利用小麦麦糠的β－葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及液体培养基的制作方法

专利名称：利用小麦麦糠的β－葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及液体培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及同时高效生产β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及对制造这两种酶有用的液体培养基。
背景技术：
近年来，为了有效利用纤维素资源，人们探索了有效分解纤维素的方法。人们已经了解到自然界中的纤维素主要是被微生物分解的，细菌和丝状菌等各种各样的微生物生产纤维素分解酶。这些微生物将纤维素分解酶分泌到菌体外，纤维素经该酶作用后，主要经纤维低聚糖、纤维二糖，被分解为葡萄糖。纤维素分解酶一般称为纤维素酶。在人工制造纤维素酶时，作为分泌纤维素酶的微生物已知有木霉属的微生物，并被广泛利用。而且，也已经知道利用含有碳源和氮源等营养素的培养基培养属于木霉属的微生物，可使其分泌纤维素酶的方法。然而，以前用于制造纤维素酶的方法，作为碳源能够使用的材料以及前处理方法都受到限制，高价的结晶纤维素，或者假定即使为价格便宜的纤维素资源，也要进行加热处理或碱处理等前处理，所以需要的成本都比较高。例如，专利文献1报道了将废纸于硫酸亚铁溶液中蒸煮，可接种纤维素酶生产菌生产纤维素酶用的底物。另外，专利文献2报道了将微粉碎的甘蔗渣于氢氧化钠中蒸煮，然后再用次氯酸盐溶液处理，作为可接种纤维素酶生产菌的里氏木霉(Trichoderma reesei) 的生产纤维素酶用底物的制造方法。然而，利用这些以往方法得到的纤维素酶主要含β -葡聚糖酶，而木聚糖酶活性低，对于像甘蔗渣和稻秸等那样的含木聚糖的纤维素资源的分解能力差。因此，对于目的是有效利用天然存在的各种各样的纤维素资源来说效率低。专利文献3报道了包括对属于里氏木霉的变异株进行液体培养，对得到的纤维素酶进行提取的工序在内的纤维素酶的制造方法。作为培养基的碳源，罗列了纤维素粉末、纤维二糖、滤纸、一般纸类、锯末、麦糠、稻壳、甘蔗渣、大豆粕、咖啡粕等化学构造和性质不同的各种材料(第0011段落)。然而，其中培养操作实际使用的材料只是纤维二糖(实施例1)和微晶纤维素(实施例幻，至于其他材料，即天然纤维素材料没有证实纤维素酶的生成。专利文献4报道了使用除去了固体构成成分、进行非挥发成分的浓缩、对浓缩物进行高压釜处理等予处理的黑麦稀乙醇蒸馏废液，对属于木霉属的微生物进行培养，制造木聚糖酶的方法。然而，由于本技术中作为碳源使用的黑麦获得困难，还必须进行复杂的前处理，需要高成本，另外，使用该方法反倒使β-葡聚糖酶的产量降低了。此外，小麦麦糠是将小麦制成面粉时剩下的小麦表皮(外皮)。小麦麦糠含食物纤维很多，除了用于谷物食品等食用外，还被用作日本酒酿造时培养粬菌用的个体培养基。另外，小麦麦糠还被用作以制造酶为目的、培养微生物所使用的液体培养基的原料。例如，专利文献5报道了作为液体培养基的碳源，使用了木聚糖、含有木聚糖的小麦麦糠、纸浆、甘蔗渣、玉米纤维、稻秸等农产业废弃物或植物纤维等。然而，在本技术中，培养的微生物是属于芽孢杆菌属的微生物。而且生成的酶是木聚糖酶，没有证实有β-葡聚糖酶的生成。就是说，使用属于木霉属的微生物，利用小麦麦糠作为用于同时高效生产β -葡聚糖酶和木聚糖酶的培养基到目前为止还为人所不知。专利文献1 日本特开2003-137901专利文献2 日本特公平5-33984号公报专利文献3 日本特开平9-163980号公报专利文献4 日本特开平11-113568号公报专利文献5 日本特开2004-12125
发明内容
发明要解决的课题本发明正是要解决上述以往问题的发明，发明的目的就在于以低成本制造对含有木聚糖的纤维素资源具有优良分解能力的纤维素酶。解决课题的手段本发明人等为了同时高效生产β -葡聚糖酶和木聚糖酶，对能够分解(糖化)纤维素原料的酶的制造方法以及该酶的制造进行了不断的锐意研究，结果发现通过使用(a) 小麦麦糠和(b)氨态氮或氨基态氮作为液体培养基的原料，对属于木霉属的微生物进行培养，可同时高效生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及对制造该酶有用的液体培养基。本发明提供一种β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有(a)小麦麦糠作为碳源、和(b)氨态氮或氨基态氮作为氮源的液体培养基，对属于木霉属的微生物进行培养的工序。在一实施方式中，上述液体培养基中的小麦麦糠浓度为3% W/V以上。在一实施方式中，上述液体培养基中的小麦麦糠浓度为4 15% W/V。