专利名称：双并四氢呋喃类木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶及编码该酶的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自连翘(> > ￥ 3々)的双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶(7 α 7，>型彡V f > 4位々^ 二一 7転移酵素)、编码该酶的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体以及使用该载体得到的转化体等。
背景技术：
木脂体作为植物次级代谢产物中的一种在植物界中广泛分布(非专利文献1 Umezawa, T. (2003) Phytochem. Rev. 2，371-390)，其中具有有用的生物活性的木脂体已被用作药品或健康食品。例如，已知在胡麻科(pedaliaceae)芝麻(sesamum indicum)中含有的主要的双并四氢呋喃型木脂体具有抗氧化性、改善脂质代谢、保护肝功能等功效，并且已在市售(非专利文献 2 :Nakai，M. et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51，1666-1670 ；非专利文献 3 =Tsuruoka, T. et al. (2005) Biosci. Biotech. Biochem. 69，179—188 ；非专利文献 4 Sirato-Yasumoto，S. et al. (2001) J. Agri. Food Chem. 49，2647—2651)。另一方面，在小檗科盾叶鬼臼(美洲八角莲)的根中含有的作为芳基四氢萘内酯型(7 U > y卜，u >，々 卜 >型)的抗肿瘤性木脂体的鬼白毒素，因为其具有细胞分裂抑制活性，所以已被用作治癌剂及用于新型治癌剂的开发(非专利文献5 :AyreS，D.C.和Loike，J.D. (1990) Lignans Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K.)。此外，认为大多数木脂体在摄取后，在体内代谢为具有类似雌性荷尔蒙活性的肠内酯，因此木脂体成为近年来引起关注的次级代谢产物(非专利文献6:Heinonen，S. et al. (2001) J. Agric. Food Chem. 49，3178-3186)。木犀科(oleaceae)连翘(连翘属(forsythia))是多年生木本植物，因其顽强而易于栽培，因开鲜艳的黄花故多被用作庭院灌木。另一方面，已知在连翘的叶子、种子以及花瓣中蓄积了丰富的具有抗氧化或抗炎症活性的木脂体类，在亚洲(特别是中国和日本)将其叶子作为茶饮用。(非专利文献7 :Guo，H. et al. (2007) Rapid Communications in Mass Spectrometry 21，715—729 ；非专利文献 8 :Chang，M-J. et al. (2008) Biosci. Biotech. Biochem. 72，2750_2755)。与芝麻或亚麻等一年生草本植物不同，连翘不需要每年播种及育苗，可数年连续从叶子中获取功能性木脂体，因此认为连翘是有用的次级代谢产物的分子育种目标。在木犀科连翘中木脂体的生物合成，通过由结构式(I’)(参照图IA ；以下其它结构式也相同)的单木质醇进行氧化聚合生成结构式(Ia)的双并四氢呋喃型木脂体而开始(非专利文献 9 =Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2，257-288 ；非专利文献 10:Suzuki，S. and Umezawa, Τ. (2007) J. Wood. Sci. 53, 273-284) 结构式(Ia)的木脂体，经过结构式(IV)及结构式(V)的木脂体(非专利文献11 =Dinkova-Kostova, A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271,29473-29482 ；非专利文献 12 =Nakatsubo, T. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283，15550-1557 ；非专利文献 13 :Min，Τ. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278，50714-50723 ；非专利文献 14 :Gang, D. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274，7516-7527)，转化为结构式(VI)的木脂体(非专利文献15 :Xia，Z-Q. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 12614-12623 ；非专利文献 16 =Youn, B. et al (2005) J. Biol. Chem. 280，12917-12926)。其后在转化为结构式(VII)的木脂体糖苷之前，需要进一步经过多个酶反应。这些在连翘中的一系列木脂体生物合成体系中，仅确认出几种酶活性，目前仍未分离出负责各反应的催化酶、或编码这些酶的基因。虽然在连翘中含有的所有木脂体均以糖苷的形式稳定存在， 但仅检测出向结构式(VII)的木脂体的7位转移糖的活性(非专利文献17 =Berim, A. et al. (2008)Phytochemistry 69，374-381)，还未鉴定出其它的木脂体糖基转移酶。另一方面，在芝麻中虽然大部分木脂体也以糖苷的形式存在，但仅鉴定出对于结构式(III)表示的木脂体的糖基转移酶UGT71A9。该酶对结构式(III)的化合物的2位以外的位置或对其它木脂体化合物无活性。对于除此之外的木脂体的糖基转移酶仍然不明确(非专利文献 18 :0no, Ε. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103，10116-10121 ；非专利文献 19 Noguchi，Α.，et al. (2008)Plant J. 54，415-427)。