专利名称：用于防治植物病原性真菌的生物杀真菌剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及真菌毒性细菌(特别是普城沙雷菌(Serratia plymuthica) CCGG2742野生型菌株)及其分泌的真菌毒性分子，其作为植物病原性真菌(特别是在收获前后导致果实灰腐的灰霉菌(Botrytis cinerea)真菌)的生物防治剂。该细菌可在收获前后以活菌形式使用，这是因为其是一种对动植物均不显示致病性的野生腐生微生物。同时，也可以使用所分泌分子的浓缩物或者单独使用纯的真菌毒性分子制剂。发明概述本发明提供了表征为普城沙雷菌CCGG2742的野生型细菌菌株及其作为生物杀真菌剂的用途。所述细菌菌株已保藏于西班牙瓦伦西亚大学的西班牙典型培养物保藏中心(Coleccion Espafiolade Cultivos Tipo，CECT))。国际保藏机构指定的登录号为CECT7404 (参见所附文件)。这种源自智利的野生型细菌从葡萄皮中分离出来，并具有杀死 植物病原性真菌灰霉菌之不同分离株和野生型菌株的能力。该细菌的杀真菌能力是由于其 分泌真菌毒性分子所致，所述真菌毒性分子与真菌相互作用、破坏真菌并因此抑制分生孢子萌发以及真菌菌丝体增殖。许多目前使用的生物杀真菌剂对于人和植物具有潜在的致病性。相反，普城沙雷菌CCGG2742对于植物或果实不具有致病性也不具有毒性，并且还发现其对于动物和人也不具有致病性。实验室研究表明，在仅含有I. 5% (重量/体积)琼脂(用以维持适当水平的湿度)的培养皿中，在20°C接种7天后观察，发现将其接种到豆类和葡萄植物叶子中不会造成这些宿主任何可见的变化。以同样的方式，当将高水平的细菌菌株接种物(2 X IO10Cfu (菌落形成单位)/葡萄衆果)加至健康或有伤口的葡萄中，在如上述同样的条件下接种7天后未观察到任何影响。目前的细菌生物杀真菌剂存在的另一个问题是其在需要保护免受植物病原性真菌侵害的植物和果实表面的存活时间短。实验室研究表明，将CCGG2742菌株以IO6 108cfU/cm2剂量接种于葡萄上，在果皮表面达到IO3 105cfU/cm2的水平，并且如果葡萄有伤口，则菌群在20°C接种24小时后生长至IO5 107cfu/cm2，当将果实保存在4°C，则维持同样的水平达5 7天，保护免受灰霉菌的感染。本发明的生物学试剂对应于从田间(一般在葡萄皮上)分离的并且已通过生物化学、微生物学，电子显微镜和16S rDNA测序技术鉴定的野生细菌。普城沙雷菌CCGG2742是源于智利的菌株，其对应于腐生生物，对动植物无致病性，因此其活细胞适于用作抗灰霉菌的生物杀真菌剂。此外，本发明涉及含有所述细菌菌株或含有所述细菌菌株之提取物的组合物，或者涉及含有从其衍生之化合物(例如，所述细菌菌株分泌的真菌毒性分子)的溶液或混合物，所有这些都能够保护植物及其果实在收获前后期间免受植物病原性微生物的侵害。本发明还包括从野生型菌株衍生的、具有基本相同之特征的突变体。同样地，本发明涉及获得所述细菌菌株或其衍生物的方法，并且涉及其在保护植物(尤其是果实)中的应用。
此外，本发明提供了使用纯的普城沙雷菌CCGG2742细菌菌株防治植物中真菌病害的制剂。使用该细菌作为化学合成之杀真菌剂的天然替代物，从而为实现植物病原性真菌病害的防治或消除确保了更安全的环境。最后，本发明提供了含有生物学活性之合适形式和量的所述细菌菌株的组合物。该混合物含有能够使细菌粘附到其所接种之植物上的无毒试剂、植物营养物和防腐剂。该混合物以液体悬液或冻干粉末的形式存在。
背景技术：
由植物病原性真菌导致的病害被认为是世界范围内最有害且传播较广的病害。目前，这些病害的防治主要基于化学杀真菌剂的使用。由于缺乏有效的和环境更安全的替代物，尽管化学杀真菌剂对于植物和操作者和/或在喷洒区域工作的人具有高毒性，并且其几乎不被生物所降解，但是因为其对抗真菌病害相对有效的活性所以仍在大量使用。