在一实施方式中，上述液体培养基中的氨态氮或氨基态氮浓度为30 660mM。在一实施方式中，上述液体培养基中的氨态氮或氨基态氮浓度为40 580mM。在一实施方式中，上述属于木霉属的微生物是里氏木霉。在一实施方式中，在培养的过程中对上述液体培养基追加碳源。另外，本发明提供一种用于培养属于木霉属的微生物的液体培养基，其含有(a) 小麦麦糠作为碳源和(b)氨态氮或氨基态氮作为氮源。在一实施方式中，含有2% W/V以上的上述小麦麦糠。在一实施方式中，含有30 660mM的氨态氮或氨基态氮。另外，本发明提供通过上述任一形式所述方法制造的β -葡聚糖酶和木聚糖酶。另外，本发明提供一种以使用上述葡聚糖酶和木聚糖酶为特征的对纤维素资源进行分解或糖化的方法。发明的效果本发明由于有效利用了小麦麦糠，使食品产业废弃物減少，有益于环境问题的解决。另外，由于可同时高效生产作为纤维素分解酶的葡聚糖酶和木聚糖酶，对于甘蔗渣和稻秸等天然纤维素资源的糖化极其有用。特别是对由纤维素资源制造酒精的生物量乙醇制造有用。


图1是表示小麦麦糠为5%的培养基中的、相对于硫酸铵浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图2是表示小麦麦糠为5%的培养基中的、相对于氯化铵浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图3是表示小麦麦糠为5%的培养基中的、相对于磷酸氢二铵浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图4是表示小麦麦糠为5%的培养基中的、相对于亮氨酸浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图5是表示小麦麦糠为5%的培养基中的、相对于尿素浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图6是表示硫酸铵为480mM的培养基中的、相对于小麦麦糠浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图7是表示结晶纤维素为的培养基中的、相对于硫酸铵浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图8是表示硫酸铵浓度为160mM的培养基中的、相对于结晶纤维素浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图9是表示小麦麦糠为的培养基中的、相对于硫酸铵浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图10是表示小麦麦糠为5%的培养基中的、相对于硫酸铵浓度的培养上清液的酶活性变化的图。图11是分别使用实施例1得到的小麦麦糠为5%的培养基以及参考例2得到的结晶纤维素为的培养基的上清液对啤酒粕糖化时，对生成的葡萄糖浓度进行比较的图。图12是分别使用实施例1得到的小麦麦糠为5%的培养基以及参考例2得到的结晶纤维素为的培养基的上清液对稻秸糖化时，对生成的葡萄糖浓度进行比较的图。
具体实施例方式液体培养基本发明的液体培养基含有生产纤维素分解酶的微生物成长所需的营养，例如属于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、顶孢霉属(Acremonium)、分枝孢属 (Sporotrichum)、青霉属(Penicillium)、碟节菌属(Talaromyces)、腐质霉属(Humicola)、 Neocallimastix属、嗜热真菌属(Thermomyces属)或梭菌属(Clostridium)、链霉属(Streptomyces)的微生物。这样的液体培养基是以将以下给出的培养基组成溶解或悬浮于IOOml水后的液体培养基(一般称为Mandel培养基)为基础调配的，一般来说是含有作为介质的水、作为碳源的小麦麦糠、和作为氮源的氨态氮或氨基态氮的培养基。以下给出了一例优选的培养基组成。培养基组成含有小麦麦糠5g、(NH4)2SO4:0. 14g、KH2PO4 :1. 5g、CaCl2 · 2H20 :0. 03g、 MgSO4 · 7H20 :0. 03g、玉米浸渍液(corn steep liquor) Jml、吐温 80 :0. lml、微量元素液 (H3BO4 6mg、(NH4)6MO7Om · 4H20 26mg、FeCl3 · 6H20 lOOmg、CuSO4 · 5H20 40mg、MnCl2 · 4H20 8mg、ZnSO4 · 7H20 200mg溶液):0. 1ml、水:100ml (用磷酸或氢氧化钠将PH调整为4. 8)所谓小麦麦糠指的是小麦的外皮和胚芽的混合物。而从小麦去除小麦麦糠(即外皮和胚芽)后精细加工后的产物是小麦面粉。