通常情况下，植物中的糖基转移酶的位置选择性高，在相同或类似化合物的相同位置进行反应的糖基转移酶之间的氨基酸序列在不同的种间保守，因此，可利用序列的同源性分离该酶。但是，即使为相同的或类似的化合物，在不同位置添加糖的糖基转移酶的氨基酸序列的同源性低，极难于以在其它位置反应的糖基转移酶的序列信息为基础分离该酶。因此，即使是相同的木脂体化合物，也极难于以在上述结构式(III)化合物的2位添加糖的来自芝麻的UGT71A9的信息为基础，类推在其它木脂体化合物、例如结构式(Ia)等的双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4'位上添加糖的糖基转移酶的结构并将其分离。现有技术文献非专利文献非专利文献 1 =Umezawa, T. (2003) Phytochem. Rev. 2，371-390 ；非专利文献2 =Nakai, M. et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51，1666-1670 ；非专禾Ij 文献 3 :Tsuruoka，T. et al. (2005)Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188 ；非专禾Ij 文献 4 :Sirato-Yasumoto，S. et al. (2001) J. Agri. Food Chem. 49, 2647-2651 ；非专利文献5 :Ayres,D. C. and Loike, J. D. (1990) Lignans =Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U. K.；非专利文献6 =Heinonen, S. et al. (2001) J. Agric. Food Chem. 49，3178-3186 ；非专禾Ij 文献 7:Guo，H. et al. (2007)Rapid Communications in Mass Spectrometry 21,715-729 ；非专禾Ij 文献 8 :Chang，M-J. et al. (2008)Biosci. Biotech. Biochem. 72, 2750-2755 ；非专利文献 9 =Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2，257-288 ；非专利文献10 =Suzuki, S. and Umezawa, Τ. (2007) J. Wood. Sci. 53，273-284 ；非专禾Ij文献 11 :Dinkova-Kostova，A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 29473-29482 ；
非专利文献12 =Nakatsubo, T. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283，15550-1557 ；非专利文献13 :Min, Τ. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278，50714-50723 ；非专利文献14 :Gang，D. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274，7516-7527 ；非专利文献15 :Xia, Z-Q. et al (2001) J. Biol. Chem. 276，12614-12623 ；非专利文献16 =Youn, B. et al (2005) J. Biol. Chem. 280，12917-12926 ；非专利文献17 =Berim, A. et al. (2008) Phytochemistry 69，374-381 ；非专禾Ij文献 18:0no，E.et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103， 10116-10121 ；非专利文献19 =Noguchi, Α.，et al. (2008) Plant J. 54，415-427 ；
发明内容
本发明要解决的技术问题在这种状况下，期望分离并鉴定出在双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4'位上添加糖的糖基转移酶。解决技术问题的技术手段本发明是考虑到上述状况而做出的发明，提供以下所示的多核苷酸(编码双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶的多核苷酸)、蛋白质(双并四氢呋喃型木脂体 4位特异性葡萄糖基转移酶)、含有该多核苷酸的载体以及导入了该载体的转化体等。(1) 一种多核苷酸，其特征在于，为以下(a) (f)中任一项所述的多核苷酸(a) 一种多核苷酸，其含有由序列号3或5表示的碱基序列组成的多核苷酸；(b) —种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；(c) 一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列中1 15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(d) 一种多核苷酸，其含有编码具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(e) 一种多核苷酸，其含有与序列号3或5表示的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或者(f) —种多核苷酸，其含有与编码序列号4或6表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。