灰霉菌是一种感染很多重要经济作物品种(包括果树、观赏植物和蔬菜)的植物病原性真菌。该真菌导致称为“灰霉病”的病害，造成草莓、覆盆子、苹果、梨、栗子、猕猴桃和葡萄等收获前后的主要问题。在葡萄中该真菌导致葡萄腐烂病(pudrici0n delracimo)，这被认为是目前在智利的水果出口市场上影响生产水平的最严重病害之一，因为其不仅在田间而且在储存和运输过程中均可造成巨大的损失(van Kan J. A. 2006.Licensed to kill the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen，Trends PlantSci. 11，247-253 ;Elad，Y. ,Williamson,B.，Tudzynski，P.和DeIen，N.编· 2007. Botrytis Biology, Pathology and Control. The Netherlands Kluwer Academic Publishers)。目前，这种重要的植物病原菌的防治主要通过化学杀真菌剂来实现。但是，在过去几年中，已描述了一些具有抗灰霉菌之抗真菌活性的微生物。一些最有前景的实例有Serenade⑩ 其活性原理是称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QST 713的细菌，其由加州戴维新的AgraQuest Inc,公司在菜园土壤样本中发现。这种杀真菌剂在多个国家(包括智利)注册。其具有低毒性，并且其作为商品在美国用于病害(例如粉孢子(葡萄白粉菌(Uncinula necator)),灰霉菌导致的灰腐和葡萄中的酸腐)防治。美国专利No. 5,869，038 描述了突光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、液化沙雷菌(Serratia Iiquefaciens)、普城沙雷菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)和多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)的细菌分离株,其有效地抑制导致白菜收获后病害的灰霉菌和甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)真菌的发生。该专利所述的普城沙雷菌对应于菌株CL43，其不同于本发明中的细菌菌株，并且为了具有合适的抑制真菌发生的效果，其通常与先前提及的细菌混合使用。相反，细菌菌株CCGG2742作为纯培养物，有效地抑制灰霉菌，并且不必为了用作杀真菌剂而与其它细菌混合。美国专利No. 6，004, 774公开了抑制致病性植物真菌和细菌发生的枯草芽孢杆菌菌株，并描述了治疗或保护植物免受真菌和细菌感染的方法。美国专利No. 6，077，506涉及一种新的显示广谱抗真菌和抗细菌能力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细菌菌株。此外还描述了使用该苏云金芽孢杆菌细菌菌株或其产生的抗生素防治广谱的植物病原性细菌和真菌。WO 00/57706公开了成团泛菌(Pantoea agglomerans)细菌菌株基本上纯的生物培养物，其用作生物防治造成果实腐烂之真菌的拮抗剂。这些拮抗剂具有非常高的效力，并且与那些最常使用的合成抗真菌剂相当。该拮抗剂有效地对抗由灰霉菌、指状青霉菌(Penicillimn digitatum)、扩展青霉菌(Penicillium expansum)、意大利青霉菌(Penicillium i tali cum)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)导致的腐烂。WO 02/072795公开了一组细菌，其为抗御植物病原性真菌和细菌的拮抗剂。这些分离的细菌有多粘芽孢杆菌、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、普城沙雷菌、和枯草芽孢杆菌菌种。在该情形中，所述细菌菌株普城沙雷菌VKPM B-7957也不同于本发明的细菌菌株，因为当作为纯培养物使用时，此细菌抗植物病原性真菌的效力很低，并且其必须与其它具有杀真菌活性的细菌混合使用以增强其效果。WO 03/000051 公开了一种地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)细菌菌株SB3086的生物学纯培养物用作生物杀真菌剂。