小麦麦糠作为例如工业上获得食用小麦粉的制造面粉工序的副产物而大量产生，很容易得到。而这样的小麦麦糠由于是制造食品的副产物，所以都严格进行原料阶段的品质检查以及制造工序管理，卫生品质上非常安全，优选用于本发明的方法中。用于制备小麦麦糠的小麦的种类没有特别限定，如北进(*々ν >，Hokushin), 福清(么< 々力、Fukusayaka)、农林61号、南部小麦(f > 7·· 二 Λ年，Nanbukomugi)、北之香(今夕乂力才1J , Kitanokaori)、春富(‘、卟二夕力，haruyutaka)、春之恋(春忑恋)寸。一般小麦麦糠的粒子形状为薄片状。薄片状的小麦麦糠可原样使用。也可以将它们适当粉碎、使粒子细化后使用，还可以造粒形成粒子块后使用。小麦麦糠的形态，可以是例如、大的麦糠、小的麦糠、末粉等。也可以使用食品原料以及作为健康食品等市场上销售的产品。在小麦麦糠导入液体培养基时也可进行前处理。优选的前处理，例如为粉碎处理和脱木质素处理。如果从小麦麦糠除去木质素，则坚固的细胞壁崩解，使得纤维素的利用变得更容易，酶的生产也变得容易。另外通过对小麦麦糠进行粉碎处理，可以更有效地进行脱木质素处理。脱木质素处理的方法虽然没有特别限定，例如可举出在像氢氧化钠那样的强碱性物质存在下，或者在像硫酸或磷酸那样的强酸性物质存在下，高温加热，使其分解的方法； 通过微生物使其分解的方法；在高温·高压下通过水热处理使其分解的方法。如果考虑到处理设备、对环境的负荷，优选高温·高压下通过水热处理使其分解的方法。另外，还可以进一步进行通过加热杀菌等对液体培养基的原料通常进行的前处理。液体培养基中的小麦麦糠浓度优选为3% W/V以上。如果小麦麦糠的浓度低于3% W/V，则纤维素酶、特别是β-葡聚糖酶的产量有时增大量不大。液体培养基中的小麦麦糠浓度更优选为4% W/V以上，进一步优选为5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上、8% W/ V以上。液体培养基中的小麦麦糠浓度越高越好。即，其上限限制于能够对液体培养基进行搅拌混合的量。因为如果液体培养基不能搅拌，微生物就不能均一地混合在液体培养基
6中，培养就不能正常进行。液体培养基中小麦麦糠浓度的上限根据搅拌设备的性能，可以为20、15、10或8% W/V。一般来说，上述浓度的优选范围为4 15% W/V，更优选的范围为 5 10% W/V。所谓氨态氮指的是氨或由氨衍生的铵盐中含有的氮。而所谓的氨基态氮指的是胺或由胺衍生的氨基化合物中含有的氮。含有氨态氮或氨基态氮的化合物，例如、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵、氨水、尿素、氨基酸及其盐(例如、亮氨酸、谷氨酸钠)。其中，作为氮源，特别适用于本发明的液体培养基的化合物是硫酸铵。其理由是价格低，而且很容易得到。液体培养基中氨态氮或氨基态氮的浓度，作为铵的摩尔数，为30 660mM。优选 40 580mM。如果浓度低于30mM，则纤维素酶、特别是β -葡聚糖酶的产量有时增大量不大。 另外，该浓度如果超过660mM，则酶的生产率将降低。另外，液体培养基中氨态氮或氨基态氮的浓度优选地根据液体培养基中的小麦麦糠的浓度进行增减，例如，小麦麦糠的浓度为3% W/V时，如果考虑到成本等，优选50mM。
_7] β -本发明中使用的属于木霉属的微生物只要是能生产纤维素糖化所必需的纤维素酶，没有特别限定。优选的属于木霉属微生物是木霉属丝状菌，具体的如里氏木霉 (Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)。从同时高效生产β -葡聚糖酶和木聚糖酶观点看，特别优选里氏木霉。里氏木霉和绿色木霉的菌学性质例如在Ε. G. Simmons, Abst. 2ndInternational Mycological Congress (美国福罗里达州Tampa，1077年8月)618页中有报道。液体培养使用通常的通气搅拌培养设备，使用上述液体培养基，培养温度为20 330C，优选观 30°C，培养pH为4 6，进行4 10天培养。在从培养最初就使用上述液体培养基的情况下，液体培养基中含有的成分(例如、碳源和氮源)的浓度相当于本发明的培养方法中上述成分的初期浓度。培养过程中也可向液体培养基中追加碳源。由于随着培养进行，培养基中的小麦麦糠被分解，有时通过补充碳源可以提高纤维素酶的生成效率。追加的碳源优选含天然纤维素，而淀粉等营养成分少的材料。追加的优选碳源为小麦麦糠、啤酒粕、麦茶抽提粕、纸、 果实的渣饼(特别是苹果渣饼)等。追加碳源时，追加的方式可以是连续式的，也可以是间歇式的，可以对追加的时期和量进行调节，以使得追加后还能搅拌混合。追加碳源时，在培养过程中也可以根据需要适当追加氨态氮或氨基态氮。