(2)根据上述⑴所述的多核苷酸，其特征在于，为以下(g)至(j)中任一项(g) 一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列中10个以下的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(h) 一种多核苷酸，其含有编码具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有90%以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(i) 一种多核苷酸，其含有与序列号3或5表示的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或者(j) 一种多核苷酸，其含有与编码序列号4或6表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。在上述(1)及O)的多核苷酸中，对木脂体的葡萄糖基转移活性，包括例如对双并四氢呋喃型木脂体的葡萄糖基转移酶活性，更加具体地说，对双并四氢呋喃型木脂体的4 位及/或4'位的羟基的葡萄糖基转移酶活性。在此，所述双并四氢呋喃型木脂体包括，例如下述结构式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂体。
权利要求
1.一种多核苷酸，其特征在于，为以下(a) (f)中任一项所述的多核苷酸(a)一种多核苷酸，其含有由序列号3或5表示的碱基序列组成的多核苷酸；(b)一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；(c)一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列中1 15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(d)一种多核苷酸，其含有编码具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(e)一种多核苷酸，其含有与序列号3或5表示的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或者(f)一种多核苷酸，其含有与编码序列号4或6表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，为以下(g) (j)中任一项所述的多核苷酸(g)一种多核苷酸，其含有编码由序列号4或6表示的氨基酸序列中10个以下的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(h)一种多核苷酸，其含有编码具有与序列号4或6表示的氨基酸序列有90%以上同源性的氨基酸序列、且具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；(i)一种多核苷酸，其含有与序列号3或5表示的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸；或者(j) 一种多核苷酸，其含有与编码序列号4或6表示的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性的蛋白质的多核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述针对木脂体的葡萄糖基转移酶活性为针对双并四氢呋喃型木脂体的葡萄糖基转移酶活性。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述针对双并四氢呋喃型木脂体的葡萄糖基转移酶活性为针对双并四氢呋喃型木脂体的4位及/或4'位的羟基的葡萄糖基转移酶活性。
5.根据权利要求3或4所述的多核苷酸，其特征在于，所述双并四氢呋喃型木脂体为下述结构式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂体
6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有由序列号3或5表示的碱基序列组成的多核苷酸。
7.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有编码由序列号4或 6表示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为DNA。
9.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由权利要求1 8中任一项所述的多核苷酸编码。
10.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1 8中任一项所述的多核苷酸。
11.一种转化体，其特征在于，其中导入了权利要求1 8中任一项所述的多核苷酸。
12.—种转化体，其特征在于，其中导入了权利要求10所述的载体。
13.—种制造权利要求9所述的蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求11或12所述的转化体。
14.一种制造葡萄糖糖苷的方法，其特征在于，所述方法包括以权利要求9所述的蛋白质为催化剂，由UDP-葡萄糖和糖基受体底物生成葡萄糖苷。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述糖基受体底物为双并四氢呋喃型木脂体。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述双并四氢呋喃型木脂体为下述结构式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂体
全文摘要
本发明提供编码双并四氢呋喃型木脂体4位特异性葡萄糖基转移酶的多核苷酸等。所述多核苷酸含有包含序列号3或5表示的碱基序列的多核苷酸或编码包含序列号4或6表示的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。
文档编号C12N1/15GK102428181SQ20108002199
公开日2012年4月25日 申请日期2010年5月18日 优先权日2009年5月19日
发明者佐竹炎, 小野荣一郎, 金贤仲 申请人:三得利控股株式会社