将活生物体用作生物防治剂具有一些局限性，例如抗植物病原体的有效范围窄，随时间不稳定，这造成活生物体在环境中的存在时间短，因而导致非常低的生物杀虫剂活性。当使用标准储存条件时，很多所使用的细菌菌株在几周内死亡，或者在田间使用典型条件(具有较高的温度和对于活跃生长之微生物有害的紫外线)下几小时内死亡。在应使用所述微生物的同样位置培养所述微生物的尝试已取得一些效果。但是，培养物污染的严重问题以及生物防治剂需在晚间施用(以防紫外线和温度影响)的需要使系统复杂，并且造价昂贵。这表明目前尚没有设计出能够抑制真菌病害造成之植物损害的有效的且环境友好的生物防治方法，因此，减少目前大量使用的合成化学杀真菌剂的使用向科学家提出了巨大的挑战，也是农业的巨大需求。因此，本发明的一个目的是提供具有生物杀真菌活性的有效的、环境安全的生物学试剂，用于防治由植物病原性真菌和微生物(特别是灰霉菌)造成的植物病害。
图I是普城沙雷菌CCGG2742细胞的扫描电镜照片。左下角的短线表示I μ m。图2是普城沙雷菌CCGG2742的显微镜照片。用1%磷钨酸钾进行负染。图3是普城沙雷菌CCGG2742超薄切片的显微镜照片。图4示意普城沙雷菌CCGG2742在不同温度下的生长图示。图5示意普城沙雷菌CCGG2742在不同pH值缓冲的培养基中的生长图示。图6显示生物杀真菌剂细菌对灰霉菌菌丝体的作用。图7显示普城沙雷菌CCGG2742的16S rDNA的部分核苷酸序列。图8显示作为生物防治剂的细菌于20°C在果实中孵育的效果。图9显示作为生物防治剂的细菌于4°C在果实中孵育的效果。发明详述所述细菌菌株CCGG2742对应于普城沙雷菌菌种。通过微生物测定和生化测定得出的其特征示于表I、2和3中。其在Luria Bertani (LB)琼脂中以及在补充有麦芽提取物(20g/L)的琼脂中产生无色/白色菌落，无色素沉着。
表I.普城沙雷菌CCGG2742的形态学和生理学特征
权利要求
1.普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)细菌菌株，其中所述细菌菌株是CCGG2742，其由国际保藏机构西班牙瓦伦西亚大学西班牙典型培养物保藏中心(Colecci0n Espanolade Cultivos Tipo, CECT))指定的登录号为 7404。
2.生物杀真菌剂组合物，其包含权利要求I的细菌菌株或从其衍生的具有同样生物学特性的活性提取物以及农业可接受的载体。
3.根据权利要求2的生物杀真菌剂组合物，当将所述细菌菌株以IO6 IO8Cfu(菌落形成单位)/cm2剂量接种葡萄时，其存活为IO3 105cfU/cm2。
4.根据权利要求2的生物杀真菌剂组合物，其在4°C 40°C温度范围内生长。
5.根据权利要求2的生物杀真菌剂组合物，其在pH3 10的范围内生长。
6.根据权利要求2 5中任一项的生物杀真菌剂组合物用于防治由植物病原性真菌在植物或果实中造成之真菌感染的用途。
7.根据权利要求6的用途，其中所述植物病原性真菌属于灰霉菌属(Botrytis)。
8.根据权利要求7的用途，其中IO5 108cfu/mL的有效剂量的细菌菌株CCGG2742或从其衍生的提取物用于防治灰霉菌Ootrytis cinerea)。
9.根据权利要求6 8的用途，其用于保护收获前或收获后状态、储存、运输和保存期间的果实。
10.防止果实腐烂的方法，其中向所述果实喷洒权利要求2的生物杀真菌剂组合物。
11.根据权利要求10的方法，其中通过喷洒液体培养物或用水溶液悬浮的冻干粉末来施加所述生物杀真菌剂组合物。
全文摘要
本发明涉及一种生物杀真菌剂组合物，其来自从葡萄皮获得的智利细菌分离株(对应于普城沙雷菌(Serratia plymuthica)CCGG2742)的生物学纯培养物，其用作防治真菌植物病害(尤其是果实易被灰霉菌(Botrytis cinerea)感染)的环境友好型生物防治剂，有效抑制所述植物病原性真菌的分生孢子萌发和菌丝体增殖。所述生物杀真菌剂组合物还保护植物叶子和果实免受所述真菌的感染，并且可以潜在地用于其它植物病原性真菌和微生物的生物防治中。
文档编号C12R1/425GK102884173SQ201080025988
公开日2013年1月16日 申请日期2010年6月16日 优先权日2009年4月16日
发明者安东尼奥·卡斯蒂略纳拉 申请人:智利圣地亚哥大学