然后可根据需要，通过离心分离、过滤等众所周知的方法从该培养液中除去菌体， 得到木霉属丝状菌培养上清液。在木霉属丝状菌培养液或培养上清液中含有目标的高浓度的纤维素酶、即β-葡聚糖酶和木聚糖酶。得到的培养液或培养上清液的β -葡聚糖酶活性在30U/ml以上，优选为50U/ml 以上，更优选为60U/ml以上，进一步优选在70U/ml以上。而该培养液或培养上清液的木聚糖酶活性在25U/ml以上，优选在30U/ml以上，更优选在40U/ml以上，更优选在50U/ml以上。培养液或培养上清液的葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性中的任一个如果低于上述下限，对于目的是有效利用天然存在的各种各样纤维素资源的效果就要降低。
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另外，上述半纤维素酶活性可以通过以来自“oat spelts”的木聚糖为底物的酶加水分解后生成的还原糖与DNS反应，通过MOnm的吸光度的增加量进行定量。更具体来说，在1. 9ml的木聚糖底物溶液(将Sigma公司生产的“Xylan，from oat spelts”溶解在200mM醋酸缓冲液(pH4. 5))中加入0. Iml培养液或培养上清液，然后于40°C下准确进行10分钟酶反应后，加^ilDNS试剂(含0. 75%二硝基水杨酸、1. 2%氢氧化钠、22. 5%酒石酸钠钾4水和物、0. 3%乳糖1水和物)，进行充分混合，停止反应。为了对反应停止液中的还原糖量进行定量，将反应停止液于沸腾水浴中准确加热15分钟。然后冷却到室温后，通过测定540nm的吸光度以相当于木糖的还原糖量进行定量。1单位的半纤维素酶活性以于40°C下反应10分钟的条件下，1分钟生成相当于1 μ mol木糖的还原糖的酶量表不。本发明中所谓的“对属于木霉属的微生物进行培养”指的是像技术常识那样对该微生物进行培养的操作。即，在以制造葡聚糖酶和木聚糖酶为目的进行液体培养的方法中，只要至少存在在上述本发明的液体培养基中培养属于木霉属微生物的过程，该培养方法就属于本发明的方法。—旦进行培养，液体培养基的营养由于属于木霉属微生物的消費将減少。因此，在培养末期，也许培养基中的碳源和氮源的浓度达不到规定的浓度，结果是在不属于本发明的液体培养基的培养基中培养属于木霉属的微生物。即便在这样场合，例如在开始培养的时刻，使用的液体培养基属于含有规定浓度的碳源和氮源的本发明液体培养基，由于至少在培养初期，属于木霉属的微生物是在本发明的液体培养基中培养的，所以该培养方法当然也属于本发明方法。另外，在像上述那样从培养的开始时刻大量含有碳源的情况下，如上所述，考虑到对液体培养基进行搅拌混合时的方便性，最好是将小麦麦糠浓度的上限限制在某一程度。相反，在培养初期，即使培养基中的碳源或氮源浓度比规定的浓度低，用不属于本发明的液体培养基的培养基进行培养，例如此后再追加，使培养基中的碳源或氮源浓度达到规定浓度以上时，由于此后属于木霉属的微生物是在本发明的液体培养基中培养的，所以该培养方法属于本发明的方法。纤维素资源的分解或糖化方法通过本发明的方法得到的β -葡聚糖酶和木聚糖酶可用于对纤维素资源进行分解或糖化。这里所说的纤维素资源可为合成纤维素或天然纤维素资源的任一种。所谓合成纤维素表示作为纤维素粉末已经流通的材料。所谓天然纤维素资源指的是如甘蔗渣、稻秸、 麦秸、啤酒粕、木材等。本发明由于可以同时高效生产葡聚糖酶和木聚糖酶，所以特别适于对甘蔗渣、稻秸、麦秸、啤酒粕等天然纤维素资源的糖化。纤维素资源的分解或糖化方法只要是使用众所周知的方法就可以，没有特别限制，举一例子，如使作为底物的纤维素资源悬浮于水性溶剂中，添加上述培养液或培养上清液，一边搅拌或震荡，一边加温，进行糖化反应的方法。也可以替代显示纤维素分解活性的上述培养液或培养上清液，使用其干燥物、或将干燥物分散或溶解于水后的溶液。纤维素原料最好是预先进行脱木质素。悬浮方法、搅拌方法、上述混合液的添加方法、添加顺序、它们的浓度等反应条件可以按照能够以更高收率获得葡萄糖的方式进行适当调整。
此时的反应液的pH和温度只要是处于不使酶失活的范围内就可以，一般来说，在常压下进行反应时，温度可设定在30 70°C、pH可为3 7的范围。另外，对于该压力、温度、PH也可以像上述那样，可以按照能够更高收率获得葡萄糖的方式进行适当调整，优选地在常压下，在醋酸或磷酸缓冲液中，温度50 60°C、pH4 6的范围下进行。反应时间一般为6 147小时、优选M 72小时。通过纤维素的糖化，可以得到含有葡萄糖的水溶液。得到的水溶液可以根据需要， 实施脱色、脱盐、除酶等精制处理。精制方法只要是众所周知的方法没有特别的限制，例如， 可以使用活性炭处理、离子交换树脂处理、色谱分析处理、精密过滤、超滤、反渗透过滤等过滤处理、晶析处理等，可以单独使用这些处理方法，也可以使用2种以上处理方式组合。