.82 ；样本4 基因型CT ；表型患胃癌风险0.955 ；样本5 基因型CC ；表型患胃癌风险0.82，2)rs2294008样本1 基因型CC;表型患胃癌风险0.75 ；[0160]样本2 基因型CT ；表型患胃癌风险1. 22 ；样本3 基因型CC;表型患胃癌风险0.75 ；样本4 基因型CT ；表型患胃癌风险1. 22 ；样本5 基因型CT ；表型患胃癌风险1. 22 ；使用胃癌发病风险评估卡分析样本1的基因分析结果如下rsl801133基因型CT，患胃癌风险0.955 ；rs2294008基因型CC，患胃癌风险0. 75，综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高0.72倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1. 37%。样本2的基因分析结果如下rsl801133基因型CC，患胃癌风险0. 82 ；rs2294008基因型CT，患胃癌风险1. 22 ；综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高1倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1.9%。样本3的基因分析结果如下rsl801133基因型CC，患胃癌风险0. 82 ；rs2294008基因型CC，患胃癌风险0. 75，综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高0.62倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1. 18%。样本4的基因分析结果如下rsl801133基因型CT，患胃癌风险0.955 ；rs2294008基因型CT,患胃癌风险1. 22 ；综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高1. 17倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险2. 23%。样本5的基因分析结果如下rsl801133基因型CC，患胃癌风险0. 82 ；rs2294008基因型CT，患胃癌风险1. 22 ；综合基因型结果，比普通人患胃癌的风险高1倍。根据人群的胃癌平均风险 1.9%，一生中患胃癌的风险1.9%。
权利要求1.胃癌发病风险评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)DNA提取卡；2)胃癌相关基因分析试剂盒；3)胃癌发病风险评估卡。
专利摘要本实用新型涉及生物技术领域，具体地，本实用新型涉及胃癌发病风险评估试剂盒。本实用新型的人体健康指标判断试剂盒包括1)DNA提取卡；2)胃癌相关基因分析试剂盒；3)胃癌发病风险评估卡。本实用新型的试剂盒能够快速评估个体胃癌发病风险，本实用新型的试剂盒使用方便、快捷，成本低，且环保。
文档编号C12Q1/68GK201785399SQ201020223009
公开日2011年4月6日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者周慧君, 苏莉 申请人:益基宏(北京)生物科技有限公司