通过上述方法精制了的葡萄糖为主要成分的水溶液可以直接使用，也可以根据需要，通过干燥使其固化。干燥方法只要是众所周知的方法，没有特别限制，例如，可以使用喷雾干燥、冷冻干燥、鼓式干燥、薄膜干燥、板式干燥、气流干燥、真空干燥等，可以单独使用这些方法，也可以使用2种以上处理方式组合。实施例以下通过实施例对本发明进行更具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例1对小麦麦糠(昭和产业社生产)进行粉碎处理，于0. 3N氢氧化钠水溶液中在 121°C下通过15分钟的高压釜处理除去木质素，充分水洗后，使其干燥。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在下培养 7天，使孢子充分形成。将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为经脱木质素处理的5%小麦麦糠(5g/100mL)，另外按照作为氮源的硫酸铵的氨基态氮的摩尔浓度分别达到 15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、IOOmM或115mM的方式进行添加，然后将pH用磷酸或氢氧化钠调整到4. 8的IOOmM液体培养基置于带挡板的500mL容量三角烧瓶中备用。将培养的里氏木霉1白金圈接种于该液体培养基，于^°C、ISOrpm下震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，测定上清液的β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。(酶活性的测定)对上述得到的培养液进行酶活性测定。β -葡聚糖酶活性，使用Mega-Zyme公司生产的β -葡聚糖酶测定试剂盒，通过对以色素标记的葡聚糖为底物进行酶分解生成的染色片段进行吸光度测定。具体来说， 向0. ImL偶氮大麦葡聚糖底物溶液中加入0. ImL培养液，于40°C下准确进行10分钟酶反应后，加0. 6mL停止液〔(pH5)含有4%醋酸钠、0. 4%醋酸锌、80%甲氧基乙醇〕，然后放置5 钟，停止反应。然后离心分离后，对上清液测定590nm的吸光度。1单位的β -葡聚糖酶活性以在40°C、反应10分钟条件下，1分钟内生成的相当于1 μ mol葡萄糖的还原糖的酶量表
7J\ ο而木聚糖酶活性，通过以来自“oat spelts”的木聚糖作为底物的酶加水分解生成的还原糖与DNS反应，通过MOnm吸光度的增加值进行定量。更具体来说，向1. 9ml的
木聚糖底物溶液[将Sigma公司生产的“Xylan，from oat spelts”溶解于200mM醋酸缓冲液(PH4. 5)]中加入0. ImL培养液，于40°C下准确进行10分钟酶反应后，加入4mLDNS试剂 (含有0. 75%二硝基水杨酸、1. 2%氢氧化钠、22. 5%酒石酸钠钾4水和物、0. 3%乳糖1水和物)充分混合，使反应停止。为了对反应停止液中含有的还原糖量进行定量，将反应停止液于沸腾水浴中准确加热15分钟。然后冷却至室温后，通过测定540nm的吸光度，以相当于木糖的还原糖量进行定量。1单位的木聚糖酶活性表示为于40°C、10分钟的反应条件下， 1分钟内生成相当于Iymol木糖的还原糖的酶量。结果如图1所示。实施例2将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为与实施例一样得到的脱木质素处理的5%小麦麦糠(5g/100mL)，然后将作为氮源的硫酸铵置换为氯化铵，按照氨态氮的摩尔浓度分别达到20mM、40mM、50mM、60mM、80mM、100mM或120mM的方式进行添加，像实施例1 那样准备液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于
下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于、ISOrpm下， 震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定上清液的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图2所示。实施例3将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为像实施例1那样得到的脱木质素处理的5%小麦麦糠(5g/100mL)，然后将作为氮源的硫酸铵置换为磷酸氢二铵，按照氨态氮的摩尔浓度分别达到15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mM或115mM的方式进行添力卩，与实施例1同样地准备了液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于、 ISOrpm下，震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定了 β _葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图3所示。实施例4将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为像实施例1那样得到的经脱木质素处理的5%小麦麦糠(5g/100mL)，然后将作为氮源的硫酸铵置换为亮氨酸，按照氨基态氮的摩尔浓度分别达到8福、151111、231111、311111、381111、461111或531111的方式进行添加，像实施例1那样准备了液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于、ISOrpm 下，震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图4所示。实施例5将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为像实施例1那样得到的经脱木质素处理的5%小麦麦糠(5g/100mL)，然后将作为氮源的硫酸铵置换为尿素，按照氨基态氮的摩尔浓度分别达到17mM、33mM、50mM、67mM、83mM或IOOmM的方式进行添加，像实施例1那样准备了液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于
下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于观！、ISOrpm下， 震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图5所示。实施例6将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为像实施例1那样得到的经脱木质素处理的小麦麦糠，按照浓度分别达到1^^2^^3^3^^5^^6%或7%的方式进行添加，而作为氮源的硫酸铵的氨态氮的摩尔浓度按照达到480mM的方式进行添加，像实施例1那样准备液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于观！、ISOrpm下， 震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图6所示。参考例1将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素的浓度设定为1 %，作为氮源的硫酸铵的氨态氮的摩尔浓度按照分别达到15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mM或115mM的方式进行添加，像实施例1那样准备了液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基， 于观！、ISOrpm下，震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图7所示。参考例2将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素的浓度按照分别达到1 %、1. 5%、2%、 2.5^^3^^3.5%或4%的方式进行添加，而作为氮源的硫酸铵的氨态氮的摩尔浓度按照达到160mM的方式进行添加，像实施例1那样准备了液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于、ISOrpm下，震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离， 像实施例1那样测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图8所示。参考例3将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为像实施例1那样得到的经脱木质素处理的小麦麦糠(lg/100mL)，作为氮源的硫酸铵的氨态氮的摩尔浓度按照分别达到 15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mM或115mM的方式进行添加，像实施例1那样准备了液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于下，培养7 天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于^°C、ISOrpm下，震荡培养7天。 在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图9所示。实施例7将作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素置换为像实施例1那样得到的经脱木质素处理的小麦麦糠(5g/100mL)，另外按照作为氮源的硫酸铵的氨态氮的摩尔浓度分别达到 330福、4201111、5001111、5801111、6601111、7201111或 8001111 的方式进行添加，像实施例 1 那样准备了液体培养基。将里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于
下，培养7天，使孢子充分形成，将其1白金圈接种于液体培养基，于、ISOrpm下， 震荡培养7天。在第7天，对培养液进行离心分离，像实施例1那样测定葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果如图10所示。实施例8使用实施例1中得到的培养上清液(5%小麦麦糠、氨态氮为IOOmM硫酸铵)以及参考例2中得到的培养上清液(1%结晶纤维素、氨态氮为IOOmM的硫酸铵)，进行纤维素原料的糖化试验。作为供糖化用的纤维素原料，准备啤酒粕和稻秸。这些纤维素原料用以下方法进行脱木质素处理。对纤维素原料进行微粉碎，然后悬浮于0. 3N的NaOH中，于120°C下处理15分钟， 用水充分洗净后，进行干燥。将由纤维素原料0.3g、培养上清液9.5ml、lM醋酸缓冲液 (pH4. 8) :0. 2ml构成的溶液(3%纤维素原料溶液)于50°C、pH4. 8下震荡48小时，进行纤维素原料的糖化，对生成的葡萄糖用Glucous CII-Test Wako (和光纯药工业)进行测定。 结果如图11和图12所示。产业上利用的可能性可同时高效生产对甘蔗渣、稻秸等天然纤维素资源的糖化非常有用的β -葡聚糖酶和木聚糖酶，可用于由纤维素资源制造乙醇的生物量乙醇制造中。
权利要求
1.一种葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有(a)小麦麦糠作为碳源、且含有(b)氨态氮或氨基态氮作为氮源的液体培养基，对属于木霉属的微生物进行培养的工序。
2.根据权利要求1中所述的葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液体培养基中的所述小麦麦糠浓度为3% W/V以上。
3.根据权利要求1或2所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液体培养基中的所述小麦麦糠浓度为4 15% W/V。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液体培养基中的所述氨态氮或氨基态氮的浓度为30 660mM。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液体培养基中的所述氨态氮或氨基态氮的浓度为40 580mM。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述属于木霉属的微生物为里氏木霉。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，在培养过程中向所述液体培养基中追加碳源。
8.一种用于培养属于木霉属的微生物的液体培养基，其含有(a)小麦麦糠作为碳源和 (b)氨态氮或氨基态氮作为氮源。
9.根据权利要求8所述的液体培养基，其特征在于，含有2%W/V以上的所述小麦麦糠。
10.根据权利要求8或9所述的液体培养基，其特征在于，含有30 660mM的氨态氮或氨基态氮。
11.一种β -葡聚糖酶和木聚糖酶，其是使用权利要求1 7中任一项所述方法制造的。
12.—种纤维素资源的分解或糖化方法，其特征在于，使用了权利要求11所述的葡聚糖酶和木聚糖酶。
全文摘要
以低成本制造对含有木聚糖的纤维素资源具有优良分解能力的纤维素酶。一种β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有(a)小麦麦糠作为碳源、和(b)氨态氮或氨基态氮作为氮源的液体培养基，对属于木霉属的微生物进行培养的工序。
文档编号C12P19/14GK102482653SQ20108003690
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月17日 优先权日2009年8月21日
发明者福田和郎 申请人:朝日集团控股株式会社